Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Forfatterne vil gerne anerkende deres finansieringskilder: de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR) (Grant #153082 til CC, MAJ, NC); Réseau SIDA et maladies infekeuses du fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S), der ydede støtte til CC og MAJ og McGill University Faculty of Medicine, der ydede støtte til CC. Denne undersøgelse blev også støttet i en del af de canadiske institutter for sundhed Research (CIHR)-finansierede canadiske HIV Cure Enterprise (CanCURE) hold Grant HB2 – 164064 til MAJ, CC og NC. MAJ holder CIHR Canada forsknings stol Tier 2 i Immunovirology og CC og NC holde en FRQ-S Junior 1 og Junior 2 Research løn Award, hhv. ET besidder en RI-MUHC Studentship MSc-pris.
Desuden vil forfatterne gerne anerkende Josée Girouard og alle kliniske medarbejdere, der er involveret i at koordinere og indhente prøverne, samt de respiratoriske terapeuter; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette og Marie-Hélène Lacombe ved RI-MUHC Immunophenotyping-platformen; og Dr. Marianna Orlova for tilvejebringelse af mikroskopi fotos. Vigtigst af alt, forfatterne ønsker at takke de mange frivillige, uden hvem denne forskning ikke ville være muligt.

<ol>
	<li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+reservoirs+of+HIV:+obstacles+to+the+eradication+of+virus.">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+infection+of+CD4++T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1,+even+in+patients+on+effective+combination+therapy.">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li><li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection.">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li><li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+Kaposi's+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties,+California.">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li><li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+directions:+lung+aging,+inflammation,+and+human+immunodeficiency+virus.">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li><li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease?.">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO | Tuberculosis and HIV. , (2018).</li><li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function.">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li><li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR&#947;,+NADPH+Oxidases,+and+TGF&#946;.">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPAR&#947;, NADPH Oxidases, and TGF&#946;.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li><li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages.">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li><li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma:+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure.">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage.">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).</li><li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis;+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection.">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).</li><li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses.">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+persistence+in+mucosal+CD4++T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy.">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li><li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , (2004).</li><li>King, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , (2018).</li><li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls.">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li><li>Kuse, R., Schuster, S., Sch&#252;bbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls.">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li><li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung.">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li><li>Rheinl&#228;nder, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood,+Bronchoalveolar+Lavage,+and+Lung+Tissues.">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li><li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles.">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal,+Canada:+A+cross+sectional+study.">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li><li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+(CTN+173).">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li><li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cytokines+in+the+establishment,+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir.">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li><li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution.">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li><li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects.">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease.">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).</li><li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung.">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li><li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages.">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques.">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Heri beskrev vi en metode til behandling af BAL Fluid for at opnå CD4 T-celler og AMs, sammen med matchede PBMCs, som kan undersøges for at undersøge HIV-reservoiret i lungerne. Vi rapporterede for nylig om HIV DNA kvantificering i CD4 T-celler fra matchede perifert blod og BAL prøver, og vores gruppe viste, at HIV er 13 gange mere rigelige i pulmonale CD4 T-celler end i dem fra perifert blod15. Niveauerne af HIV-DNA i AMs er imidlertid donor afhængige, og derfor har der indtil videre ikke været en konsekvent sammenhæng mellem HIV-DNA-niveauerne i lymfocytter sammenlignet med makrofager15. Adgangen til disse primære makrofag celle undersæt vil imidlertid være et vigtigt redskab til at afhøre dette spørgsmål og få en bedre forståelse af den virale belastning i lungerne i forbindelse med HIV-reservoiret.
