Name: lipidomics and transcriptomics in neurological diseases
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases at JoVE.com

Dedicamos este artigo à Dra. Durante a finalização deste manuscrito, a Dra. Ela é a personificação da paixão pela ciência e do engajamento altruísta no trabalho em equipe para cumprir um propósito significativo de pesquisa. Ela sempre sonhou em contribuir significativamente para o maior bem-estar dos humanos. Sua natureza de bom coração nunca foi comprometida pelas estradas extenuantes da ciência e da vida. Ela permanecerá inestimável, e para sempre, em nossos corações.
Julia M. Post foi financiada pelo Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) no University Medical Center da Johannes Gutenberg University Mainz e atualmente é financiada pelo projeto SPP-2225 EXIT para LB. Raissa Lerner foi parcialmente financiada pelo projeto DZHK 81X2600250 para LB e Lipidomics Core Facility. O financiamento parcial para esses estudos foi fornecido pelo Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry, e intramural funds (to LB) do Centro Médico Universitário da Universidade Johannes Gutenberg Mainz.

Todos os procedimentos experimentais aqui descritos estão de acordo com a Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia de 22 de Setembro de 2010 (2010/63EU) e foram aprovados pelo comitê local de animais da Renânia-Palatinado do estado da Alemanha (referência de arquivo: 23 177-07/G16-1-075).
1. Modelo animal de epilepsia induzida por KA aguda e profilaticamente tratada
<ol><li>Realizar indução de convulsão, tratamento e pontuação comportamental.<ol>
<li>Camundongos separados (n mín...

<ol>
	<li>Aronica, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammatory+targets+and+treatments+for+epilepsy+validated+in+experimental+models.">Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models.</a> Epilepsia. 58, 27-38 (2017).</li><li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry.">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li><li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes.">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li><li>Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+analytical+methods+for+eicosanoids+in+brain+tissue.">A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).</li><li>Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+determination+of+23+eicosanoids.">Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li><li>L&#233;vesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration.">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li><li>Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-Neuron+Communication+in+Epilepsy.">Microglia-Neuron Communication in Epilepsy.</a> Glia. 65 (1), 5-18 (2017).</li><li>Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kainic+acid-induced+neurodegenerative+model:+Potentials+and+limitations.">Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).</li><li>Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+&#945;-CGRP+in+the+regulation+of+neurotoxic+responses+induced+by+kainic+acid+in+mice.">Role of &#945;-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice.</a> Peptides. 44, 158-162 (2013).</li><li>Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+lipidomic+and+transcriptional+changes+of+prophylactic+PEA+administration+in+control+mice.">Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).</li><li>Post, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiepileptogenic+Effect+of+Subchronic+Palmitoylethanolamide+Treatment+in+a+Mouse+Model+of+Acute+Epilepsy.">Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).</li><li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death:+Implications+for+gene+targeting+approaches.">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li><li>Monory, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endocannabinoid+System+Controls+Key+Epileptogenic+Circuits+in+the+Hippocampus.">The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus.</a> Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).</li><li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.">The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rondent+Brain+Regions.">Dissection of Rondent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).</li><li>Gross, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+lipidomics+through+space+and+time.">The evolution of lipidomics through space and time.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Abbott, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+lipid+extraction+method+for+the+analysis+of+human+brain+lipids.">An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids.</a> Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li></ol>

A metodologia neurolipidômica e transcriômica descrita aqui é uma média viável para investigar qualquer doença ou desenvolvimento saudável em alta e baixa resolução espacial no cérebro e órgãos periféricos. Devido aos procedimentos otimizados de amostragem e manuseio de plasma, a análise lipidômica plasmática também pode ser realizada a partir dos mesmos animais sacrificados por lipidemia tecidual e transcrição, melhorando assim a confiabilidade dos correlatos moleculares do sangue tecidual e da descob...

