Name: lipidomics and transcriptomics in neurological diseases
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases at JoVE.com

Vi dedikerer denne artikel til Dr. Ermelinda Lomazzo. Under færdiggørelsen af dette manuskript døde Dr. Ermelinda Lomazzo. Hun er legemliggørelsen af lidenskab for videnskab og uselvisk engagement i teamwork for at opfylde et meningsfuldt forskningsformål. Hun har altid drømt om at bidrage meningsfuldt til menneskers større trivsel. Hendes godhjertede natur blev aldrig kompromitteret af videnskabens og livets anstrengende veje. Hun vil forblive uvurderlig og for evigt i vores hjerter.
Julia M. Post blev finansieret af Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) ved University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz og er i øjeblikket finansieret af SPP-2225 EXIT-projektet til LB. Raissa Lerner blev delvist finansieret af DZHK-projekt 81X2600250 til LB og Lipidomics Core Facility. Delvis finansiering til disse undersøgelser blev ydet af Lipidomics Core Facility, Institut for Fysiologisk Kemi og Intramurale midler (til LB) fra University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz.

Alle forsøgsprocedurer, der er beskrevet her, er i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs rådsdirektiv af 22. september 2010 (2010/63EU) og blev godkendt af den lokale dyrekomité i delstaten Rheinland-Pfalz, Tyskland (filreference: 23 177-07/G16-1-075).
1. Dyremodel af akut og profylaktisk behandlet KA-induceret epilepsi
<ol><li>Udfør anfaldsinduktion, behandling og adfærdsmæssig scoring.<ol>
<li>Adskil mus (minimum n = 6 mus pr. gruppe) i enkeltbure.</li>
		<li>Der fremstil...

<ol>
	<li>Aronica, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammatory+targets+and+treatments+for+epilepsy+validated+in+experimental+models.">Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models.</a> Epilepsia. 58, 27-38 (2017).</li><li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry.">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li><li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes.">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li><li>Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+analytical+methods+for+eicosanoids+in+brain+tissue.">A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).</li><li>Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+determination+of+23+eicosanoids.">Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li><li>L&#233;vesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration.">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li><li>Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-Neuron+Communication+in+Epilepsy.">Microglia-Neuron Communication in Epilepsy.</a> Glia. 65 (1), 5-18 (2017).</li><li>Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kainic+acid-induced+neurodegenerative+model:+Potentials+and+limitations.">Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).</li><li>Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+&#945;-CGRP+in+the+regulation+of+neurotoxic+responses+induced+by+kainic+acid+in+mice.">Role of &#945;-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice.</a> Peptides. 44, 158-162 (2013).</li><li>Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+lipidomic+and+transcriptional+changes+of+prophylactic+PEA+administration+in+control+mice.">Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).</li><li>Post, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiepileptogenic+Effect+of+Subchronic+Palmitoylethanolamide+Treatment+in+a+Mouse+Model+of+Acute+Epilepsy.">Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).</li><li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death:+Implications+for+gene+targeting+approaches.">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li><li>Monory, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endocannabinoid+System+Controls+Key+Epileptogenic+Circuits+in+the+Hippocampus.">The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus.</a> Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).</li><li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.">The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rondent+Brain+Regions.">Dissection of Rondent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).</li><li>Gross, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+lipidomics+through+space+and+time.">The evolution of lipidomics through space and time.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Abbott, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+lipid+extraction+method+for+the+analysis+of+human+brain+lipids.">An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids.</a> Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li></ol>

Den neurolipidomiske og transkriptomiske metode, der er beskrevet her, er et levedygtigt middel til at undersøge enhver sygdom eller sund udvikling ved høj og lav rumlig opløsning i hjernen og perifere organer. På grund af de optimerede plasmaprøveudtagnings- og håndteringsprocedurer kan plasmalipidomisk analyse også udføres fra de samme dyr, der ofres for vævlipidomik og transkriptomik, hvilket forbedrer pålideligheden af vævsblodmolekylære korrelater og biomarkøropdagelse. Tilvejebringelsen af et bredt dat...

