Name: lipidomics and transcriptomics in neurological diseases
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00
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我们将本文献给Ermelinda Lomazzo博士。在手稿定稿期间，Ermelinda Lomazzo博士去世了。她是对科学的热情和无私参与团队合作的化身，以实现有意义的研究目的。她一直梦想着为人类的福祉做出有意义的贡献。她善良的天性从未受到科学和生活艰难道路的影响。她将永远无价地留在我们心中。
Julia M. Post由约翰内斯·古腾堡大学美因茨大学医学中心的转化神经科学焦点计划（FTN）资助，目前由SPP-2225 EXIT项目资助给LB.Raissa Lerner由DZHK项目81X2600250资助给LB和脂质组学核心设施。这些研究的部分资金由脂质组学核心设施，生理化学研究所和约翰内斯古腾堡大学美因茨大学医学中心的校内资金（LB）提供。

此处描述的所有实验程序均符合2010年9月22日欧洲共同体理事会指令（2010/63EU），并已获得德国莱茵兰 - 普法尔茨州当地动物委员会的批准（文件参考：23 177-07 / G16-1-075）。
1. 急性和预防性治疗KA诱导癫痫的动物模型
<ol><li>进行癫痫发作诱导、治疗和行为评分。<ol>
<li>将小鼠（每组最少n = 6只小鼠）分开在单个笼子中。</li>
		<li>制备诱导癫痫发作注射液和相应的载体（见 <stron...

<ol>
	<li>Aronica, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammatory+targets+and+treatments+for+epilepsy+validated+in+experimental+models.">Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models.</a> Epilepsia. 58, 27-38 (2017).</li><li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry.">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li><li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes.">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li><li>Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+analytical+methods+for+eicosanoids+in+brain+tissue.">A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).</li><li>Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+determination+of+23+eicosanoids.">Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li><li>L&#233;vesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration.">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li><li>Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-Neuron+Communication+in+Epilepsy.">Microglia-Neuron Communication in Epilepsy.</a> Glia. 65 (1), 5-18 (2017).</li><li>Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kainic+acid-induced+neurodegenerative+model:+Potentials+and+limitations.">Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).</li><li>Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+&#945;-CGRP+in+the+regulation+of+neurotoxic+responses+induced+by+kainic+acid+in+mice.">Role of &#945;-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice.</a> Peptides. 44, 158-162 (2013).</li><li>Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+lipidomic+and+transcriptional+changes+of+prophylactic+PEA+administration+in+control+mice.">Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).</li><li>Post, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiepileptogenic+Effect+of+Subchronic+Palmitoylethanolamide+Treatment+in+a+Mouse+Model+of+Acute+Epilepsy.">Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).</li><li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death:+Implications+for+gene+targeting+approaches.">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li><li>Monory, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endocannabinoid+System+Controls+Key+Epileptogenic+Circuits+in+the+Hippocampus.">The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus.</a> Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).</li><li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.">The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rondent+Brain+Regions.">Dissection of Rondent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).</li><li>Gross, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+lipidomics+through+space+and+time.">The evolution of lipidomics through space and time.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Abbott, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+lipid+extraction+method+for+the+analysis+of+human+brain+lipids.">An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids.</a> Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li></ol>

这里描述的神经脂质组学和转录组学方法是一种可行的方法，用于研究大脑和外周器官中以高和低空间分辨率的任何疾病或健康发育。由于优化了血浆采样和处理程序，血浆脂质组学分析也可以从相同的动物处死进行组织脂质组学和转录组学，从而提高组织血液分子相关性和生物标志物发现的可靠性。通过应用三种方案中的任何一种或其组合来提供广泛的数据集，不仅对于在上下文中（动物模型?...