Avanços recentes na função dos lipídios e seu papel no surgimento e progressão de doenças neurológicas abrem novos locais de pesquisa e desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e elucidação de mecanismos de doença1. Diferenças documentadas na composição lipídica em diferentes regiões cerebrais, enfatizadas por técnicas modernas de imagem molecular, como imagem de espectrometria de massa e perfil avançado de espectrometria de massa, muda o paradigma da investigação lipídica de todo o cérebro para regiões cerebrais funcionalmente distintas e discretas. O fato de que a composição lipídica varia em diferentes regiões cerebrais leva a nova conceituação tanto da sensibilidade lipídica da membrana quanto da sinalização lipídica a jusante em resposta a um insulto cerebral ou estímulos através das regiões cerebrais funcionalmente distintas. Assim, os protocolos lipídes exigem novos desenvolvimentos para enfrentar o desafio de baixas quantidades teciduais para maior detecção e quantificação de resolução espacial, e, simultaneamente, análise de múltiplos componentes lipídides de membranas celulares e vias de sinalização. Além disso, a determinação de enzimas, ligantes lipídicos e receptores envolvidos na regulação de seus níveis e funções é primordial para elucidar as vias de sinalização afetadas em uma doença neurológica e orientar novas investigações mecanicistas em um contexto fisioterológico.
Além do aumento da resolução espacial cerebral, há duas grandes dificuldades que desafiam o desenvolvimento de novas abordagens neurolipdómicas. Primeiro, as moléculas de sinalização lipídica são tipicamente de baixa abundância em comparação com lipídios constitutivos de membrana. Em segundo lugar, o lipidome apresenta uma alta heterogeneidade estrutural, difícil de dissecar usando uma única abordagem analítica. Assim, os métodos de extração e analítica são adaptados a diferentes categorias lipídicas e comumente realizados em amostras de tecidos distintos2. Métodos lipídmicos de espingarda3 são excelentes ferramentas para revelar rapidamente um amplo perfil de lipídios de membrana, enquanto o aumento da sensibilidade e seletividade proporcionados pela descoberta e quantificação de massa spectrométricas são capitalizados para a investigação de lipídios de sinalização de baixa oferta, incluindo: i) lipídios inflamatórios e ii) lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como endocanabinóides (eCBs), lipídios ligados a amino- etc.4,5. Para abranger alterações lipídicas tanto na membrana celular quanto no nível de sinalização ocorrendo em regiões cerebrais de modelos de doenças neurológicas, tipicamente a extração e análise lipídica são realizadas em amostras de tecidos distintos, obtidas de diferentes lotes animais ou de diferentes hemisférios, ou dissecando uma região de tecido maior em múltiplos pedaços. Quando os níveis de mRNA de receptores enzimáticos também são de interesse, sua investigação normalmente requer a aquisição de uma amostra de tecido distinta. Por exemplo, a investigação de lipídios de membrana, canabinoides endógenos e mRNA exigiria três amostras diferentes de tecido, (por exemplo, duas amostras para os dois métodos de extração lipídica-lipídios-lipídios e lipídios de sinalização - e subsequentes dois métodos de análise lipídica - e uma amostra para análise mRNA). A investigação de lipídios inflamatórios e canabinoides endógenos requerem duas amostras de tecido distintas, métodos de extração e métodos de análise, respectivamente. Outro exemplo é a investigação de mRNA e de qualquer categoria lipídica em uma amostra de perfuração cerebral ou microdissecção a laser que, consequentemente, requer dois animais distintos para obter duas amostras por cérebro (sub)região. Uma extensão substancial de variabilidade e/ou baixa reprodutibilidade dos resultados ocorre frequentemente nesses casos, originária de variabilidade biológica e/ou heterogeneidade tecidual. Guiado por essas limitações práticas da análise multimolecular, ocorrendo particularmente em alta resolução espacial no cérebro, foi projetado um protocolo de neurolipidomia de três módulos englobando: 1) coextração e co-análise por LC/MRM de lipídios inflamatórios (por exemplo, eicosanoides (EI)) e lipídios envolvidos na modulação da atividade neuronal, como eCBs2; 2) co-extração de fosfolipídios (PLs) e eCBs com análise subsequente de LC/MRM multiscan e análise de varredura de perdas precursoras/neutras2; e 3) extração dupla de membrana (fosfo)lipídios e eCBs, bem como mRNA, com análise subsequente de sequenciamento de LC/MRM e qPCR ou RNA6. Dependendo da questão biológica a ser abordada em uma doença neurológica e na região de interesse cerebral, uma combinação do primeiro e do segundo protocolo, ou o primeiro e o terceiro protocolo, podem ser aplicados na mesma amostra de tecido para tecidos que pesam cerca de 4 mg. O primeiro e o terceiro protocolos podem ser aplicados independentemente para tecidos em torno de 2 mgs. O segundo protocolo pode ser aplicado para tecidos pesando apenas 0,5 mgs. Independentemente do módulo de protocolo neurolipdidomático selecionado, a amostragem de tecidos e processamento pré-analítico, o isolamento cerebral e a dissecção da região, bem como o procedimento para o sacrifício do modelo animal são padronizados e idênticos para os três módulos do protocolo. Em nossa investigação de doenças neurológicas, órgãos periféricos relevantes para as consequências patológicas da doença também são sempre coletados e analisados por meio desses protocolos modulares. Além disso, o sangue é regularmente amostrado para lipidomia plasmática para servir como uma ferramenta de leitura de doenças neurológicas com uma visão sobre aplicações translacionais prospectivas. O protocolo de lipidomia modular aqui apresentado é muito versátil: escalável a maiores quantidades de tecido e facilmente aplicável para praticamente qualquer tipo de tecido e doença. Para a aplicação do protocolo modular (Figura 1), em doenças neurológicas, qualquer modelo padronizado de início e progressão de distúrbios neurológicos, como lesão cerebral traumática, doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou epilepsia são amenáveis.