I pre-ART æra og i flere andre undersøgelser udnytter BAL Fluid, deltagerne gennemgik bronkopopi for at diagnosticere en mistænkt patologi eller få en mikrobiologisk diagnose for Respiratoriske symptomer3. Vi var dog i stand til at rekruttere deltagere uden aktive lungesymptomer eller patologier, og alle deltagere underskrev en etisk samtykkeformular15. Vi var i stand til at rekruttere deltagere fra vores Center, som deltog i andre undersøgelser, såsom en Spirometri screeningundersøgelse for obstruktiv lungesygdom24, samt dem, der gennemgår andre forsknings procedurer, såsom leukaferese og Koloskopi. Tidligere forskning blandt mennesker, der lever med HIV viste, at altruisme er en nøglefaktor motiverende deltagelse i forskningsundersøgelser25. Ligesom med mange humane prøver bemærkede vi en stor del af person-til-person variabilitet. Der var ingen måde at "forudsige" fra hvilke deltagere vi ville få BAL med god versus dårlig celle udbytter. I modsætning til perifert blod, som giver temmelig konsekvent antal lymfocytter, celle numrene i BAL Fluid er meget varierende. Indsprøjtning af en større mængde af normal saltvand i lungerne (med håb om at opnå en større tilbagevenden af BAL væske) er ikke altid muligt, da større mængder af normal saltvand er ofte forbundet med mere hoste og en højere risiko for feber postbronkoskopi. Vi bemærkede, at ved hjælp af en mindre (snarere end større) diameteren bronkier muliggjorde respirologist at nå dybere ind i bronkierne og opnå væske, der indeholder større mængder af celler. En konsekvent konstatering var, at tobaks rygere havde meget større andele af AMS end lymfocytter inden for deres bal væske, som forventes som AMS opsluge snavs og partikler. Desuden bemærkede vi, at BAL væske fra rygere indeholdt snavs, som kan blokere det anvendte udstyr, såsom PCR-maskiner og flow-cytometre. Lignende problemer kan observeres i områder med høj forurening eller personer, der oftere udsættes for dårlig luftkvalitet.
Med hensyn til deres rolle i etableringen af HIV-reservoirer og viral vedholdenhed er renheden af CD4 T-celler og AMs en vigtig overvejelse. Derfor valgte vi at bruge fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) for at opnå meget rene cellepopulationer. Det er også muligt, at den indsamlede BAL væske kan være forurenet med blod som nogle mindre blødning forventes under en bronskopi; tilstedeværelsen af naive B-celler ville indikere dette, og cellerne kan vaskes i en rød blod cellelyse buffer for at omgå dette problem. En anden udfordring med at studere BAL Fluid vedrører kvantificering af inflammatoriske markører og cytokiner, som er vigtige for forståelsen af HIV-persistens26. Da det indpolede saltvand fortynder den BAL væske, niveauer af inflammatoriske mediatorer og cytokiner kan være vanskeligt at måle. Selv om en urinstof korrektionsfaktor er blevet foreslået til at tage højde for fortynding, der er relativt lidt litteratur beskriver dens anvendelse27,28.
AMS er meget Auto-luorescent, hvilket udgør et problem under celle sortering og flow flowcytometri fænotypic analyse. Især effekten er mere udtalt i rygere, hvis AMs kan være helt sort i farve, betydeligt påvirker deres autofluorescens. Når den er ophidset af en standard blå 488 nm laser, er am autofluorescens på sit højeste ved ca. 540 nm, som overlapper med fluorescens spektre af almindeligt anvendte konjugater som FITC og PE29,30. Det er værd at bemærke, at to separate lasere kan bruges til at begejstre FITC og PE (f. eks PE ved den gule/grønne og FITC af den blå 488 laser). For at overvinde den iboende autofluorescens med FITC brugte vi unstained AMs til at bestemme autofluorescens baggrund. Desuden kan brugen af fluorescens minus en (FMO) kontrol være meget nyttig til at bekæmpe disse tekniske problemer. Større perler (f. eks. 7,5 μm) kan anvendes, som er tættere i størrelse til at kompensere makrofag populationer, sammenlignet med mindre perler (f. eks., 3,0 μm), som kan anvendes til at kompensere lymfocyt populationer. En endnu mere hensigtsmæssig fremgangsmåde ville være at bruge en lille brøkdel af cellerne som en enkelt plet kontrol ved hjælp af en kendt, stærkt udtrykt markør på delsættet, såsom HLA-DR eller CD45, konjugeret til hver af de ønskede fluorchromes, hvilket ville give mulighed for en langt mere nøjagtig kompensation, end der kan opnås med perler. I tilfælde af rygere ' prøver, denne taktik er især nyttig som makrofager er meget større og mere Auto-luorescent. Ud fra forberedelses trinnet kunne hele prøve prøven dyrkes i en tallerken inden sortering som beskrevet i afsnit 3 i protokollen for at muliggøre en adskillelse af befolkningerne ved overholdelse. På denne måde kan de vedhængende makrofager isoleres fra andre ikke-vedhængende celler såsom lymfocytter. Kompensationen er langt mindre udfordrende, hvis lymfocyt-og AM-populationer adskilles i stedet for at blive undersøgt sammen. men at stole på overholdelse vil resultere i et tab af makrofager, hvilket er en vigtig overvejelse, når cellenumre er allerede begrænsende. Også, en overholdelse skridt kunne resultere i uønsket aktivering af overholder monocytter, som kan påvirke downstream resultater genereret ved hjælp af disse celler. Værdien af effektivt at sortere celler i renere populationer skal opvejes mod begrænsningen af at have færre sådanne celler til efterfølgende eksperimenter.
