Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Авторы благодарят кафедру патологии Хопитал Европеен Джордж Помпиду и Некер (ЛаурианН Шамболле, Элоди Мишель и Гизеле Легалл); гистологическая платформа PARCC, Хопитал Европеен Джордж Помпиду (Коринн Лесаффр); Вирджиния Кларк для редактирования языка; Александра Эльбакян за ее вклад.

Протокол соответствует этическим принципам и был одобрен Комитетом по этике (Comite-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. Подготовка материалов
<ol><li>
Приготовление буфера для мытья 1x
	<ol>
<li>Подготовка 3 L 1x мыть буфер, добавив 2,94 л дистиллированной воды и одна бутылка (60...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+intact+HPV16+E6/E7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control.">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li><li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+DNA,+E6/E7+mRNA,+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li><li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HR-HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization.">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li><li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma.">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers:+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test.">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers:+a+new+challenge+for+immunologists,+pathologists+and+clinicians.">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice.">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

ВПЧ РНК CISH выполняется с приобретенным комплектом является мощным инструментом для обнаружения вирусных стенограмм и он указывает на активную инфекцию ВПЧ. Выполненные вручную, шаги протокола в целом легко следовать, и приобрел комплект удобно. Этот метод позволяет окрашивать 19 гисто...

ВПЧ РНК CISH является мощным инструментом для обнаружения активной инфекции ВПЧ, которые могут оказаться решающими в доброкачественных или злокачественных поражений в различных местах, таких как ротоглотки или шейки матки. Обнаружение активной инфекции ВПЧ может способствовать диагностике поражений, вызванных ВПЧ, и, таким образом, влиять на его лечение и прогноз.
ВПЧ является наиболее частой инфекцией, передаваемой половым путем, и более 100 вирусных генотипов были описаны1. Схематично, генотипы низкого риска, такие как генотипы 6 и 11, как известно, вызывают генитальные бородавки, рецидивирующие респираторные папилломатоз и другие доброкачественные поражения, в то время как генотипы высокого риска, такие как генотипы 16, а также 18, отвечают за большинство раковых заболеваний шейки матки и анальный рак и играют роль в ONSCC онкогенеза в переменных пропорциях, как учтивается региональными эпидемиологическими данными2.
Для выявления ВПЧ-инфекции имеется несколько инструментов. Как высокого риска ВПЧ инфекции приводит к выражению вирусных онкогенных белков E6 и E73, обнаружение E6 и E7 стенограммы широко рассматривается как золотой стандарт для активной идентификации ВПЧ инфекции4. ВПЧ РНК CISH может быть выполнена на образцах FFPE, которые довольно легко получить от пациентов, страдающих от различных заболеваний, связанных с ВПЧ. Его производительность была оценена в плоской интраэпителиальной неоплазии в шейке матки, ануса и влагалища, и в инвазивных плоскоклеточной карциномы в шейке матки, анус, и верхний аэропищеварительный тракт5: он достигает чувствительности более 98% среди ВПЧ ДНК-полимеразы цепной реакции (ПЦР) -положительных случаев. Это немного лучше, чем p16 иммуностоинга (93%) и ДНК ВПЧ на месте гибридизации (ДНК ISH: 97%), которые чаще используются. В другой когорте из 57 пациентов с плоскоклеточной карциномой (SCC), вытекающей из области головы и шеи, области половых органов, кожи и мочевыводящих путей, по сравнению с ВПЧ ДНК ISH, ВПЧ РНК CISH достигла лучшей чувствительности (100% против 88%) и специфика (87% против 74%)6.
P16 иммуностоинга является косвенным маркером, отражающим нарушение клеточного цикла, которые могут быть вызваны (но не исключительно) впч-инфекцией4,7. Этот экономически эффективный тест обладает хорошей чувствительностью и отрицательным прогностическим значением и рекомендуется в качестве суррогатного маркера инфекции ВПЧ высокого риска при раке ротоглотки (OPC) Колледжем американских патологоанатомов (CAP) и Союзом международных Борьба с раком (UICC)8.
Хотя эта статья посвящена исключительно выявлению ВПЧ в HNSCC, ВПЧ РНК CISH клинически актуальна в различных других условиях, которые связаны с ВПЧ-инфекцией. Например, этот метод может повысить точность диагностики низкосортных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки (LSIL, ранее известный как цервикальная интраэпителиальная неоплазия, класс 1 «CIN1» для морфологически неоднозначных случаев9. Что касается ротоглотки SCC, ВПЧ РНК CISH позволяет идентификации ВПЧ связанных SCC, помечены как отличие от ВПЧ-не связанных ротоглотки SCC в недавнем восьмом издании TNM классификации головы и рака шеи (Союза для международного рака Управление (UICC)10. Так как ВПЧ связанных SCC экспонатов лучший прогноз с более длительной выживаемости и повышенной лучевой терапии и химиотерапии чувствительность, чем ВПЧ-не связанных SCC11,12,13, обнаружение впч-инфекции может повлиять управление пациентом14,15. Кроме того, ВПЧ РНК CISH может быть использован для диагностики ВПЧ связанных мультифенотипической синуазальной карциномы с более высоким сигналом, чем ВПЧ ДНК CISH16. Несколько многовариантных анализов показывают, что обнаружение стенограмм E6 и E7 коррелирует с лучшим прогнозом в ротоглофалии SCC в целом7,15,17,18 и в подгруппа p16-позитивной ротоглотки SCC19,20.
Здесь мы представляем протокол для ручного ВПЧ РНК CISH выполняется на слайдах FFPE с комплектом, полученным от производителя.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