Esses protocolos têm sido extensivamente aplicados para estudar alterações no lipidome tecidual e/ou transcriptome na fase aguda da epilepsia no modelo de camundongo induzido por ácido kainico (KA) de epilepsia2,7, um modelo amplamente utilizado em estudos pré-clínicos devido à semelhança com a epilepsia do lobo temporal humano (TLE)8,9,10,11. Utilizando esses protocolos, o potencial terapêutico de drogas como Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 foi avaliado no mesmo modelo de camundongos de epilepsia. O estudo identificou alterações lipídicas e mRNA em alta e baixa resolução espacial no cérebro e na periferia, no ponto de tempo de intensidades máximas agudas de convulsão aguda (em 60 min de indução pós-doutorado), e sobre o tratamento subcrônico e agudo com PEA em quatro pontos de tempo diferentes (20, 60, 120 e 180 min) pós-indução de convulsão ka, uma janela de tempo cobrindo a fase aguda de epilepsia. Foram coletados em cada momento os camundongos injetados por KA, camundongos tratados com PEA, agudos e subchamados, bem como camundongos de controle de veículos e veículos pea, coletados em cada ponto12,13, e investigados com essa análise molecular. Os dados moleculares foram correlacionados com fenótipos comportamentais obtidos pela pontuação de convulsões, bem como com dados derivados da imunohistoquímica em processos neurodegenerative, a fim de desvendar a progressão da fase aguda de epilepsia e o potencial do PEA para aliviá-lo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007248-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay334570-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200 series LC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 334230</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Real-Time PCR cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amber eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst 1.6.2 Software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic Acid-d8 MS Standard</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay-10007277</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessmann Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bino</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved Caspase 3 antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat, Leica CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTC HTC PAL autosampler</td>
			<td>CTC Analytics AG</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Curved Forceps Dumoxel #7</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1000 A R&#246;hrchen</td>
			<td>Kabe Labortechnik</td>
			<td>078001</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP-1 EconoPump</td>
			<td>BioRAD</td>
			<td>700BR07757</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps Mirror Finish</td>
			<td>FST</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors straight sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissor Tungsten Carbide straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>14568-09</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spatulae</td>
			<td>FST</td>
			<td>10094-13</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainic acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120100</td>
			<td>Epileptic drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid View software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 17:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855676P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855775P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna 2,5&#181;m C18(2)- HAST 100A LC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00D-4446-B0</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying lamp</td>
			<td>Maul GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Camara</td>
			<td>Motic</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34875-1L</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiQuant 3.0 quantitation software package</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840857P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1404</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay90350-100</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide-d5</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay9000573-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1004</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850757P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1104</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1204</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1504</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precelleys 24</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Keramik-K&#252;gelchen</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-pcs-ck14p</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Stahlkugeln 2,8mm</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PCS-MK28P</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys-keramik-kit 1,4 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 12010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 312010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007211-1</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2-d9</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10581-50</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1304</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>AU111609004</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real Time PCR System</td>
			<td>Appliert Biosystem</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resolvin D1</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10012554-11</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Security Guard precolumn</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon coverplates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>72110017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon slide rack and lid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>73310017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>860586P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM d18:1/12:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-2312</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forceps straight Smooth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11016-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3000 Thermocycler</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay19030-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay319030-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen/ Retsch</td>
			<td>12120240804</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidinblau</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0300.2</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapotherm</td>
			<td>Barkey</td>
			<td>4004734</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasser LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidomics and transcriptomics in neurological diseases