Nylige fremskridt inden for lipidernes funktion og deres rolle i begyndelsen og udviklingen af neurologiske sygdomme åbner nye forsknings- og udviklingssteder for nye terapeutiske mål og sygdomsmekanismeudredning1. Dokumenterede forskelle i lipidsammensætning i forskellige hjerneområder, understreget af moderne molekylære billeddannelsesteknikker såsom massespektrometribilleddannelse og avanceret massespektrometriprofilering, skifter paradigmet for lipidundersøgelse fra hele hjernen mod funktionelt adskilte og diskrete hjerneområder. Det faktum, at lipidsammensætningen varierer i forskellige hjerneområder, medfører ny konceptualisering af både membranlipidfølsomhed og nedstrøms lipidsignalering som reaktion på en hjernefornærmelse eller stimuli på tværs af de funktionelt forskellige hjerneområder. Derfor kræver lipidprotokoller nye udviklinger for at imødegå udfordringen med lave vævsmængder til detektion og kvantificering af højere rumlig opløsning og samtidig analyse af flere lipidkomponenter i cellemembraner og signalveje. Bestemmelse af enzymer, lipidligander og receptorer, der er involveret i reguleringen af deres niveauer og funktion, er også afgørende for at belyse de signalveje, der er berørt af en neurologisk sygdom, og guide nye mekanistiske undersøgelser i en patofysiologisk sammenhæng.
Ud over den øgede hjerne rumlige opløsning er der to store vanskeligheder, der udfordrer udviklingen af nye neurolipidomiske tilgange. For det første er lipidsignalmolekylerne typisk af meget lav overflod sammenlignet med membrankonstitutive lipider. For det andet udviser lipidomet en høj strukturel heterogenitet, vanskelig at dissekere ved hjælp af en enkelt analytisk tilgang. Derfor er ekstraktions- og analysemetoder skræddersyet til forskellige lipidkategorier og udføres almindeligvis i forskellige vævsprøver2. Shotgun lipidomiske metoder3 er fremragende værktøjer til hurtigt at afsløre en bred profil af membranlipider, mens øget følsomhed og selektivitet, der ydes af de målrettede opdagelses- og kvantificeringsmassespektrometriske metoder, udnyttes til undersøgelse af lavt rigelige signallipider, herunder: i) inflammatoriske lipider og ii) lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom endocannabinoider (eCB'er), aminosyrebundne lipider, osv.4,5. For at omfatte lipidændringer på både cellemembranen og signalniveau, der forekommer i hjerneområder af neurologiske sygdomsmodeller, udføres typisk lipidekstraktion og analyse i forskellige vævsprøver, opnået fra forskellige dyrepartier eller fra forskellige halvkugler eller ved at dissekere en større vævsregion i flere stykker. Når mRNA-niveauer af enzymreceptorer også er af interesse, kræver deres undersøgelse typisk indkøb af en særskilt vævsprøve. For eksempel ville undersøgelsen af membranlipider, endogene cannabinoider og mRNA kræve tre forskellige vævsprøver (f.eks. To prøver til de to lipidekstraktionsmetoder - membranlipider og signallipider - og efterfølgende to lipidanalysemetoder - og en prøve til mRNA-analyse). Undersøgelse af inflammatoriske lipider og endogene cannabinoider kræver henholdsvis to forskellige vævsprøver, ekstraktionsmetoder og analysemetoder. Et andet eksempel er undersøgelsen af mRNA og af enhver lipidkategori i en hjernestans eller lasermikrodissektionsprøve, som derfor kræver, at to forskellige dyr indkøber to prøver pr. Hjerne (sub)region. Der forekommer ofte en betydelig grad af variabilitet og/eller ringe reproducerbarhed af resultaterne i sådanne tilfælde som følge af biologisk variabilitet og/eller vævsheterogenitet. Styret af disse praktiske begrænsninger ved multimolekylær analyse, der især forekommer ved høj rumlig opløsning i hjernen, blev der designet en tre-modul neurolipidomics-protokol, der omfattede: 1) coextraktion og co-analyse af LC / MRM af inflammatoriske lipider (f.eks. Eicosanoider (eIC'er)) og lipider involveret i modulering af neuronal aktivitet, såsom eCC'er2; 2) co-ekstraktion af phospholipider (PL'er) og eCC'er med efterfølgende multiscan LC/MRM og precursor/neutral loss scan analyse2; og 3) dobbelt ekstraktion af membran (phospho)lipider og eCB'er samt mRNA med efterfølgende LC/MRM- og qPCR- eller RNA-sekventeringsanalyse6. Afhængigt af det biologiske spørgsmål, der skal behandles i en neurologisk sygdom, og hjerneområdet af interesse kan en kombination af den første og den anden protokol eller den første og den tredje protokol anvendes på den samme vævsprøve for væv, der vejer omkring 4 mg. Den første og tredje protokol kan anvendes uafhængigt for væv omkring 2 mg. Den anden protokol kan anvendes til væv, der vejer så lidt som 0,5 mg. Uanset hvilket neurolipidomisk protokolmodul der vælges, er vævsprøveudtagning og præanalytisk behandling, hjerneisolering og regionsdissektion samt proceduren for ofring af dyremodellen standardiseret og identisk for alle tre moduler i protokollen. I vores undersøgelse af neurologiske sygdomme indsamles og analyseres perifere organer, der er relevante for sygdommens patologiske konsekvenser, altid også ved hjælp af disse modulære protokoller. Derudover udtages der regelmæssigt prøver af blod til plasmalipidomik for at tjene som et udlæsningsværktøj for neurologiske sygdomme med henblik på potentielle translationelle anvendelser. Den her præsenterede modulære lipidomics-protokol er meget alsidig: skalerbar til større vævsmængder og let anvendelig til stort set enhver vævstype og sygdom. Til anvendelse af den modulære protokol (Figur 1) i neurologiske sygdomme er enhver standardiseret gnavermodel for debut og progression af neurologiske lidelser, såsom traumatisk hjerneskade, Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom eller epilepsi, modtagelige.