Andre modeller, især murine modeller, er blevet brugt til at studere makrofag immunologiske egenskaber og biologi. Mens disse modeller er yderst nyttige og giver stor indsigt i en celletype, der er svært at manipulere, har de begrænsninger. Mange af celleoverflade mærkerne varierer mellem mus og mennesker, således at immunophenotypen af human AMs ikke er helt forstået. Men denne model system kræver pooling af flere mus til assays på grund af de lave cellenumre til rådighed fra hvert dyr. Hertil kommer, at nødvendigheden af at samle enheder udelukker overvejelser om genetisk disposition og køn. For nylig har det vist sig, at sex spiller en rolle i infektiviteten af makrofager ved HIV-1 på grund af det uensartede udtryk for restriktions faktoren SAMHD-131. Ikke-menneskelige primater (NHP) repræsenterer den nærmeste model for mennesker og faciliterede studiet af en infektion med Simian immundefektvirus (SIV) og dens virkning på immunsystemet, hvilket giver indsigt i den rolle, som vævs residente makrofager spiller i forhold til de monocytter-afledte makrofager. I rhesus macaques, det er også blevet påvist, at lunge makrofag isolater fra BAL Harbor en replikation-kompetente virus; en viral udvækst assay (VOA) blev brugt til at analysere opførsel af siv i væv-residente celler32. En sådan konstatering er af betydelig forsknings værdi, men skal stadig valideres hos mennesker, før den kan anvendes, og de høje omkostninger ved at anvende NHP'er udelukker brugen af store prøve populationer. Desuden, Human AMs vil være nyttigt for mange andre anvendelser såsom in vitro viral/mikrobiel infektion assays og i undersøgelser af andre patogener såsom tuberkulose/HIV coinfektion.

En af de mest betydningsfulde udfordringer for en kur mod hiv-infektion er tilstedeværelsen af det latente hiv-reservoir, som forårsager en rebound af plasma-observeres efter afbrydelse af antiretroviral behandling (art)1,2. Mens HIV-reservoiret under langsigtet kunst er veldokumenteret i flere vævs segmenter, herunder sekundære lymfoide organer, Gut-associeret lymfoide væv (GALT), og centralnervesystemet (CNS), er lungerne blevet overset som et område af studiet siden den præ-ART æra3. Men lungerne spiller en central rolle i patogenesen af HIV. Faktisk var pulmonale symptomer blandt de første indikatorer for AIDS-relaterede opportunistiske infektioner4. Selv i den moderne kunst æra, personer med HIV er i en større risiko for at udvikle både infektiøse og ikke-infektiøse lungesygdomme end personer uden HIV. For eksempel er personer med hiv-infektion forhøjet risiko for invasiv streptokok pneumoniae infektion, samt kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)5,6. Desuden er coinfektion af tuberkulose (TB) og HIV en betydelig folkesundheds udfordring i visse regioner i verden, især Afrika syd for Sahara, da HIV-smittede personer er 16 til 27 gange større sandsynlighed for at have TB end personer uden HIV7. Selv om nogle forklaringer på denne følsomhed over for lungebetændelse og kronisk sygdom er blevet foreslået8,9,10, de præcise cellulære mekanismer, hvormed personer med undertrykt hiv plasma virusbelastning fortsat er højere risiko for lungekomplikationer er ikke fuldt belyst. Vigtigere er, HIV er en meget stærk risikofaktor for lungebetændelse og kronisk sygdom, uafhængig af rygestatus6.