Os lipídios servem como a interface primária para insultos cerebrais ou estímulos propícios a doenças neurológicas e são um reservatório para a síntese de lipídios com várias sinalizações ou função de ligantes que podem ressaltar o aparecimento e progressão de doenças. Muitas vezes mudando no nível pré-attomático, lipídios são uma fonte emergente de alvos de drogas e biomarcadores. Muitas doenças neurológicas exibem neuroinflamação, neurodegeneração e excitabilidade neuronal como marcas comuns, parcialmente moduladas por sistemas específicos de sinalização lipídica. A interdependência e inter-relação da síntese de vários lipídios leva a uma análise multilímida, multinzimida e multirreceptora, a fim de derivar as semelhanças e especificidades dos contextos neurológicos e acelerar o desenrolar de aspectos mecanicistas do início e da progressão da doença. Atribuir papéis lipídes a regiões cerebrais distintas avança na determinação do fenótipo molecular lipídeto e da morfologia associados a uma doença neurológica.
Apresentado aqui é um protocolo modular adequado para a análise de lipídios de membrana e sinais lipídes a jusante, juntamente com mRNA de enzimas e mediadores subjacentes à sua funcionalidade, extraídos de regiões cerebrais discretas que são relevantes para uma determinada doença neurológica e/ou condição. Para garantir um perfil lipidômico comparativo preciso, os fluxos de trabalho e os critérios operacionais foram otimizados e padronizados para: i) amostragem cerebral e dissecção de regiões de interesse, ii) co-extração de múltiplos sinais lipídicos e lipídios de membrana, iii) extração lipídica/mRNA dupla, iv) quantificação por monitoramento de reação múltipla de cromatografia líquida (LC/MRM) e v) perfil de mRNA padrão. Este fluxo de trabalho é favorável às baixas quantidades teciduais obtidas pela amostragem das sub-regiões cerebrais funcionalmente discretas (ou seja, por perfuração cerebral), impedindo assim o viés na análise multimolecular devido à heterogeneidade tecidual e/ou variabilidade animal. Revelar consequências periféricas de doenças neurológicas e estabelecer leituras moleculares translacionais de estados de doenças neurológicas, amostragem de órgãos periféricos, processamento e sua análise lipidómica subsequente, bem como lipidómica plasmática, também são perseguidos e descritos. O protocolo é demonstrado em um modelo agudo de camundongos de epilepsia.