Инфекция папилломавируса человека (ВПЧ) является основным фактором риска для подтипа ортоглянского плоскоклеточного карциномы (OPSCC), который, как правило, связан с лучшим результатом, чем алкоголь и табак, связанных OPSCC. Хромогенная на месте гибридизация (CISH) вирусной РНК ВПЧ может позволить полуколичественную оценку вирусных транскриптов онкогенных белков E6 и E7 и визуализацию на месте с хорошим пространственным разрешением. Этот метод позволяет диагностировать активную инфекцию с визуализацией транскрипции ВПЧ в опухолевых ВПЧ-инфицированных клетках. Преимуществом этого метода является предотвращение загрязнения от неопластических ВПЧ-инфицированных клеток, прилегающих к опухоли. В целом, его хорошие показатели диагностики он считается золотым стандартом для активной идентификации ВПЧ-инфекции. Поскольку взаимодействие вирусного белка E6 и E7 с клеточными белками pRb и p53 является обязательным для преобразования клеток, ВПЧ РНК CISH является функционально актуальным и остро отражает активную онкогенную инфекцию ВПЧ. Этот метод является клинически актуальным, а так как "низкий" или "высокий" уровень транскрипции ВПЧ помогли определить две группы прогноза среди ВПЧ связанных p16-положительных больных раком головы и шеи. Здесь мы представляем протокол для ручного ВПЧ РНК CISH выполняется на формалин фиксированной парафина встроенных (FFPE) слайды с комплектом, полученным от производителя. Вместо хромогенного откровения, РНК на месте гибридизации также может быть выполнена с флуоресцентным откровением (РНК FISH). Он также может сочетаться с обычными иммуностоинга.

Как описано здесь, в голова и шея плоскоклеточный рак, случай может считаться положительным в присутствии коричневого точечных окрашивания в цитоплазме или в ядрах опухолевых клеток. В большинстве исследований сигнал считается либо "позитивным", либо "не обнаруженным"14. Со...

Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Вирус папилломы человека (ВПЧ) РНК-хромогенная на месте гибридизация считается одним из золотых стандартов для активного обнаружения папилломавируса вируса человека в опухолях. Это позволяет визуализировать экспрессию ВПЧ E6-E7 mRNA с локализацией и полуколичественной оценкой его сигнала.

Хромогенные На ситу Гибридизация SS инструмент для ВПЧ связанных головы и шеи диагностики рака