Analyse af immun miljøet i lungerne er derfor afgørende for at forstå sin rolle i sundhed og sygdom. Selv om noninvasive, induceret sputum prøver tendens til at indeholde store mængder af epiteliale celler og snavs med sjældne pulmonale lymfocytter og ingen AMs, begrænse deres rolle til specifikke anvendelser. Omvendt kan store biopsier af væv ikke opnås i fravær af mistanke om sygdom på grund af tilknyttede risici for signifikant blødning og pneumothorax (kollaps af lungerne). Desuden er størstedelen af pulmonale immunceller hovedsageligt placeret på slimhinde niveau, hvor lungerne kontinuerligt stimuleres af antigener under vejrtrækningen. Med henblik herpå har bronskopi til opnåelse af BAL væske den fordel, at det giver relativt sikker adgang til lymfocytter og AMs (Se figur 1). Makrofager udgør den største andel af celler inden for BAL Fluid, efterfulgt af lymfocytter11. Det er derfor nyttigt at fastsætte en metode, hvormed BAL-væske kan forarbejdes til anvendelse i efterfølgende anvendelser, såsom immunophenotyping, cellekultur, transkriptomik eller andre anvendelser. Protokollen til behandling af den modvæske, der er skitseret her, er tilpasset generelle procedurer, der tidligere er beskrevet og optimeret for de forskellige downstream-assays, som er beskæftiget. Denne metode giver mulighed for isolering af både pulmonal lymfoide og myeloid slimhinde immunceller for deres fænotypiske og funktionelle karakterisering, samt en vurdering af HIV-reservoiret hos voksne, som lever med HIV.
For at etablere denne protokol brugte vi følgende kriterier til at rekruttere studiedeltagere15. For at deltagerne kan deltage i denne undersøgelse, skal de være HIV-inficerede personer, der opfylder følgende kriterier: (1) på kunst i mindst 3 år; (2) undertrykt viral Load (VL) i mindst 3 år; (3) CD4 T-celletal på ≥ 200/mm3; (4) villige til at gennemgå forskning Spirometri og bronskopi. Patienter med følgende kriterier blev udelukket fra studiet: (1) kontraindikation (er) til bronskopi; (2) høj blødningsrisiko: koagulopati eller warfarin-eller clopidogrel-behandling; (3) trombocytopeni (lave trombocytter); (4) aktiv Lungeinfektion eller anden akut pulmonal proces; (5) gravid/forsøger at blive gravid.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

Bronskopi er en medicinsk procedure, hvorved normal saltvand injiceres i lungerne via en bronologisk anvendelsesområde og derefter suge påføres, fjerne bronskealveolær skylning (BAL) væske. Den BAL Fluid er rig på celler og kan således give et "øjebliksbillede" af lunge immun milieu. CD4 T-celler er de bedst karakteriserede HIV-reservoirer, mens der er stærke beviser for, at vævs makrofager, herunder alveolære makrofager (AMs), også tjener som virale reservoirer. Men, meget er stadig ukendt om rollen af AMs i forbindelse med HIV reservoir etablering og vedligeholdelse. Derfor, at udvikle en protokol til behandling af BAL Fluid at opnå celler, der kan anvendes i virologiske og immunologiske analyser til at karakterisere og evaluere cellepopulationer og undergrupper i lungerne er relevant for forståelsen af lunge rollen som HIV Reservoirer. Heri beskriver vi en sådan protokol, hvor der anvendes standardteknikker såsom simpel centrifugering og strømnings cytometri. CD4 T-cellerne og AMs kan derefter anvendes til efterfølgende anvendelser, herunder immunophenotyping og HIV-DNA og RNA-kvantificering.