O conjunto de protocolos descritos pode ser combinado em diferentes níveis de forma específica do objetivo, como escolha de modelo animal, rota de amostragem, método de extração e perfil (Figura 1).
A fim de determinar mudanças lipídicas no cérebro e na periferia ao longo de um curso de tempo de um estado de convulsão epiléptica aguda e para desvendar o potencial efeito antiepiléptico13 d...

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Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

Este artigo apresenta um protocolo modular para lipidômica tecidual e transcriptômica, e lipidomias plasmáticas em modelos de camundongos de doenças neurológicas que visam lipídios subjacentes à inflamação e atividade neuronal, lipídios de membrana, mensageiros a jusante e enzimas/receptores de codificação de mRNA. São delineados procedimentos de amostragem, processamento de amostras, extração e quantificação.

Lipidomics e Transcriptomics em Doenças Neurológicas

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

Este protocolo modular permite explorar múltiplos eventos moleculares realizados por lipídios estruturais e sinalizadores, e/ou RNAs, em regiões discretas de tecido e no sangue com uma melhor saída quantitativa e qualitativa de dados por amostra. O método é aplicável a qualquer modelo experimental, e também pode ser aplicado a amostras de tecido humano e sangue. Demonstrando o procedimento estarão Claudia Schwitter, técnica, Julia Post, estudante de pós-graduação, e Raissa Lerner, pós-doutora do meu grupo.Para começar, tome cérebros congelados previamente isolados, inteiros e congelados de camundongos com epilepsia aguda e profiliamente tratada com ácido kainico. Monte os cérebros no sistema de montagem do criostat. Ajuste a espessura para 50 micrômetros e corte o cérebro no modo de corte perto da região de interesse.Ao se aproximar da região de interesse, coloque a espessura entre 18 e 20 micrômetros. Para localização da sub-região de interesse, colora fatias cerebrais usando azul toluidina. Use um microscópio para inspecionar as fatias manchadas para identificar as regiões de interesse a serem perfuradas, e use um atlas de rato como referência para encontrar as regiões anatômicas cerebrais apropriadas.Use corers de amostra para levar socos de 0,8 a 1,0 milímetros de diâmetro. Transfira os socos para endocanabinóides e coextrações eicosanoides em tubos âmbar pré-resfriados de 2 mililitros com sete bolas de aço pré-resfriadas por tubo. Para fosfolipídios e endocanabinóides coextração, dupla lipídica e co-extração de RNA, transfira os socos em tubos de extração sem RNase de 2 mililitros com contas de cerâmica.Pesar socos congelados na sala fria e imediatamente proceder com extração ou congelamento a 80 graus Celsius. Para realizar a coextração lipídica líquido-líquido de endocanabinóides e eicosanoides de pedaços cerebrais, socos ou amostras de pó de tecido, coloque os tubos de extração contendo as amostras de tecido e sete bolas de aço no gelo. Adicione 600 microliters de MTBE gelado e 50 microlitres de água acetonitrila contendo os padrões internos.Depois de adicionar 400 microliters de ácido fórmico molar 0,1, use um liser tecidual para homogeneizar por 30 segundos a 1 minuto. Centrifugar este homogeneizar por 15 minutos a 5.000 vezes g a 4 graus Celsius. Coloque-o no congelador por 10 minutos a 80 graus Celsius para congelar a fase inferior aquosa, o que facilitará a transferência da fase orgânica superior.Transfira a fase orgânica superior para novos tubos âmbar de 1,5 mililitro, evapora sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, reconstitua em 50 microliters de água acetonitrila para análise posterior. Armazene a fase aquosa a 20 ou 80 graus Celsius para análise adicional de teor de proteínas. Para coextratar endocanabinóides e eicosanoides de amostras de plasma, coloque as amostras de plasma congelados no gelo e deixe-as descongelar completamente.Adicione 800 microliters de MTBE e 50 microliters de água acetonitrila contendo os padrões internos otimizados para o espetamento usando amostras de plasma de referência. Adicione 600 microliters de ácido fórmico de 0,1 molar e vórtice a 4 graus Celsius por 2 minutos. Centrifugar as amostras a 4.000 vezes g por 15 minutos a 4 graus Celsius.Transfira a fase orgânica para novos tubos. Evapora-o sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius, e depois reconstitui-o com 50 microliters de água acetonitrila para análise de monitoramento de reação múltipla de cromatografia líquida. Para realizar a coextração de fosfolipídios e endocanabinóides de regiões cerebrais, socos ou outras amostras de pó de tecido, coloque