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

РНК ВПЧ CISH позволяет выявлять активную инфекцию вируса папилломы человека. Поскольку гибридизация на месте нацелена на РНК ВПЧ, этот метод позволяет визуализировать активную транскрипцию вируса. Он имеет точное пространственное разрешение и хорошие показатели диагностики.Обнаружение ВПЧ может поддерживать диагностику нескольких поражений, связанных с ВПЧ, таких как плоскоклеточный рак или неоплазия шейки матки. Это также может повлиять на прогноз. После подготовки буферов и контр-окрашивания реагентов, подготовить один х целевой реагент поиска в большой стакан, добавив 70 миллилитров 10x целевой реагент поиска 630 миллилитров дистиллированной воды.Поместите стакан на нагревательную пластину с магнитным мешалки и накройте его алюминиевой фольгой. Отварить его содержимое при 100 градусах по Цельсию в течение 10-15 минут, убедившись, что не варить его дольше, чем 30 минут. Чтобы блокировать активность пероксидазы на слайдах с секциями тканей, ранее депарафинизированных и помещенных в стойку слайда, добавьте четыре-шесть капель, как раз достаточно, чтобы покрыть образец, перекиси водорода к каждому слайду, и инкубировать их в течение 10 минут при комнатной температуре.Вымойте горки два раза в течение двух минут в дистиллированной воде при комнатной температуре. Чтобы разорвать РНК ткани границы в рнк ткани разделов, сначала удалить алюминиевую фольгу из кипящего один х TRR с помощью коготь, и прекратить перемешивание. Погрузите стойку слайда медленно и очень осторожно.Накройте стакан снова алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 15 минут. Используйте коготь, чтобы немедленно передать горячую стойку слайда на дистиллированную водяную ванну и мыть его в течение двух минут. Вымойте слайды затем в свежем 100%ethanol в течение двух минут, и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение двух минут.Затем используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать барьер вокруг каждого образца, и дайте ему высохнуть, по крайней мере пять минут. Для пищеварения протеазы поместите слайды в лоток, контролируемый влажностью, и добавьте приблизительно четыре капли Protease Plus на образец. Накройте лоток крышкой и вставьте его в духовку гибридизации в течение 30 минут при температуре 40 градусов по Цельсию.Выньте лоток из духовки и удалите стойку для слайдов. Работая по одной горке за раз, быстро удалите излишки жидкости и поместите горку в стойку слайда, погруженную в окрашивание тарелки, наполненной дистиллированной водой. Вымойте горки два раза в течение двух минут в дистиллированной воде при комнатной температуре с постоянным возбуждением.Чтобы начать гибридизацию, нажмите и щелкнуть слайды, чтобы удалить излишки жидкости и поместить их обратно в слайд стойку. Удалите предварительно разогретый зонд ВПЧ из духовки и добавьте примерно четыре капли, чтобы полностью покрыть каждый раздел. Накройте лоток крышкой и вставьте его в духовку на два часа при температуре 40 градусов по Цельсию.После завершения инкубации, удалить лоток из духовки и удалить слайд стойку. Один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости, и поместите слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено одним х мыть буфер, мыть горки в течение двух минут при комнатной температуре с постоянным возбуждением, и повторить со свежим х мыть буфера. Нажмите и флик, чтобы удалить излишки жидкости из слайдов, и поместите их в слайд стойку снова.Добавьте приблизительно четыре капли КОМНАТной температуры AMP1 на секцию, чтобы полностью покрыть каждый раздел. Накройте лоток крышкой и вставьте его в духовку на 30 минут при температуре 40 градусов по Цельсию. После удаления лотка из духовки снимите стойку для слайдов.Работая один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости, и поместите слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено одним х мыть буфер, мытье в течение двух минут при комнатной температуре с постоянным возбуждением, и повторить со свежим х мыть буфера. Раздай одинаковое количество капель каждого раствора DAB-A и DAB-B в трубке соответствующего размера, чтобы сделать приблизительно 120 микролитров субстрата DAB на секцию и вихря. Возьмите каждый слайд, по одному, из слайда стойки, и нажмите и Флик, чтобы удалить избыток жидкости, и поместите его обратно в слайд стойку.Pipette приблизительно 120 микролитров смеси DAB на каждой секции ткани, убедившись, что разделы покрыты. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, и приступить к counterstaining. Поместите одну каплю монтажной среды на стеклянную рейку, а затем поместите рейки на горки и дайте им высохнуть.Через несколько часов проведем оценку с помощью оптического микроскопа, описанного в рукописи. Как описано здесь в голове и шее плоскоклеточный рак, наличие коричневого punctiform окрашивания в цитоплазме или в ядрах опухолевых клеток определяется положительный случай. Результаты были разделены на два балла, РНК CISH высокий и низкий балл, как наблюдается с 20x цели.РНК CISH оценка окрашивания считается низким, когда наблюдается в менее чем 50% опухолевых клеток и охватывает менее 80% поверхности клеток. С другой стороны, РНК CISH оценка высока, когда наблюдается в более чем 50% окрашенных раковых клеток, или с окрашивания поверхности превышает 80% в более чем 30% опухолевых клеток. Никогда не следует позволять слайдам высыхать для гибридизации.Не забудьте разогреть зонд. Для каждого образца, выполнять положительный и отрицательный контроль для того, чтобы оценить качество РНК.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация (mFISH) и спектральное кариотипирование (SKY) в облученных мышей

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy как хирургический подход к местным лекарств в внутренний уши взрослых и новорожденных мышей

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...