脂质功能及其在神经系统疾病发病和进展中的作用的最新进展为新治疗靶点和疾病机制的阐明开辟了新的研究和开发场所1。现代分子成像技术（如质谱成像和高级质谱分析）强调了不同大脑区域脂质组成的记录差异，将脂质研究的范式从整个大脑转向功能上不同和离散的大脑区域。脂质组成在不同大脑区域变化的事实促使人们对膜脂质敏感性和下游脂质信号传导的新概念化，以响应功能上不同的大脑区域的脑损伤或刺激。因此，脂质方案需要新的发展来解决低组织量的挑战，以进行更高的空间分辨率检测和定量，同时分析细胞膜和信号通路的多种脂质成分。此外，测定参与调节其水平和功能的酶、脂质配体和受体对于阐明神经系统疾病中受影响的信号通路和指导病理生理学背景下的新机制研究至关重要。
除了增加的大脑空间分辨率外，还有两个主要困难挑战着新的神经脂质组学方法的发展。首先，与膜构成性脂质相比，脂质信号分子的丰度通常非常低。其次，脂质组表现出很高的结构异质性，难以使用单一的分析方法进行解剖。因此，提取和分析方法针对不同的脂质类别量身定制，通常在不同的组织样品中进行2.霰弹枪脂质组学方法3 是快速揭示膜脂质的广泛特征的极好工具，而靶向发现和定量质谱方法提供的增强灵敏度和选择性被用于研究低丰度信号脂质，包括：i）炎症脂质和ii）参与调节神经元活性的脂质，如内源性大麻素（eCBs），氨基酸连接脂质， 等。4,5.为了涵盖神经系统疾病模型的大脑区域中发生的细胞膜和信号传导水平的脂质变化，通常脂质提取和分析在不同的组织样品中进行，从不同的动物批次或不同的半球获得，或者通过将较大的组织区域解剖成多个部分。当酶受体的mRNA水平也令人感兴趣时，他们的研究通常需要采购不同的组织样本。例如，膜脂质、内源性大麻素和mRNA的研究将需要三种不同的组织样品（例如，两种脂质提取方法的两个样品 - 膜脂质和信号脂质 - 以及随后的两种脂质分析方法 - 以及一种用于mRNA分析的样品）。炎症性脂质和内源性大麻素的研究需要两种不同的组织样本，分别是提取方法和分析方法。另一个例子是脑冲床或激光显微切割样品中mRNA和任何脂质类别的研究，因此需要两个不同的动物在每个大脑（子）区域采购两个样品。在这种情况下，由于生物变异性和/或组织异质性，结果的可变性和/或可重复性差经常发生。在多分子分析的这些实际局限性的指导下，特别是在大脑中的高空间分辨率下，设计了一个三模块神经脂质组学方案，包括：1）通过LC / MRM共吸和共分析炎症脂质（例如，类二十烷酸（eiCs））和参与调节神经元活性的脂质，例如eCBs2;2）磷脂（PLs）和eCB的共萃取，随后进行多重扫描LC / MRM和前体/中性损失扫描分析2;3）膜（磷酸）脂质和eCBs以及mRNA的双重提取，随后进行LC / MRM和qPCR或RNA测序分析6.根据神经系统疾病中要解决的生物学问题和感兴趣的大脑区域，第一和第二方案的组合，或第一和第三方案的组合，可以应用于重量约为4mg的组织的同一组织标本。第一和第三方案可以独立应用于2mg左右的组织。第二种方案可应用于重量低至0.5mg的组织。无论选择哪种神经脂质组方案模块，组织采样和预分析处理、脑分离和区域解剖以及牺牲动物模型的程序对于方案的所有三个模块都是标准化和相同的。在我们对神经系统疾病的调查中，与疾病的病理后果相关的外周器官也总是使用这些模块化方案进行收集和分析。此外，定期对血液进行血浆脂质组学采样，以作为神经系统疾病的读数工具，以期进行前瞻性的转化应用。这里提出的模块化脂质组学方案非常通用：可扩展到更大的组织量，并且易于适用于几乎任何组织类型和疾病。用于模块化协议（图 1在神经系统疾病中，任何神经系统疾病（如创伤性脑损伤，帕金森病，阿尔茨海默病或癫痫）的发病和进展的标准化啮齿动物模型都是可以接受的。
这些方案已被广泛用于研究凯尼克酸（KA）诱导的癫痫小鼠模型中癫痫急性期组织脂质组和/或转录组的变化2，7，由于与人类颞叶癫痫（TLE）相似，该模型广泛用于临床前研究8，9，10，11。使用这些方案，在同一个癫痫小鼠模型中评估了棕榈酰乙醇酰胺（PEA）12，13等药物的治疗潜力。该研究确定了大脑和外周，在最大急性癫痫发作强度的时间点（在癫痫发作后60分钟诱导时）以及在KA癫痫发作诱导后的四个不同时间点（20，60，120和180分钟）用PEA进行亚慢性和急性治疗时，脂质和mRNA在高空间分辨率和低空间分辨率下的变化，这是一个覆盖癫痫急性期的时间窗口。在每个时间点收集未经处理的KA注射小鼠，急性和亚慢性PEA处理小鼠以及载体和PEA载体对照小鼠的血浆，大脑和外周器官12，13，并通过该分子分析进行研究。分子数据与通过癫痫发作评分获得的行为表型以及神经退行过程的免疫组织化学衍生数据相关，以揭示急性癫痫期的进展和PEA缓解它的潜力。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007248-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay334570-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200 series LC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 334230</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Real-Time PCR cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amber eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst 1.6.2 Software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic Acid-d8 MS Standard</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay-10007277</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessmann Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bino</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved Caspase 3 antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat, Leica CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTC HTC PAL autosampler</td>
			<td>CTC Analytics AG</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Curved Forceps Dumoxel #7</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1000 A R&#246;hrchen</td>
			<td>Kabe Labortechnik</td>
			<td>078001</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP-1 EconoPump</td>
			<td>BioRAD</td>
			<td>700BR07757</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps Mirror Finish</td>
			<td>FST</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors straight sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissor Tungsten Carbide straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>14568-09</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spatulae</td>
			<td>FST</td>
			<td>10094-13</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainic acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120100</td>
			<td>Epileptic drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid View software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 17:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855676P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855775P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna 2,5&#181;m C18(2)- HAST 100A LC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00D-4446-B0</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying lamp</td>
			<td>Maul GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Camara</td>
			<td>Motic</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34875-1L</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiQuant 3.0 quantitation software package</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840857P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1404</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay90350-100</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide-d5</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay9000573-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1004</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850757P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1104</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1204</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1504</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precelleys 24</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Keramik-K&#252;gelchen</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-pcs-ck14p</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Stahlkugeln 2,8mm</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PCS-MK28P</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys-keramik-kit 1,4 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 12010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 312010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007211-1</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2-d9</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10581-50</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1304</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>AU111609004</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real Time PCR System</td>
			<td>Appliert Biosystem</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resolvin D1</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10012554-11</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Security Guard precolumn</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon coverplates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>72110017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon slide rack and lid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>73310017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>860586P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM d18:1/12:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-2312</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forceps straight Smooth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11016-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3000 Thermocycler</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay19030-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay319030-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen/ Retsch</td>
			<td>12120240804</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidinblau</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0300.2</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapotherm</td>
			<td>Barkey</td>
			<td>4004734</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasser LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidomics and transcriptomics in neurological diseases