I de fleste ikke-rygere, er BAL væske modtaget i en steril beholder og er en lidt uklar gul-orange-farvet væske. Væsken kan være Pinker i farve, hvis donoren gennemgik endobronchiale biopsier under bronskopi og nogle blødning forekom. Væsken kan være mørkere i farven, hvis donoren er ryger. Efter centrifugering vil BAL supernatanten være næsten klar og svagt orange, mens celle pellet kan variere i farve fra off-white til meget mørk brun, afhængigt af prøvens tilstand, og om donor var en ryger eller ej.
Ved optælling af hele bal prøven kan forskellige celletyper visualiseres, herunder større, runde makrofager omkring 17 μm i diameter og mindre runde lymfocytter omkring 7,3 μm i diameter18,19 (Se figur 2). Makrofager er forstørret i rygere med ca. 40%18. Sondringen mellem celle typerne gør det muligt at tælle makrofager og lymfocytter separat. Der kan også være nogle snavs synlige i marken, især i prøver fra rygere. Makrofager er den mest udbredte celletype i BAL, der tegner sig for ca 85% af cellerne i ikke-rygere20, og de er beriget med rygere, så de kan synes næsten eksklusiv.
De BAL celler har en tendens til at aggregere, så de skal blandes godt under alle manipulationer. Pellet kan fremstå mørkt selv efter flere vaske trin. Hvis filamentøse snavs er tydeligt i brøken efter farvning for celle sortering, passere cellerne gennem et 70 μm filter, før du kører dem gennem celle sortering.
Sortering af BAL celler skal ske ved et lavt tryk for at sikre dråbestørrelser store nok til at rumme makrofager. Cellerne er først gated til at omfatte alle CD45+21 celler, og derefter baseret på levedygtighed for at sikre, at alle døde celler er udelukket (Se figur 3). Singlet celler er derefter valgt, og inden for dette, to populationer er gated baseret på størrelse og morfologi, nemlig større myeloid celler og mindre lymfocytter (Se figur 3). Inden for de større celler, er celler gated på CD20622,23 og CD16922 og de dobbelt-positive celler er sorteret som AMS, mens inden for de mindre celler, CD3+ celler er valgt og gated på CD4 og CD8; CD4 enkelt-positive og CD8 enkelt-positive celler er sorteret (Se figur 3). De anvendte markører blev valgt ud fra tidligere beskrevne fænotyper af AMs, såsom mannose receptor CD206, fundet på fagocytiske celler23, og sialolim-RECEPTOREN CD16922.
Ved sortering af PBMCs, er cellerne først gated på fremad og side scatter, som skal vise en homogen lymfocyt population, som alle er taget, bortset fra støj tæt på nulaksen (data ikke vist). Befolkningen er gated på levedygtighed og CD45, og levende CD45+ celler anvendes. Denne population er derefter gated på CD3; for at isolere monocytter, CD3- populationen er efterfølgende GATED på CD14 og alle enkelt positive celler sorteres. For at isolere lymfocyt subsets, er CD3+ cellerne GATED på CD4 og CD8 og både enkelt positiv og cellepopulationer sorteres.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> Figur 1 : Protokol oversigt. En skematisk visning af arbejdsgangen i protokollen, herunder potentielle downstream-anvendelser af de genererede prøver. PBMC = mononukleære celler i perifert blod; BAL = bronalveolær skylning; LSM = lymfocyt separations medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> Figur 2 : Mikroskopet felt visning af hele bal væske. Mikroskop billeder fra (a) en ryger og (B) en ryger med synlige lymfocytter (L), makrofager (M), og røde blodlegemer (RBC). Forstørrelse er 1.000 x (10x okulær og 100x linse med olie nedsænkning). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> Figur 3 : Repræsentativ gating strategi for celle sortering af hele bal celler. Gating strategi bruges til at sortere alveolære makrofager (AM), CD4, og CD8 T celler fra hele BAL celleprøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prøve</td>
			<td>Antistof</td>
			<td>Vha</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Volumen pr. test (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL og PBMC</td>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-cy5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAL only</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19,2</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kun PBMC</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: flow panel til sortering af hele BAL celler og isolerede PBMCs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mål</td>
			<td>Trin</td>