Disse protokoller er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere ændringer i vævlipidomet og/eller transkriptomet i den akutte fase af epilepsi i den kainsyre (KA)-inducerede musemodel af epilepsi2,7, en model, der i vid udstrækning anvendes i prækliniske undersøgelser på grund af ligheden med human temporal lobe epilepsi (TLE)8,9,10,11. Ved hjælp af disse protokoller blev det terapeutiske potentiale af lægemidler som Palmitoylethanolamid (PEA)12,13 vurderet i den samme musemodel af epilepsi. Undersøgelsen identificerede lipid- og mRNA-ændringer ved høj og lav rumlig opløsning i hjernen og periferien, på tidspunktet for maksimale akutte anfaldsintensiteter (ved 60 minutters postbeslaglæggelsesinduktion) og ved subkronisk og akut behandling med PEA på fire forskellige tidspunkter (20, 60, 120 og 180 minutter) efter KA-anfaldsinduktion, et tidsvindue, der dækker den akutte fase af epilepsi. Plasma, hjerner og perifere organer fra ubehandlede KA-injicerede mus, akutte og subkronisk ærtebehandlede mus samt køretøjs- og PEA-køretøjskontrolmus blev indsamlet på hvert tidspunkt12,13 og undersøgt med denne molekylære analyse. De molekylære data var korreleret med adfærdsmæssige fænotyper opnået ved anfaldsscoring såvel som med immunohistokemi-afledte data om neurodegenerative processer for at optrævle progressionen af den akutte epilepsifase og PEA's potentiale til at lindre den.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007248-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay334570-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200 series LC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 334230</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Real-Time PCR cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amber eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst 1.6.2 Software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic Acid-d8 MS Standard</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay-10007277</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessmann Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bino</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved Caspase 3 antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat, Leica CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTC HTC PAL autosampler</td>
			<td>CTC Analytics AG</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Curved Forceps Dumoxel #7</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1000 A R&#246;hrchen</td>
			<td>Kabe Labortechnik</td>
			<td>078001</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP-1 EconoPump</td>
			<td>BioRAD</td>
			<td>700BR07757</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps Mirror Finish</td>
			<td>FST</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors straight sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissor Tungsten Carbide straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>14568-09</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spatulae</td>
			<td>FST</td>
			<td>10094-13</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainic acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120100</td>
			<td>Epileptic drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid View software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 17:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855676P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855775P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna 2,5&#181;m C18(2)- HAST 100A LC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00D-4446-B0</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying lamp</td>
			<td>Maul GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Camara</td>
			<td>Motic</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34875-1L</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiQuant 3.0 quantitation software package</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840857P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1404</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay90350-100</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide-d5</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay9000573-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1004</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850757P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1104</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1204</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1504</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precelleys 24</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Keramik-K&#252;gelchen</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-pcs-ck14p</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Stahlkugeln 2,8mm</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PCS-MK28P</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys-keramik-kit 1,4 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 12010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 312010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007211-1</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2-d9</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10581-50</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1304</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>AU111609004</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real Time PCR System</td>
			<td>Appliert Biosystem</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resolvin D1</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10012554-11</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Security Guard precolumn</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon coverplates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>72110017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon slide rack and lid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>73310017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>860586P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM d18:1/12:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-2312</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forceps straight Smooth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11016-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3000 Thermocycler</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay19030-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay319030-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen/ Retsch</td>
			<td>12120240804</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidinblau</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0300.2</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapotherm</td>
			<td>Barkey</td>
			<td>4004734</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasser LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidomics and transcriptomics in neurological diseases

