Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

De auteurs willen hun financiers erkennen: de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (CIHR) (Grant #153082 to CC, MAJ, NC); de Réseau SIDA et maladies infectieuses du fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) die financiering verleende aan CC en MAJ en de McGill University Faculteit der Geneeskunde die financiering aan CC verleende. Deze studie werd ook ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) gefinancierde Canadese HIV Cure Enterprise (CanCURE) team Grant HB2 – 164064 aan MAJ, CC en NC. MAJ houdt de CIHR Canada Research Chair Tier 2 in Immunovirologie en CC en NC houdt een FRQ-S Junior 1 en junior 2 Research Salary Award, respectievelijk. ET is houder van een RI-MUHC studentship MSc Award.
Daarnaast willen de auteurs Josée Girouard en alle klinische medewerkers die betrokken zijn bij het coördineren en verkrijgen van de monsters, evenals de Ademhalings therapeuten, erkennen; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette, en Marie-Hélène Lacombe op het RI-MUHC Immunophenotyping platform; en Dr. Marianna Orlova voor de levering van de microscopie foto's. Belangrijker nog, de auteurs willen de vele vrijwilligers bedanken zonder wie dit onderzoek niet mogelijk zou zijn.

<ol>
	<li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+reservoirs+of+HIV:+obstacles+to+the+eradication+of+virus.">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+infection+of+CD4++T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1,+even+in+patients+on+effective+combination+therapy.">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li><li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection.">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li><li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+Kaposi's+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties,+California.">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li><li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+directions:+lung+aging,+inflammation,+and+human+immunodeficiency+virus.">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li><li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease?.">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO | Tuberculosis and HIV. , (2018).</li><li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function.">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li><li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR&#947;,+NADPH+Oxidases,+and+TGF&#946;.">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPAR&#947;, NADPH Oxidases, and TGF&#946;.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li><li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages.">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li><li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma:+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure.">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage.">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).</li><li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis;+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection.">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).</li><li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses.">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+persistence+in+mucosal+CD4++T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy.">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li><li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , (2004).</li><li>King, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , (2018).</li><li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls.">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li><li>Kuse, R., Schuster, S., Sch&#252;bbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls.">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li><li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung.">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li><li>Rheinl&#228;nder, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood,+Bronchoalveolar+Lavage,+and+Lung+Tissues.">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li><li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles.">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal,+Canada:+A+cross+sectional+study.">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li><li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+(CTN+173).">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li><li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cytokines+in+the+establishment,+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir.">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li><li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution.">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li><li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects.">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease.">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).</li><li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung.">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li><li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages.">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques.">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin beschrijven we een methode voor het verwerken van BAL vloeistof om CD4 T-cellen en AMs te verkrijgen, naast matched PBMCs, die kunnen worden bestudeerd om het HIV-reservoir in de longen te onderzoeken. We hebben onlangs gerapporteerd over HIV-DNA-kwantificering in CD4 T-cellen van gematchte perifere bloed-en BAL monsters, en onze groep toonde aan dat HIV 13 keer meer overvloedig is in pulmonale CD4 T-cellen dan in die van perifeer bloed15. De niveaus van HIV-DNA in AMs zijn echter donor-afhankelijk en daarom is er tot nu toe geen consistente correlatie geweest tussen de HIV-DNA-niveaus in de lymfocyten in vergelijking met macrofagen15. De toegang tot deze primaire macrofaag-deelverzamelingen zal echter een essentieel hulpmiddel zijn om deze vraag te ondervragen en een beter begrip te krijgen van de virale belasting in de longen in de context van het HIV-reservoir.
