Name: lipidomics and transcriptomics in neurological diseases
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases at JoVE.com

Vi tillägnar den här artikeln till Dr. Ermelinda Lomazzo. Under färdigställandet av detta manuskript gick Dr. Ermelinda Lomazzo bort. Hon är förkroppsligandet av passion för vetenskap och osjälviskt engagemang i teamarbete för att uppfylla ett meningsfullt forskningsändamål. Hon drömde alltid om att bidra meningsfullt till människors större välbefinnande. Hennes godhjärtade natur komprometterades aldrig av vetenskapens och livets ansträngande vägar. Hon kommer att förbli ovärderlig, och för evigt, i våra hjärtan.
Julia M. Post finansierades av Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) vid University Medical Center vid Johannes Gutenberg University Mainz och finansieras för närvarande av SPP-2225 EXIT-projektet till LB. Raissa Lerner finansierades delvis av DZHK-projektet 81X2600250 till LB och Lipidomics Core Facility. Partiell finansiering för dessa studier tillhandahölls av Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry och Intramural fonder (till LB) från University Medical Center vid Johannes Gutenberg University Mainz.

Alla försöksförfaranden som beskrivs här är i enlighet med Europeiska gemenskapens rådsdirektiv av den 22 september 2010 (2010/63EU) och godkändes av den lokala djurkommittén i delstaten Rheinland-Pfalz, Tyskland (filreferens: 23 177-07/G16-1-075).
1. Djurmodell av akut och profylaktiskt behandlad KA-inducerad epilepsi
<ol><li>Utför beslag induktion, behandling och beteendemässiga poängsättning.<ol>
<li>Separata möss (minst n = 6 möss per grupp) i enstaka burar.</li>
		<li>För...

<ol>
	<li>Aronica, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammatory+targets+and+treatments+for+epilepsy+validated+in+experimental+models.">Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models.</a> Epilepsia. 58, 27-38 (2017).</li><li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry.">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li><li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes.">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li><li>Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+analytical+methods+for+eicosanoids+in+brain+tissue.">A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).</li><li>Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+determination+of+23+eicosanoids.">Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).</li><li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls.">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li><li>L&#233;vesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration.">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li><li>Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-Neuron+Communication+in+Epilepsy.">Microglia-Neuron Communication in Epilepsy.</a> Glia. 65 (1), 5-18 (2017).</li><li>Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kainic+acid-induced+neurodegenerative+model:+Potentials+and+limitations.">Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).</li><li>Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+&#945;-CGRP+in+the+regulation+of+neurotoxic+responses+induced+by+kainic+acid+in+mice.">Role of &#945;-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice.</a> Peptides. 44, 158-162 (2013).</li><li>Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+lipidomic+and+transcriptional+changes+of+prophylactic+PEA+administration+in+control+mice.">Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).</li><li>Post, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiepileptogenic+Effect+of+Subchronic+Palmitoylethanolamide+Treatment+in+a+Mouse+Model+of+Acute+Epilepsy.">Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).</li><li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death:+Implications+for+gene+targeting+approaches.">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li><li>Monory, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endocannabinoid+System+Controls+Key+Epileptogenic+Circuits+in+the+Hippocampus.">The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus.</a> Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).</li><li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.">The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rondent+Brain+Regions.">Dissection of Rondent Brain Regions.</a> Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).</li><li>Gross, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+lipidomics+through+space+and+time.">The evolution of lipidomics through space and time.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine.">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li><li>Abbott, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+lipid+extraction+method+for+the+analysis+of+human+brain+lipids.">An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids.</a> Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li></ol>

Den neurolipidomic och transkriptomic metodik beskrivs här är ett livskraftigt sätt att undersöka någon sjukdom eller hälsosam utveckling vid hög och låg rumslig upplösning i hjärnan och perifera organ. På grund av de optimerade plasmaprovtagnings- och hanteringsförfarandena kan plasmalipidsanalys också utföras från samma djur som offrats för vävnadslipis och transkriptomik, vilket förbättrar tillförlitligheten hos vävnadsblodmolekyler och biomarkörupptäckt. Tillhandahållandet av en bred uppsättn...