Lipider tjener som den primære grænseflade til hjernefornærmelser eller stimuli, der fremmer neurologiske sygdomme og er et reservoir til syntese af lipider med forskellige signal- eller ligandfunktion, der kan understrege sygdommens begyndelse og progression. Lipider, der ofte ændrer sig på det præsymptomatiske niveau, er en ny kilde til lægemiddelmål og biomarkører. Mange neurologiske sygdomme udviser neuroinflammation, neurodegeneration og neuronal excitabilitet som fælles kendetegn, delvis moduleret af specifikke lipidsignalsystemer. Den indbyrdes afhængighed og indbyrdes sammenhæng mellem syntese af forskellige lipider tilskynder til en multilipid-, multienzym- og multireceptoranalyse for at udlede fællestræk og specificiteter i neurologiske sammenhænge og for at fremskynde optrævlingen af mekanistiske aspekter af sygdomsdebut og progression. At tilskrive lipidroller til forskellige hjerneområder fremmer bestemmelsen af lipidmolekylær fænotype og morfologi forbundet med en neurologisk sygdom.
Præsenteret her er en modulær protokol, der er egnet til analyse af membranlipider og nedstrøms lipidsignaler sammen med mRNA af enzymer og mediatorer, der ligger til grund for deres funktionalitet, ekstraheret fra diskrete hjerneområder, der er relevante for en bestemt neurologisk sygdom og / eller tilstand. For at sikre nøjagtig komparativ lipidomisk profilering blev arbejdsgangene og driftskriterierne optimeret og standardiseret til: i) hjerneprøveudtagning og dissektion af regioner af interesse, ii) co-ekstraktion af flere lipidsignaler og membranlipider, iii) dobbelt lipid / mRNA-ekstraktion, iv) kvantificering ved væskekromatografi multiple reaction monitoring (LC / MRM) og v) standard mRNA-profilering. Denne arbejdsgang er egnet til de lave vævsmængder, der opnås ved prøveudtagning af de funktionelt diskrete hjerneunderregioner (dvs. ved hjernestansning), hvilket forhindrer bias i multimolekylær analyse på grund af vævsheterogenitet og / eller dyrevariabilitet. For at afsløre perifere konsekvenser af neurologiske sygdomme og etablere translationelle molekylære udlæsninger af neurologiske sygdomstilstande forfølges og beskrives også prøveudtagning af perifere organer, behandling og deres efterfølgende lipidomiske analyse samt plasmalipidomik. Protokollen er demonstreret på en akut epilepsimusemodel.