			<td>Primer-navn</td>
			<td colspan="4">Primer sekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HIV total DNA eller HIV LTR-gag RNA</td>
			<td>Præ-amplifikationpcr</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ULF1</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Real-time PCR</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5 '-CTG AGG GAT CTC-TAG TTA CC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>UHIV FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 DNA</td>
			<td>Præ-amplifikationpcr</td>
			<td>HCD3 ud 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 ud 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Real-time PCR</td>
			<td>HCD3 i 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-GGC TAT KAT TCT TCT TCA AGG T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 i 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT CTC TTC AGC KAT TTA AGT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUSB RNA</td>
			<td>Præ-amplifikationpcr</td>
			<td>GUSB fremad 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB reverse 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Real-time PCR</td>
			<td>GUSB fremad 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB reverse 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT TGT CTG CTG KAT AGT TAG A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: primer-og sonde sekvenser for HIV-DNA og RNA-kvantificering.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Vi beskriver en metode til behandling af bronkoalveolær skylning væske og matchede perifert blod fra kronisk HIV-inficerede individer på antiretroviral behandling til at vurdere lunge-hiv-reservoirer. Disse metoder resulterer i erhvervelse af meget rene CD4 T-celler og alveolære makrofager, der efterfølgende kan anvendes til immunophenotyping og HIV DNA/RNA-kvantifikationer ved ultrasensitiv polymerase kædereaktion.

Behandling af Bronkoalveolær lavage væske og matchet blod for alveolær makrofag og CD4+ T-celle Immunophenotyping og hiv reservoir Assessment

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

HIV er uhelbredelig på grund af sin vedholdenhed i cellulære og anatomiske reservoirer. Denne metode giver mulighed for en HIV reservoir vurdering af immunceller isoleret fra lungerne. Denne teknik gør det muligt at isolere lungelimhindeformede T-celler og alveolær makrofager fra BAL-væske for yderligere fænotopypisk eller virologisk vurdering som cellulære reservoirer af HIV.Forståelse af biologi alveolær makrofager og CD4-positive T-celler og deres bidrag til HIV reservoir kan føre til vigtig indsigt i de udfordringer, som en HIV-kur. Isoleringen af primære makrofager fra BAL kan anvendes på forskellige andre forskningsområder, herunder inflammatoriske eller smitsomme lungesygdomme som astma og tuberkulose. Efter at have fået BAL væsken fra en menneskelig patient i henhold til standardprotokoller, vortex væsken i den oprindelige indsamling rør før overførsel af prøven til en 50-milliliter rør inden for en biosikkerhed kabinet.Hvis væsken forekommer meget uklar eller forurenet med glødevæv, filtreres prøven gennem et 70-mikrometer nylonnetfilter i et nyt 50-milliliterrør. Efter centrifugering overføres supernatanten til et nyt 50-milliliterrør, og der anvendes en pipettespids til forsigtigt at bryde pelletten op, der indeholder hele BAL-cellerne. Pellets opsaltning i en milliliter RPMI 1640-medium og tilsættes en milliliter af den reserverede supernatant af hver af 10 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Der tilsættes 10 milliliter aliquots af den resterende supernatant i 15-milliliter koniske rør og placere alle supernatant prøver i minus 80-grader Celsius opbevaring. Pelletcellesuspensionen fortyndes i 10 milliliter medium for hver 25 milliliter originalprøve og opsaml BAL-cellerne ved centrifugering. Derefter resuspend pellet i en milliliter medium suppleret med 10% føtal kvæg serum, eller FBS, til optælling.Til sortering af hele BAL- og perifere mononukleære celler tilsættes fem gange 10 til de fem celler til hver af to fem milliliter rundbundede polystyrenrør pr. delmængde for de uindgroede og levedygtighedsplettede kompensationskontroller, og resten af hver delmængdeprøve tilsættes i et fem milliliterrør pr. prøve. Cellerne opsamls ved centrifugering og opstimer kontrolpillerne i 100 mikroliter PBS pr. rør på