De senaste framstegen i lipidernas funktion och deras roll i uppkomsten och progressionen av neurologiska sjukdomar öppnar nya forsknings- och utvecklingsplatser för nya terapeutiska mål och sjukdomsmekanismer klargörande1. Dokumenterade skillnader i lipidsammansättning i olika hjärnregioner, betonade av moderna molekylära bildframställningstekniker som masspektrometri imaging och avancerad masspektrometri profilering, skiftar paradigmet för lipid undersökning från hela hjärnan mot funktionellt distinkta och diskreta hjärnregioner. Det faktum att lipidsammansättning varierar i olika hjärnregioner föranleder ny konceptualisering av både membranfettkänslighet och nedströms lipidsignalering som svar på en hjärnförolämpning eller stimuli över de funktionellt distinkta hjärnregionerna. Därför kräver lipidprotokoll ny utveckling för att ta itu med utmaningen med låga vävnadsmängder för högre rumslig upplösning upptäckt och kvantifiering, och samtidigt analys av flera lipidkomponenter i cellmembran och signalvägar. Också, bestämning av enzymer, lipid ligands, och receptorer som är involverade i regleringen av deras nivåer och funktion är av största vikt för att klargöra signalvägarna som påverkas i en neurologisk sjukdom och vägleda nya mekanistiska undersökningar i ett patofysiologiskt sammanhang.
Förutom den ökade hjärnans rumsliga upplösning finns det två stora svårigheter som utmanar utvecklingen av nya neurolipidomic metoder. För det första är lipidsignaleringsmolekylerna vanligtvis av mycket lågt överflöd jämfört med membrankonstituerande lipider. För det andra uppvisar lipidomet en hög strukturell heterogenitet, svår att dissekera med ett enda analytiskt tillvägagångssätt. Därför är extraktions- och analysmetoder skräddarsydda för olika lipidkategorier och utförs ofta i distinkta vävnadsprover2. Hagelgevär lipidomiska metoder3 är utmärkta verktyg för att snabbt avslöja en bred profil av membranfetter, medan ökad känslighet och selektivitet som erbjuds av de riktade metoderna för upptäckt och kvantifiering av masspektrometri utnyttjas för undersökning av låga rikliga signallipider inklusive: i) inflammatoriska lipider och ii) lipider som är involverade i modulering av neuronal aktivitet, såsom endocannabinoider (eCBs), aminosyralänkade lipider, etc.4,5. För att omfatta lipidförändringar vid både cellmembranet och signalnivån som förekommer i hjärnregioner av neurologiska sjukdomsmodeller utförs vanligtvis lipidutvinning och analys i distinkta vävnadsprover, erhållna från distinkta djurpartier eller från olika halvklot, eller genom att dissekera en större vävnadsregion i flera bitar. När mRNA-nivåer av enzymreceptorer också är av intresse, kräver deras undersökning vanligtvis upphandling av ett distinkt vävnadsprov. Till exempel skulle undersökningen av membranfetter, endogena cannabinoider och mRNA kräva tre olika vävnadsprover (t.ex. två prover för de två lipidutvinningsmetoderna-membranlipider och signalerande lipider - och efterföljande två lipidanalysmetoder - och ett prov för mRNA-analys). Undersökning av inflammatoriska lipider och endogena cannabinoider kräver två distinkta vävnadsprover, extraktionsmetoder respektive analysmetoder. Ett annat exempel är undersökningen av mRNA och av alla lipidkategorier i en hjärnstans eller lasermikrodissectionprov som följaktligen kräver två distinkta djur för att anskaffa två prover per hjärna (sub)region. En betydande grad av variabilitet och/eller dålig reproducerbarhet av resultaten förekommer ofta i sådana fall, med ursprung i biologisk variabilitet och/eller vävnads heterogenitet. Vägledd av dessa praktiska begränsningar av multimolekylär analys, som förekommer särskilt vid hög rumslig upplösning i hjärnan, utformades ett tremoduls neurolipidomics protokoll som omfattar: 1) samextring och samanalys av LC/MRM av inflammatoriska lipider (t.ex. eicosanoids (ecs)) och lipider som är involverade i modulering av neuronal aktivitet, såsom eCBs2; 2) samextraktion av fosfolipider (PLs) och eCBs med efterföljande multiscan LC/MRM och analys av prekursor/neutral förlustskanning2; och 3) dubbel extraktion av membran (fospho)lipider och eCB samt mRNA, med efterföljande LC/MRM och qPCR- eller RNA-sekvenseringsanalys6. Beroende på den biologiska fråga som ska tas upp vid en neurologisk sjukdom och hjärnregionen av intresse kan en kombination av det första och det andra protokollet, eller det första och det tredje protokollet, tillämpas på samma vävnadsprov för vävnader som väger cirka 4 mg. Det första och tredje protokollet kan tillämpas självständigt för vävnader runt 2 mg. Det andra protokollet kan tillämpas för vävnader som väger så lite som 0,5 mg. Oavsett vilken neurolipidomisk protokollmodul som valts är vävnadsprovtagning och föranalysbehandling, hjärnisolering och region dissekering, liksom förfarandet för att offra djurmodellen standardiserade och identiska för alla tre modulerna i protokollet. I vår undersökning av neurologiska sjukdomar samlas perifera organ som är relevanta för sjukdomens patologiska konsekvenser alltid också in och analyseras med hjälp av dessa modulära protokoll. Dessutom provtas blod regelbundet för plasmafetter för att fungera som ett avläsningsverktyg för neurologiska sjukdomar med tanke på framtida translationella tillämpningar. Det här presenterade modulära lipidomics protokollet är mycket mångsidigt: skalbar till större vävnad mängder och lätt tillämplig för praktiskt taget alla vävnad typ och sjukdomar. För tillämpning av modulprotokollet (Bild 1) vid neurologiska sjukdomar är alla standardiserade gnagare modeller av debut och progression av neurologiska störningar, såsom traumatisk hjärnskada, Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom eller epilepsi mottagliga.
Dessa protokoll har tillämpats i stor utsträckning för att studera förändringar i vävnadsfettsom och/eller transkriptom i den akuta fasen av epilepsi i kainisk syra (KA)-inducerad musmodell av epilepsi2,7, en modell som ofta används i prekliniska studier på grund av likheten med human temporallob epilepsi (TLE)8,9,10,11. Med hjälp av dessa protokoll bedömdes den terapeutiska potentialen hos läkemedel som Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 i samma musmodell av epilepsi. Studien identifierade lipid- och mRNA-förändringar vid hög och låg rumslig upplösning i hjärnan och periferin, vid tidpunkten för maximal akut anfallsintensitet (vid 60 min posteizureinduktion) och vid subkronisk och akut behandling med PEA vid fyra olika tidpunkter (20, 60, 120 och 180 min) efter KA-anfallsinduktion, ett tidsfönster som täcker den akuta fasen av epilepsi. Plasma, hjärnor och perifera organ hos obehandlade KA-injicerade möss, akut och subkroniskt PEA-behandlade möss, liksom fordon och PEA-fordon kontroll möss, samlades in vid varje tidpunkt12,13, och undersöktes med denna molekylära analys. De molekylära data var korrelerade med beteendemässiga fenotyper som erhållits genom beslag poäng, liksom med immunohistochemistry-härledda data om neurodegenerativa processer, för att nysta upp progressionen av den akuta epilepsi fasen och PEA potential att lindra det.