In de pre-ART tijdperk en in verschillende andere studies met behulp van BAL vocht, deelnemers onderging bronchoscopie om een vermoedelijke pathologie diagnosticeren of verkrijgen van een microbiologische diagnose voor respiratoire symptomen3. We waren echter in staat om deelnemers te werven zonder actieve pulmonale symptomen of pathologieën en alle deelnemers ondertekenden een ethisch toestemmingsformulier15. We waren in staat om deelnemers uit ons centrum aan te werven die deelnamen aan andere studies, zoals een spirometrie screening voor obstructieve longziekte24, evenals personen die andere onderzoeksprocedures ondergaan, zoals leukaferese en Colonoscopy. Eerder onderzoek onder mensen die met HIV leven, toonde aan dat altruïsme een belangrijke factor is die de deelname aan onderzoek studies motiverend25. Net als bij veel menselijke specimens, merkten we veel op van persoon tot persoon variabiliteit. Er was geen manier om te "voorspellen" van welke deelnemers we zouden krijgen BAL met goede versus slechte celopbrengsten. In tegenstelling tot perifeer bloed, dat vrij consistente aantallen lymfocyten oplevert, zijn de celaantallen in BAL vloeistof zeer variabel. Injecteren van een groter volume van normale zoutoplossing in de longen (met de hoop op het verkrijgen van een grotere terugkeer van BAL vloeistof) is niet altijd mogelijk als grotere volumes van normale zoutoplossing vaak geassocieerd met meer hoesten en een hoger risico van koorts postbronchoscopie. We merkten dat het gebruik van een kleinere (in plaats van grotere) diameter bronchoscoop de respiroloog in staat stelde om dieper in de bronchiën te komen en vloeistof te verkrijgen die grotere hoeveelheden cellen bevat. Een consistente bevinding was dat tabaks rokers veel grotere verhoudingen van AMs hadden dan lymfocyten binnen hun BAL vocht, wat wordt verwacht als AMs puin en fijnstof verzwelpt. Bovendien hebben we geconstateerd dat BAL vocht van rokers puin bevatte die de gebruikte apparatuur kunnen blokkeren, zoals PCR-machines en Flow-Cytometers. Vergelijkbare problemen kunnen worden waargenomen in gebieden met een hoge vervuiling of personen die vaker aan slechte luchtkwaliteit worden blootgesteld.
Met betrekking tot hun rol bij de oprichting van HIV-reservoirs en virale persistentie is de zuiverheid van CD4 T-cellen en AMs een belangrijke overweging. Om deze reden hebben we ervoor gekozen om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om zeer zuivere celpopulaties te verkrijgen. Het is ook mogelijk dat de verzamelde BAL vloeistof kan worden verontreinigd met bloed als sommige kleine bloeden wordt verwacht tijdens een bronchoscopie; de aanwezigheid van naïeve B-cellen zou dit aangeven, en cellen kunnen worden gewassen in een rode bloedcel lysisbuffer om dit probleem te omzeilen. Een andere uitdaging met het bestuderen van BAL vocht heeft betrekking op het kwantificeren van inflammatoire markers en cytokines, die belangrijk zijn voor het begrijpen van HIV-persistentie26. Omdat de ingeprent zoutoplossing de bal vloeistof verdunt, kunnen de niveaus van ontstekingsmediatoren en cytokines moeilijk te meten zijn. Hoewel er een ureum correctiefactor is voorgesteld voor verdunning, is er relatief weinig literatuur die het gebruik ervan beschrijft27,28.