脂质是大脑损伤或刺激的主要接口，有利于神经系统疾病，是合成具有各种信号或配体功能的脂质的储存库，可以强调疾病的发作和进展。脂质通常在症状前水平发生变化，是药物靶标和生物标志物的新兴来源。许多神经系统疾病表现出神经炎症，神经变性和神经元兴奋性作为共同的标志，部分由特定的脂质信号系统调节。各种脂质合成的相互依赖性和相互关系促使进行多脂，多酶和多受体分析，以推导出神经学背景的共性和特异性，并加速疾病发作和进展的机制方面的解体。将脂质作用归因于不同的大脑区域，可以促进与神经系统疾病相关的脂质分子表型和形态的测定。
这里介绍的是一个模块化方案，适用于分析膜脂质和下游脂质信号以及酶和介体的mRNA，这些酶和介质的基础是其功能，从与特定神经系统疾病和/或病症相关的离散大脑区域中提取。为确保准确的比较脂质组学分析，工作流程和操作标准进行了优化和标准化，以实现：i）脑采样和感兴趣区域的解剖，ii）多种脂质信号和膜脂质的共同提取，iii）双重脂质/mRNA提取，iv）通过液相色谱多重反应监测（LC / MRM）定量，以及v）标准mRNA分析。该工作流程适用于通过对功能离散的大脑子区域（即通过脑打孔）进行采样而获得的低组织量，从而防止由于组织异质性和/或动物变异性而导致的多分子分析中的偏差。为了揭示神经系统疾病的外周后果并建立神经系统疾病状态的翻译分子读数，还进行了周围器官采样，处理及其随后的脂质组学分析以及血浆脂质组学。该协议在急性癫痫小鼠模型上得到验证。