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007248-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay334570-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200 series LC System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE-d8</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 334230</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI 7300 Real-Time PCR cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amber eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst 1.6.2 Software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachidonic Acid-d8 MS Standard</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay-10007277</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessmann Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bino</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved Caspase 3 antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat, Leica CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTC HTC PAL autosampler</td>
			<td>CTC Analytics AG</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Curved Forceps Dumoxel #7</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1000 A R&#246;hrchen</td>
			<td>Kabe Labortechnik</td>
			<td>078001</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP-1 EconoPump</td>
			<td>BioRAD</td>
			<td>700BR07757</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps Mirror Finish</td>
			<td>FST</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors straight sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissor Tungsten Carbide straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>14568-09</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spatulae</td>
			<td>FST</td>
			<td>10094-13</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kainic acid</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120100</td>
			<td>Epileptic drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid View software</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 17:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855676P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPC 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>855775P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna 2,5&#181;m C18(2)- HAST 100A LC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00D-4446-B0</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying lamp</td>
			<td>Maul GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9%</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Camara</td>
			<td>Motic</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34875-1L</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiQuant 3.0 quantitation software package</td>
			<td>AB SCIEX, Darmstadt</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840857P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1404</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay90350-100</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl Ethanolamide-d5</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay9000573-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1004</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>850757P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1104</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 16:0-18:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>840457P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PG 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1204</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1504</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precelleys 24</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Keramik-K&#252;gelchen</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-pcs-ck14p</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Stahlkugeln 2,8mm</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PCS-MK28P</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys-keramik-kit 1,4 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 12010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin D2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay 312010</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10007211-1</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2-d9</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10581-50</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS 17:0-14:1</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-1304</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>AU111609004</td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real Time PCR System</td>
			<td>Appliert Biosystem</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resolvin D1</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay10012554-11</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Sample Prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Security Guard precolumn</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/LCMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon coverplates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>72110017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon slide rack and lid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>73310017</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM 18:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>860586P</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM d18:1/12:0</td>
			<td>Avanis Polaris</td>
			<td>LM-2312</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forceps straight Smooth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11016-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td>Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3000 Thermocycler</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td>Instrumentation/qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay19030-5</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thromboxane B2-d4</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>Cay319030-25</td>
			<td>Lipid Std</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen/ Retsch</td>
			<td>12120240804</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidinblau</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0300.2</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapotherm</td>
			<td>Barkey</td>
			<td>4004734</td>
			<td>Instrumentation/Sample prep.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasser LC-MS Chroma Solv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9814920</td>
			<td>Solvent/LCMS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidomics and transcriptomics in neurological diseases