Sættet af beskrevne protokoller kan kombineres på forskellige niveauer på en målspecifik måde, f.eks. valg af dyremodel, prøveudtagningsvej, ekstraktionsmetode og profilering (figur 1).
For at bestemme lipidniveauændringer i hjernen og periferien over et tidsforløb af en akut epileptisk anfaldstilstand og for at opklare den potentielle antiepileptiske virkning13 af PE...

Watch this Scientific Journal Video about Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases at JoVE.com

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

Denne artikel præsenterer en modulær protokol for vævlipidomik og transkriptomik og plasmalipidomik i neurologiske sygdomsmusmodeller rettet mod lipider, der ligger til grund for inflammation og neuronal aktivitet, membranlipider, nedstrøms budbringere og mRNA-kodende enzymer / receptorer, der ligger til grund for lipidfunktionen. Prøveudtagnings-, prøvebehandlings-, ekstraktions- og kvantificeringsprocedurer er skitseret.

Lipidomics og transcriptomics i neurologiske sygdomme

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

Denne modulære protokol gør det muligt at udforske flere molekylære hændelser gengivet af strukturelle og signalgivende lipider og / eller RNA'er i diskrete vævsområder og i blod med en forbedret kvantitativ og kvalitativ dataudgang pr. Prøveprøve. Metoden kan anvendes til enhver eksperimentel model, og den kan også anvendes på humane vævsprøver og blod. Demonstration af proceduren vil være Claudia Schwitter, en tekniker, Julia Post, en gradstuderende, og Raissa Lerner, en postdoc i min gruppe.Til at begynde med skal du tage tidligere isolerede, hele, frosne hjerner fra mus med akut og profylaktisk behandlet kainsyreinduceret epilepsi. Monter hjernerne på kryostatens monteringssystem. Indstil tykkelsen til 50 mikrometer, og skær hjernen i trimtilstand tæt på det område, der er af interesse.Når du nærmer dig interesseområdet, skal du indstille tykkelsen til 18 til 20 mikrometer. For at lokalisere underregionen af interesse, plet hjerneskiver ved hjælp af toluidin blå. Brug et mikroskop til at inspicere de farvede skiver for at identificere de områder af interesse, der skal stanses, og brug et museatlas som reference til at finde de relevante hjerneanatomiske regioner.Brug prøvekorers til at tage stans med en diameter på 0,8 til 1,0 millimeter. Overfør slagene til endocannabinoider og eicosanoider coextraktioner til forkølede 2 milliliter ravrør med syv forkølede stålkugler pr. Rør. For phospholipider og endocannabinoider coextraktion, dobbelt lipid og RNA co-ekstraktion, overføres stanserne til 2 ml RNase-fri ekstraktionsrør med keramiske perler.Vej frosne slag i kølerummet og fortsæt straks med ekstraktion eller frys ved 80 grader Celsius. For at udføre væske-flydende lipidkoekstraktion af endocannabinoider og eicosanoider fra hjernestykker, slag eller vævspulverprøver skal du placere ekstraktionsrørene indeholdende vævsprøverne og syv stålkugler på is. Tilsæt 600 mikroliter iskold MTBE og 50 mikroliter acetonitrilvand, der indeholder de interne standarder.Efter tilsætning af 400 mikroliter 0,1 molær myresyre skal du bruge en vævslyser til at homogenisere i 30 sekunder til 1 minut. Centrifugering af dette homogenat i 15 minutter ved 5.000 gange g ved 4 grader Celsius. Anbring den i fryseren i 10 minutter ved 80 grader Celsius for at fryse den vandige nedre fase, hvilket vil lette overførslen af den øvre organiske fase.Overfør den øvre organiske fase til nye 1,5 ml ravrør, fordamp under en blid strøm af nitrogen ved 37 grader Celsius i 10 minutter, og rekonstituer derefter i 50 mikroliter acetonitrilvand til yderligere analyse. Opbevar den vandige fase ved 20 eller 80 grader Celsius til yderligere proteinindholdsanalyse. For at samle endocannabinoider og eicosanoider fra plasmaprøver skal du placere de frosne plasmaprøver på is og lade dem tø helt op.Tilsæt 800 mikroliter MTBE og 50 mikroliter acetonitrilvand indeholdende de interne standarder, der er optimeret til spiking ved hjælp af referenceplasmaprøver. Tilsæt 600 mikroliter 0,1 molær myresyre og hvirvel ved 4 grader Celsius i 2 minutter. Centrifugering af prøverne ved 4.000 gange g i 15 minutter ved 4 grader Celsius.Overfør den organiske fase til nye rør. Fordamp det under en blid strøm af nitrogen ved 37 grader Celsius, og rekonstituer det derefter med 50 mikroliter acetonitrilvand til væskekromatografi multiple reaktionsovervågningsanalyse. For at udføre coekstraktion af phospholipider og endocannabinoider fra hjerneområder, slag eller andre vævspulverprøver skal du placere ekstraktionsrørene indeholdende vævsprøverne og keramiske perler på is.Der tilsættes 800 mikroliter methyltert-butylether og methanolblanding og 10 mikroliter methanol indeholdende de interne standarder. Derefter tilsættes 200 mikroliter 0,1 % myresyre indeholdende 25 mikromolær tetrahydrolipstatin/URB597 og 50 mikrogram