所描述的方案集可以以特定目的的方式在不同水平上组合，例如动物模型的选择，采样途径，提取和剖析方法（图1）。
为了确定急性癫痫发作状态一段时间内大脑和外周的脂质水平变化，并揭示PEA的潜在抗癫痫作用13 及其对脑和外周脂质组变化的影响，对3个实验动物组进行了载体治疗...

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Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

本文提出了一种模块化方案，用于神经系统疾病小鼠模型中的组织脂质组学和转录组学以及血浆脂质组学，靶向炎症和神经元活性下的脂质，膜脂质，下游信使以及脂质功能下的mRNA编码酶/受体。概述了采样，样品处理，提取和定量程序。

神经系统疾病中的脂质组学和转录组学

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

这种模块化方案使得探索由结构和信号传导脂质和/或RNA在谨慎的组织区域和血液中呈现的多种分子事件成为可能，并改善了每个样品标本的定量和定性数据输出。该方法适用于任何实验模型，也可以应用于人体组织标本和血液。演示该程序的将是技术员Claudia Schwitter，研究生Julia Post和我小组的博士后Raissa Lerner。首先，取先前分离的，完整的，冷冻的小鼠的大脑，急性和预防性治疗的Kainic酸诱导的癫痫。将大脑安装到低温恒温器的安装系统上。将厚度设置为50微米，并在靠近感兴趣区域的修剪模式下切割大脑。接近感兴趣区域时，将厚度设置为 18 到 20 微米。为了定位感兴趣的子区域，请使用甲苯胺蓝染色脑切片。使用显微镜检查染色切片以确定要打孔的感兴趣区域，并使用小鼠图谱作为参考以找到适当的大脑解剖区域。使用取样取芯机取 0.8 至 1.0 毫米直径的冲头。将内源性大麻素和二十烷酸共萃取的冲头转移到预冷却的2毫升琥珀管中，每个管有7个预冷却的钢球。对于磷脂和内源性大麻素共萃取，双脂质和RNA共萃取，将冲头转移到带有陶瓷珠的2毫升无RNase提取管中。在冷室中称量冷冻的冲头，并立即进行提取或在80摄氏度下冷冻。要从脑片，冲头或组织粉末样品中进行内源性大麻素和二十烷酸的液液脂质共萃取，请将含有组织样品和七个钢球的提取管放在冰上。加入600微升冰冷的MTBE和50微升含有内标的乙腈水。加入400微升0.1摩尔甲酸后，使用组织裂解器匀浆30秒至1分钟。将该匀浆在4摄氏度下以5， 000 g离心15分钟。将其置于冰箱中，在80摄氏度下放置10分钟，以冷冻水性下相，这将缓解上层有机相的转移。将上层有机相转移到新的1.5毫升琥珀管中，在37摄氏度的温和氮气流下蒸发10分钟，然后在50微升乙腈水中重建以进行进一步分析。将水相储存在20或80摄氏度，以进行进一步的蛋白质含量分析。为了从血浆样品中共排出内源性大麻素和二十烷酸，将冷冻的血浆样品放在冰上并使其完全解冻。加入800微升MTBE和50微升乙腈水，其中含有使用参考血浆样品优化的内标。加入600微升0.1摩尔甲酸，在4摄氏度下涡旋2分钟。将样品在4，000克下在4摄氏度下离心15分钟。将有机相转移到新管中。在37摄氏度的温和氮气流下蒸发，然后用50微升乙腈水将其重组，用于液相色谱多反应监测分析。要从大脑区域，冲头或其他组织粉末样品中共取磷脂和内源性大麻素，请将含有组织样品和陶瓷珠的提取管放在冰上。加入800微升甲基叔丁基醚和甲醇混合物以及10微升含内标的甲醇。然后，加入200微升含有25微摩尔四氢列普他汀/ URB597和每毫升BHT50微克的0.1%甲酸。用组织均质器均质后，在5， 000次g和4摄氏度下离心15分钟。将上层有机相转移到新的管中，在37摄氏度的温和氮气流下蒸发，然后用90微升甲醇重建该脂质提取物。如果立即进行，将10%的水加入脂质提取物等分试样中，并在LC / MS中注射10微升用于磷脂分析。要进行进一步的内源性大麻素分析，请继续进行下一步。取脂质提取物的等分试样，蒸发至干，然后在乙腈水中重建。为了进行RNA和脂质的双重提取以及从组织样品中共提取磷脂和内源性大麻素，请在4摄氏度下解冻组织粉末等分试样或脑束。