Lipider fungerar som det primära gränssnittet till hjärnförolämpningar eller stimuli som främjar neurologiska sjukdomar och är en reservoar för syntes av lipider med olika signalerings- eller ligandfunktion som kan understryka uppkomsten och progressionen av sjukdomar. Lipider förändras ofta på presymtomatisk nivå och är en framväxande källa till läkemedelsmål och biomarkörer. Många neurologiska sjukdomar uppvisar neuroinflammation, neurodegeneration och neuronal excitabilitet som vanliga kännetecken, delvis modulerade av specifika lipidsignaleringssystem. Det ömsesidiga beroendet och sambandet mellan syntes av olika lipider föranleder en multilipid, multienzym och multireceptor analys för att härleda commonalities och specificiteter av neurologiska sammanhang och att påskynda upplösningen av mekanistiska aspekter av sjukdom debut och progression. Att tillskriva lipidroller till distinkta hjärnregioner främjar bestämningen av lipidmolekylär fenotyp och morfologi i samband med en neurologisk sjukdom.
Presenteras här är ett modulärt protokoll som lämpar sig för analys av membran lipider och nedströms lipid signaler tillsammans med mRNA av enzymer och medlare som ligger till grund för deras funktionalitet, extraheras från diskreta hjärnregioner som är relevanta för en viss neurologisk sjukdom och /eller villkor. För att säkerställa korrekt jämförande lipidomisk profilering optimerades och standardiserades arbetsflöden och driftskriterier för: i) hjärnprovtagning och dissekering av regioner av intresse, ii) samextraktion av flera lipidsignaler och membranfetter, iii) dubbel lipid/mRNA-extraktion, iv) kvantifiering genom vätskekromatografi multipla reaktionsövervakning (LC/MRM) och v) standard mRNA-profilering. Detta arbetsflöde är mottagligt för de låga vävnadsmängder som erhålls genom provtagning av de funktionellt diskreta hjärnans subregioner (dvs. genom hjärnslagning), vilket förhindrar partiskhet i multimolekylär analys på grund av vävnads heterogenitet och/eller djurvariation. För att avslöja perifera konsekvenser av neurologiska sjukdomar och upprätta translationella molekylära avläsningar av neurologiska sjukdom stater, perifera organ provtagning, bearbetning och deras efterföljande lipidomic analys, liksom plasma lipidomics, också eftersträvas och beskrivs. Protokollet demonstreras på en akut epilepsi mus modell.