pr. milliliter BHT. Efter homogenisering med en vævshomogenisator centrifugeres ved 5.000 gange g og 4 grader Celsius i 15 minutter.Overfør den øvre organiske fase til nye rør, fordamp under en blid strøm af nitrogen ved 37 grader Celsius, og rekonstituer derefter dette lipidekstrakt med 90 mikroliter methanol. Hvis du fortsætter med det samme, tilsættes 10% vand til en alikvot lipidekstrakt og injiceres 10 mikroliter i LC / MS til phospholipidanalyse. For yderligere endocannabinoid analyse, fortsæt med næste trin.Tag en alikvote af lipidekstraktet, fordamp til tørhed og rekonstituere i acetonitrilvand. For at udføre dobbelt ekstraktion af RNA og lipider og coextraktion af phospholipider og endocannabinoider fra vævsprøver, optø vævspulver aliquots eller hjernebundter ved 4 grader Celsius. Tilsæt vævet til ekstraktionsrør med keramiske perler.Derefter tilsættes 600 mikroliter RLT-buffer sammen med 200 mikroliter chloroform. For phospholipid og endocannabinoid coextraktion, spike prøver med 10 mikroliter intern standardblanding og homogeniseres ved høj hastighed i 20 sekunder. Overfør homogeniserede prøver til nye centrifugerør og centrifuge i fem minutter ved fuld hastighed og 4 grader Celsius for at muliggøre faseadskillelse.Overfør den øverste fase til et nyt rør til RNA-ekstraktion ved hjælp af et standardsæt. Elute ekstraheret RNA i et samlet volumen på 50 mikroliter RNase-frit vand og opbevar det ved 80 grader Celsius. Til lipidekstraktion tilsættes 800 mikroliter MTBE/methanol og 200 mikroliter 0,1 % myresyre til den nedre chloroformholdige fase.Vortex i 45 minutter ved 4 grader Celsius. Overfør den øvre organiske fase til et nyt rør. Fordamp det under en blid strøm af nitrogen ved 37 grader Celsius.For yderligere LC / MS-analyse rekonstitueres prøven i 90 mikroliter methanol og opbevares ved 20 eller 80 grader Celsius eller straks fortsættes til analyse. For yderligere endocannabinoid analyse, fortsæt med næste trin. Tag en alikvote af lipidekstraktet, fordamp til tørhed og rekonstituere i acetonitrilvand.Derefter injiceres 20 mikroliter i LC / MS til endocannabinoid analyse. Kainsyreinduktion af akutte epileptiske anfald førte til en maksimal anfaldsintensitet en time efter injektionen. Lipidomisk profilering af endocannabinoider og eicosanoider samt phospholipider og endocannabinoider viser lipidniveauændringer på tværs af hjernebarken, striatum, thalaminområdet, hippocampus, hypothalamus, cerebellum samt hjerte- og lungevæv i kainsyreinducerede epileptiske mus og kontroller.Efter dobbelt ekstraktion af phospholipider og endocannabinoider og RNA til kvantitativ profilering af musehjerneslag blev den kvantitative fordeling af lipider i hypothalamus, basolateral amygdala og den ventrale og dorsale hippocampus analyseret. Relative ekspressionsniveauer af endogene enzymer og receptorer involveret i lipidsignalering samt markører for hjerneaktivitet undersøgt på mRNA-niveau i forskellige hjerneområder og subregioner fra mus, der udsættes for kainsyreinduceret epileptisk anfald og kontrol. Kainsyreinduceret epilepsi forårsagede massivt tab af NeuN-signal, overvejende i CA1-, CA3- og hilus-regionen i hippocampus, ledsaget af apoptotiske hændelser indikeret af caspase-3-signal sammenlignet med de kontrolsaltindsprøjtede mus.Efter behandling med subkronisk palmitoylethanolamid blev neuronale kerneproteinsignal mærkbart bevaret, og CASP3-signalet var næppe detekterbart. Hjernestansning og dissektion af diskrete hjerneområder er ret udfordrende og kræver fine færdigheder for at opnå ensartet prøveudtagning på tværs af flere kohorter. Derfor anbefales det stærkt at øve sig på testorganer og godt kendskab til hjernemorfologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Måling af total calcium i neuroner ved Electron Probe røntgen Microanalysis

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic Funktionel MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Måling fremadskridende neurologisk handicap i en musemodel af multipel sklerose

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Måling af Synaptic vesikel endocytose i kulturperler hippocampus neuroner

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Oprettelse af musemodeller for Zika Virus-induceret neurologiske lidelser ved hjælp af intracerebralt injektion strategier: embryonale, Neonatal og voksne

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

En objektiv og reproducerbare Test af olfaktoriske læring og diskrimination i mus

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging og kvantificering af hurtig dendritiske gren dynamik i at udvikle Drosophila neuroner

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

In vitro modellering for neurologiske sygdomme ved hjælp af direkte konvertering fra fibroblaster til neuronale stamceller og differentiering til astrocytter

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...