将组织加入带有陶瓷珠的提取管中。然后加入600微升RLT缓冲液和200微升氯仿。对于磷脂和内源性大麻素共萃取，用10微升内标混合物刺入样品，并高速匀浆20秒。将匀浆样品转移到新的离心管中，以全速和4摄氏度离心5分钟，以实现相分离。使用标准试剂盒将上相转移到新鲜管中以进行RNA提取。洗脱在总体积为50微升的无RNase水中提取RNA并将其储存在80摄氏度。对于脂质提取，将800微升MTBE /甲醇和200微升0.1%甲酸加入含氯仿的低相中。在4摄氏度下涡旋45分钟。将上层有机相转移到新管中。在37摄氏度的温和氮气流下蒸发。对于进一步的LC / MS分析，将样品在90微升甲醇中重建并将其储存在20或80摄氏度下，或立即进行分析。要进行进一步的内源性大麻素分析，请继续进行下一步。取脂质提取物的等分试样，蒸发至干，然后在乙腈水中重建。然后，在LC / MS中注入20微升用于内源性大麻素分析。急性癫痫发作的凯尼克酸诱导导致注射后一小时的最大癫痫发作强度。内源性大麻素和类二十烷酸以及磷脂和内源性大麻素的脂质组学分析显示，凯宁酸诱导的癫痫小鼠和对照组的大脑皮层、纹状体、丘脑区、海马体、下丘脑、小脑以及心肺组织中的脂质水平变化。对磷脂、内源性大麻素和RNA进行双重提取，对小鼠脑冲量进行定量剖析，分析了脂质在下丘脑、基底外侧杏仁核、腹侧和背海马体中的定量分布。参与脂质信号传导的内源性酶和受体的相对表达水平，以及在mRNA水平上研究了不同大脑区域和次区域中来自凯尼克酸诱导的癫痫发作和对照组小鼠的大脑活动标志物。与对照盐水注射小鼠相比，Kainic酸诱导的癫痫导致NeuN信号的大量丢失，主要在海马体的CA1，CA3和hilus区域，伴有半胱天冬酶-3信号指示的凋亡事件。用亚染色棕榈酰乙醇酰胺处理后，神经元核蛋白信号明显保留，CASP3信号几乎检测不到。脑部打孔和剖析谨慎的大脑区域非常具有挑战性，需要精细的技能才能在多个队列中获得一致的采样。因此，强烈建议在测试器官上练习并了解良好的大脑形态学。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

从胚胎脊髓​​连合神经的解剖和文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

科研

神经科学

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

全身和局部给药治疗的中枢神经系统疾病的啮齿动物模型

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

总钙在神经元的电子探针X射线显微分析测量

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Optogenetic Functional MRI

光遗传学功能磁共振成像

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

在多发性硬化症的小鼠模型测量进行性神经功能残疾

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

海马神经元中突触囊泡吞的测量

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

应用脑注射策略建立小鼠 Zika 病毒诱发神经系统疾病模型: 胚胎、新生儿和成人

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

小鼠嗅觉学习和鉴别的客观和可重复性试验

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

发展果蝇神经元的快速丹德林分体动力学的延时实时成像和定量

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

使用从纤维细胞直接转换为神经元祖先细胞和分化为星形细胞的神经系统疾病体外建模

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...