Uppsättningen beskrivna protokoll kan kombineras på olika nivåer på ett målspecifikt sätt, t.ex. val av djurmodell, provtagningsväg, extraktionsmetod och profilering (figur 1).
För att bestämma lipid nivå förändringar i hjärnan och periferin under en tid kurs av ett akut epileptiskt anfall tillstånd och för att nysta upp den potentiella antiepileptiska effekten13</su...

Watch this Scientific Journal Video about Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases at JoVE.com

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

Denna artikel presenterar ett modulärt protokoll för vävnad lipidomics och transkriptomics och plasma lipidomics i neurologiska sjukdom mus modeller som riktar sig till lipider underliggande inflammation och neuronal aktivitet, membran lipider, nedströms budbärare och mRNA-kodning enzymer/receptorer underliggande lipid funktion. Provtagnings-, provbearbetnings-, extraktions- och kvantifieringsförfaranden beskrivs.

Lipidomik och transkriptomik vid neurologiska sjukdomar

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

Detta modulära protokoll gör det möjligt att utforska flera molekylära händelser som återges av strukturella och signalerande lipider, och/eller RNAs, i diskreta vävnadsregioner och i blod med en förbättrad kvantitativ och kvalitativ datautgång per provprov. Metoden är tillämplig på alla experimentella modeller, och den kan också tillämpas på mänskliga vävnadsprover och blod. Claudia Schwitter, en tekniker, Julia Post, en examensstudent, och Raissa Lerner, postdoktor i min grupp, demonstrerar proceduren.Till att börja med, ta tidigare isolerade, hela, frusna hjärnor hos möss med akut och profylaktiskt behandlad kainsyrainducerad epilepsi. Montera hjärnorna på kryostatens monteringssystem. Ställ in tjockleken på 50 mikrometer och skär hjärnan i trimläge nära den intressanta regionen.När du närmar dig intresseområdet, ställ in tjockleken på 18 till 20 mikrometer. För att lokalisera underregionen av intresse, fläcka hjärnskivor med toluidinblå. Använd ett mikroskop för att inspektera de färgade skivorna för att identifiera de områden som ska stansas och använd en musatlas som referens för att hitta lämpliga anatomiska regioner i hjärnan.Använd provkorsare för att ta slag med 0,8 till 1,0 millimeters diameter. Överför stansarna för endocannabinoider och eicosanoider coextractions till förkylda 2 milliliter bärnstensrör med sju förkylda stålbollar per rör. För fosfolipider och endocannabinoider samextraktion, dubbel lipid och RNA-co-extraction, överför stansarna till 2 milliliter RNase-fria extraktionsrör med keramiska pärlor.Väg frusna slag i kylrummet och fortsätt omedelbart med extraktion eller frys vid 80 grader Celsius. För att utföra flytande flytande lipidkoxtraktion av endocannabinoider och eicosanoider från hjärnbitar, stansar eller vävnadspulverprover, placera extraktionsrören som innehåller vävnadsproverna och sju stålbollar på is. Tillsätt 600 mikroliter iskall MTBE och 50 mikroliter acetonitrilt vatten som innehåller de interna standarderna.Efter att ha tillfogat 400 mikroliter av 0,1 mola myrsyra, använd en vävnad lyser för att homogenisera i 30 sekunder till 1 minut. Centrifugera detta homogenat i 15 minuter vid 5 000 gånger g vid 4 grader Celsius. Placera den i frysen i 10 minuter vid 80 grader Celsius för att frysa vattenfasen, vilket underlättar överföringen av den övre organiska fasen.Överför den övre organiska fasen till nya 1,5 milliliter bärnstensrör, avdunsta under en mild ström av kväve vid 37 grader Celsius i 10 minuter och rekonstituera dig sedan i 50 mikroliter acetonitrilvatten för vidare analys. Förvara vattenfasen vid 20 eller 80 grader Celsius för ytterligare analys av proteininnehåll. För att samexistera endocannabinoider och eikosanoider från plasmaprover, placera de frysta plasmaproverna på is och låt dem tina helt.Tillsätt 800 mikroliter MTBE och 50 mikroliter acetonitrilvatten som innehåller de interna standarder som är optimerade för spikning med hjälp av referensplasmaprover. Tillsätt 600 mikroliter av 0,1 mola myrsyra och virvel vid 4 grader Celsius i 2 minuter. Centrifugera proverna vid 4 000 gånger g i 15 minuter vid 4 grader Celsius.Överför den organiska fasen till nya rör. Avdunsta den under en mild ström av kväve vid 37 grader Celsius och rekonstruera den sedan med 50 mikroliter acetonitrilt vatten för vätskekromatografi analys av flera reaktioner. För att utföra samtidiga fosfolipider och endocannabinoider från hjärnregioner, stansar eller andra vävnadspulverprover, placera extraktionsrören som innehåller vävnadsproverna och keramiska pärlor på is.Tillsätt 800 mikroliter metylter-butyleter och metanolblandning och 10 mikroliter metanol som innehåller de interna standarderna. Tillsätt sedan 200 mikroliter av 0,1% myrsyra som innehåller 25 mikromolära tetrahydrolipstatin/URB597 och 50 mikrogram per milliliter BHT. Efter homogenisering med en vävnadshomogenisator, centrifugera vid 5 000 gånger g och 4 grader Celsius i 15 minuter.