os tubos de extração contendo amostras de tecido e contas de cerâmica no gelo.Adicione 800 microliters de metil tert-butil e mistura de metanol e 10 microliters de metanol contendo os padrões internos. Em seguida, adicione 200 microliters de ácido fórmico de 0,1% contendo 25 micromolar de tetrahidrolipstatina/URB597 e 50 microgramas por mililitro de BHT. Após homogeneizar com um homogeneizador de tecido, centrífuga a 5.000 vezes g e 4 graus Celsius por 15 minutos.Transfira a fase orgânica superior em novos tubos, evapore sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius, e depois reconstitua este extrato lipídico com 90 microliters de metanol. Se prosseguir imediatamente, adicione 10% de água a uma alíquota de extrato lipíduo e injete 10 microliters na LC/MS para análise fosfolipídica. Para uma análise mais endocanabinoide, prossiga com o próximo passo.Pegue uma alíquota do extrato lipídico, evapore até o ressecamento e reconstitua em água de acetonitrila. Para realizar a extração dupla de RNA e lipídios e coextração de fosfolipídios e endocanabinóides de amostras de tecido, descongelar alíquotas de pó de tecido ou cachos cerebrais a 4 graus Celsius. Adicione o tecido aos tubos de extração com contas de cerâmica.Em seguida, adicione 600 microliters de tampão RLT juntamente com 200 microliters de clorofórmio. Para coextração fosfolipídida e endocanabinóide, espetar amostras com 10 microliters de mistura padrão interna e homogeneizar em alta velocidade por 20 segundos. Transfira amostras homogeneizadas em novos tubos de centrífuga e centrífuga por cinco minutos a toda velocidade e 4 graus Celsius para permitir a separação da fase.Transfira a fase superior para um tubo fresco para extração de RNA usando um kit padrão. Elute extraiu RNA em um volume total de 50 microliters de água sem RNase e armazena-lo a 80 graus Celsius. Para extração lipídica, adicione 800 microliters de MTBE/metanol e 200 microlitres de ácido 0,1% paramórmico à fase mais baixa que contenha clorofórmio.Vórtice por 45 minutos a 4 graus Celsius. Transfira a fase orgânica superior para um novo tubo. Evaporar-o sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius.Para posterior análise de LC/MS, reconstitua a amostra em 90 microliters de metanol e armazene-a a 20 ou 80 graus Celsius, ou proceda imediatamente à análise. Para uma análise mais endocanabinoide, prossiga com o próximo passo. Pegue uma alíquota do extrato lipídico, evapore até o ressecamento e reconstitua em água de acetonitrila.Em seguida, injete 20 microliters na LC/MS para análise endocanabinoide. A indução de ácido kainico de convulsões epilépticas agudas levou a uma intensidade de convulsão máxima de uma hora após a injeção. O perfil lipidomico de endocanabinóides e eicosanoides, bem como fosfolipídios e endocanabinóides, mostra alterações lipídicas no córtex cerebral, estriado, região tálamo, hipocampo, hipotálamo, cerebelo, bem como tecido cardíaco e pulmonar em camundongos e controles epilépticos induzidos por ácido kainico.Após a extração dupla de fosfolipídios e endocanabinóides e RNA para perfil quantitativo de socos cerebrais de camundongos, analisou-se a distribuição quantitativa de lipídios no hipotálamo, amígdala basolateral e hipocampo ventral e dorsal. Níveis de expressão relativa de enzimas e receptores endógenos envolvidos na sinalização lipídica, bem como marcadores para atividade cerebral investigados no nível mRNA em diferentes regiões cerebrais e sub-regiões de camundongos submetidos a convulsões e controles epilépticos induzidos por ácido kainico. A epilepsia induzida por ácido kainico causou perda maciça de sinal de NeuN, predominantemente na região de CA1, CA3 e hilus do hipocampo, acompanhada por eventos apoptóticos indicados pelo sinal caspase-3 em comparação com o controle de camundongos injetados em soro fisiológico.Após o tratamento com palmitoylethanolamida subcrática, o sinal de proteína dos núcleos neuronais foi visivelmente preservado e o sinal CASP3 mal foi detectável. Socos cerebrais e dissecção de áreas cerebrais discretas são bastante desafiadores e requerem habilidades finas para obter amostragem consistente em várias coortes. Portanto, a prática em órgãos de teste e o bom conhecimento da morfologia cerebral são altamente recomendados.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Optogenetic Functional MRI

Ressonância magnética funcional optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Modelagem in vitro para doenças neurológicas usando conversão direta de fibroblastos para células progenitoras neuronais e diferenciação em astrócitos

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...