is, indtil de anvendes. Opsaltning af pellets af cellerne til sortering i 250 mikroliter af en en ud af 20 fortynding af Fc receptor blokering buffer i en time ved fire grader Celsius at blokere enhver ikke-specifik binding.Ved afslutningen af blokeringen inkubation, tilføje passende antistof cocktail af interesse for en ekstra en times inkubation ved fire grader Celsius. Ved afslutningen af den primære antistofinkubation tilsættes en milliliter PBS til hvert rør til centrifugering og opstimeres pellets i 250 mikroliter sorteringsbuffer på is, der er beskyttet mod lys indtil sortering. For at forberede kompensationskontrollerne tilsættes der tre dråber hver af antimusimloglobulinimlobulinimlopa-kompensationsperlerne og de negative kontrolkompensationsperler pr. milliliter PBS til et mikrocentrifugerør og overføre 100 mikroliter af perleopløsningen til hver prøve, der skal anvendes til kompensation.Tilføj en mikroliter af hvert antistof i cocktail til hvert separat rør, der indeholder perler og tilsæt en microliter af levedygtighed plet på hver levedygtighed plet kompensation kontrol rør. Efter 20 minutter ved fire grader Celsius, der er beskyttet mod lys, vaskes prøverne med en milliliter PBS pr. rør og opslæmes pellets i 250 mikroliter frisk PBS pr. rør. Indbelast hele BAL-cellen, der ikke er indgroet kontrolprøve, på flowcytometeret, og opsætning af kompensationsmatrixen.Derefter indlæses prøverøret, og cellerne sorteres under lavt tryk, gating for at udelukke støj, til at omfatte levende og CD45-positive celler og for at udelukke doublerne. Inden for den større myeloid population, sortere CD206 og CD169 dobbelt-positive celler som alveolær makrofager. Inden for den mindre lymfocytpopulation isoleres cd3-positive celler, og cd4- og CD8-populationerne sorteres enkelt-positive populationer.For at sortere den perifere blodmonuklear celleprøve, gate for at udelukke støj og doublets og til at omfatte de levende CD45-positive celler som påvist. Efter gating på CD3, gate cd3-negative, CD14-positive celler til sortering af enkelt-positive monocytter og gate cd3-positive, CD4, og CD8-positive celler til sortering af begge enkelt-positive populationer. Ved optælling af hele BAL-prøven kan forskellige celletyper visualiseres, herunder større, runde makrofager og mindre, runde lymfocytter.Makrofager er den mest rigelige celletype i BAL væske, tegner sig for ca 85% af cellerne i ikke-ryger lunger. Disse celler er beriget med rygere til det punkt, tilsyneladende næsten eksklusiv og tendens til at blive udvidet med omkring 40% i forhold til de makrofager observeret hos ikke-rygere. De markører, der anvendes til sortering af alveolær makrofager fra BAL-væskeprøver, blev valgt på grundlag af tidligere beskrevne fænotyper af alveolær makrofager, såsom mannosereceptorEN CD206, som er til stede på fagocytiske celler og sialoadhesinreceptor CD169.Efter deres isolation, alveolær makrofager og andre celletyper kan anvendes til immunophenotyping ved flow cytometri, immunologiske funktionelle assays, eller reservoir kvantificering af ultrasensitive PCR. Denne teknik giver adgang til meget rene væv-hjemmehørende makrofager, som historisk har været vanskeligt at opnå, så den tidligere uopnåelige undersøgelse af den betydelige immuncellepopulation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro assay at evaluere virkningen af immunoregulerende Pathways på HIV-specifikke CD4 T-celle effektorfunktion

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Udnyttelsen af ​​Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration og Bronchoalveolære at evaluere Host immunrespons i mus

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Anvendelse af fluorescerende Skud Arrays for Vurdering af T-celle respons<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation af Tail Hud til Study Allogen CD4 T-celle respons i mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrisk Teknik for Vurdering af makrofag Fagocytose og actinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolation og<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering til T-celledelmængder

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T-celle Interstitiel Migration i det betændte Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolær Lavage af murine Lunger at analysere inflammatorisk celleinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...