Överför den övre organiska fasen till nya rör, avdunsta under en mild ström av kväve vid 37 grader Celsius och rekonstruera sedan detta lipidextrakt med 90 mikroliter metanol. Om du fortsätter omedelbart, tillsätt 10% vatten till en alikvot lipidextrakt och injicera 10 mikroliter i LC/ MS för fosfolipidanalys. För ytterligare endocannabinoid analys, fortsätt med nästa steg.Ta en alikvot av lipidextraktet, avdunsta till torrhet och rekonstituera i acetonitrilt vatten. För att utföra dubbel extraktion av RNA och lipider och samtidiga fosfolipider och endocannabinoider från vävnadsprover, tina vävnadspulver alikvoter eller hjärnklasar vid 4 grader Celsius. Tillsätt vävnaden till extraktionsrör med keramiska pärlor.Tillsätt sedan 600 mikroliter RLT-buffert tillsammans med 200 mikroliter kloroform. För fosfolipid och endocannabinoid samextraktion, spikprover med 10 mikroliter av inre standardblandning och homogenisera med hög hastighet i 20 sekunder. Överför homogeniserade prover till nya centrifugrör och centrifuger i fem minuter med full hastighet och 4 grader Celsius för att möjliggöra fasseparation.Överför den övre fasen till ett nytt rör för RNA-extraktion med hjälp av ett standardkit. Elute extraherade RNA i en total volym av 50 mikroliter RNase-fritt vatten och lagra det vid 80 grader Celsius. För lipidextraktion, tillsätt 800 mikroliter MTBE/metanol och 200 mikroliter av 0,1% myrsyra till den nedre kloroforminnehållande fasen.Vortex i 45 minuter vid 4 grader Celsius. Överför den övre organiska fasen till ett nytt rör. Avdunsta den under en mild ström av kväve vid 37 grader Celsius.För ytterligare LC/MS-analys, rekonstruera provet i 90 mikroliter metanol och förvara det vid 20 eller 80 grader Celsius, eller fortsätt omedelbart till analys. För ytterligare endocannabinoid analys, fortsätt med nästa steg. Ta en alikvot av lipidextraktet, avdunsta till torrhet och rekonstituera i acetonitrilt vatten.Injicera sedan 20 mikroliter i LC/MS för endocannabinoid analys. Kainic syra induktion av akut epileptiska beslag ledde till en maximal beslag intensitet en timme efter injektion. Lipidomic profilering av endocannabinoider och eicosanoids, liksom fosfolipider och endocannabinoider, visar lipid nivå förändringar över hjärnbarken, striatum, thalamic regionen, hippocampus, hypotalamus, cerebellum samt hjärta och lungvävnad i kainic syra-inducerad epileptiska möss och kontroller.Efter dubbla extraktion av fosfolipider och endocannabinoider och RNA för kvantitativ profilering av mus hjärnan stansar, den kvantitativa fördelningen av lipider i hypotalamus, basolateral amygdala och ventrala och dorsala hippocampus analyserades. Relativa uttrycksnivåer av endogena enzymer och receptorer involverade i lipidsignalering, samt markörer för hjärnaktivitet som undersöks på mRNA-nivå i olika hjärnregioner och subregioner från möss som utsätts för kainsyrainducerade epileptiska anfall och kontroller. Kainic syra-inducerad epilepsi orsakade massiv förlust av NeuN signal, främst i CA1, CA3 och hilus regionen i hippocampus, åtföljd av apoptotiska händelser som anges av caspase-3 signal jämfört med kontroll saltlösning-injiceras möss.Efter behandling med subchronic palmitoylethanolamide, neuronal atomkärnor protein signal var märkbart bevaras och CASP3 signal var knappt detekterbar. Hjärnslagning och dissekering av diskreta hjärnområden är ganska utmanande och kräver fina färdigheter för att få konsekvent provtagning över flera kohorter. Därför rekommenderas öva på testorgan och god kunskap om hjärnans morfologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Systemisk och lokal Drug Delivery för behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet i gnagarmodeller

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Mätning av totalt kalcium i nervceller från Electron Probe röntgenmikroanalys

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic Funktionell MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Mätning Progressiv neurologiskt handikapp hos en musmodell av multipel skleros

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos i odlade nervceller i hippocampus

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Om inrättande av musmodeller för Zika Virus-inducerad neurologiska sjukdomar med hjälp av Intracerebral injektion strategier: embryonala, Neonatal och vuxen

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

En objektiv och reproducerbara Test av lukt lärande och diskriminering i möss

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging och kvantifiering av snabba dendritiska grenen dynamik i utvecklingen Drosophila nervceller

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

In vitro-modellering för neurologiska sjukdomar med direkt omvandling från fibroblaster till neuronala stamceller och differentiering till astrocyter

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...