AMs zijn zeer autofluorescentie, wat een probleem vormt tijdens het sorteren van cellen en Flowcytometrie fenotypische analyse. In het bijzonder is het effect meer uitgesproken bij rokers wier AMs volledig zwart van kleur kan zijn, wat hun autofluorescentie significant beïnvloedt. Wanneer opgewonden door een standaard blauwe 488 nm-laser, is de am-autofluorescentie op zijn hoogtepunt bij ongeveer 540 nm, dat overlapt met de fluorescentie spectra van veelgebruikte conjugaten zoals FITC en PE29,30. Het is vermeldenswaard dat twee afzonderlijke lasers kunnen worden gebruikt om te prikkelen FITC en PE (bv, PE door de gele/groene en FITC door de blauwe 488 laser). Om de inherente auto fluorescentie met FITC te overwinnen, gebruikten we Onbevlekte AMs om de autofluorescentie-achtergrond te bepalen. Bovendien kan het gebruik van fluorescentie minus één (FMO) besturingselementen zeer nuttig zijn om deze technische problemen te bestrijden. Grotere parels (bijv. 7,5 μm) kunnen worden gebruikt, die dichter bij de grootte zijn voor het compenseren van macrofaag populaties, vergeleken met kleinere kralen (bijv. 3,0 μm), die kunnen worden gebruikt voor het compenseren van lymfocyten populaties. Een nog geschiktere aanpak zou zijn om een kleine fractie van cellen te gebruiken als de enkelvoudige vlek controle, met behulp van een bekende, sterk uitgedrukt marker op de subset, zoals HLA-DR of CD45, geconjugeerd aan elk van de gewenste fluorochromes, die een veel meer nauwkeurige compensatie dan kan worden bereikt met kralen. In het geval van rokers monsters, deze tactiek is vooral nuttig als de macrofagen zijn veel groter en meer autofluorescent. Bovendien, vanaf de voorbereidingsstap, het hele BAL monster kan worden gekweekt in een plaat voor het sorteren zoals beschreven in sectie 3 van het Protocol, om een scheiding van de populaties door de hechting toe te staan. Op deze manier kunnen de aanhandige macrofagen worden geïsoleerd van andere niet-aanhandige cellen zoals lymfocyten. Compensatie is veel minder uitdagend als de lymfocyten en de AM-populaties gescheiden zijn in plaats van samen te worden onderzocht; echter, afhankelijk van de hechting zal resulteren in een verlies van macrofagen, dat is een belangrijke overweging wanneer de celaantallen zijn al beperkend. Ook, een stap van de hechting kan resulteren in de ongewenste activering van de aanhandige monocyten, die van invloed kunnen zijn op de downstream resultaten gegenereerd met behulp van deze cellen. De waarde van het efficiënt sorteren van cellen in zuiverder populaties moet worden afgewogen tegen de beperking van het hebben van minder dergelijke cellen voor latere experimenten.
Andere modellen, met name Murine modellen, zijn gebruikt om macrofaag immunologische kenmerken en biologie te bestuderen. Hoewel deze modellen zeer nuttig zijn en een goed inzicht bieden in een celtype dat moeilijk te manipuleren is, hebben ze beperkingen. Veel van de celoppervlak markeringen variëren tussen muizen en mensen, zodat het aspecten van Human AMS niet volledig wordt begrepen. Dit modelsysteem vereist echter het bundelen van verschillende muizen voor assays vanwege de lage celaantallen die voor elk dier beschikbaar zijn. Bovendien, de noodzaak om specimens te pool zich verzet tegen overwegingen van genetische aanleg en geslacht. Onlangs is gebleken dat seks een rol speelt in de infectiviteit van macrofagen door HIV-1 als gevolg van de heterogene uitdrukking van de beperkings factor SAMHD-131. Nonhuman primaten (NHP) vertegenwoordigen het dichtst bij de mens liggende model en vergemakkelijkt de studie van de infectie van het Simian immunodeficiëntie virus (SIV) en het effect ervan op het immuunsysteem, waardoor inzicht wordt verschaft in de rol van weefsel Resident macrofagen in vergelijking met monoyte-afgeleide macrofagen. In rhesus macaques is ook aangetoond dat Long macrofaag isolaten uit bal Harbor een replicatie-competent virus; een virale uitgroei test (VOA) werd gebruikt om het gedrag van SIV in weefsel-Resident cellen32te analyseren. Een dergelijke bevinding is van aanzienlijke onderzoeksinspanningen, maar moet nog steeds worden gevalideerd bij de mens voordat deze kan worden toegepast, en de hoge kosten van het gebruik van Nhp's verzet zich tegen het gebruik van grote monster populaties. Daarnaast zal Human AMs nuttig zijn voor vele andere toepassingen zoals in vitro virale/microbiële infectie testen en in studies van andere pathogenen zoals tuberculose/HIV-coinfectie.

Een van de belangrijkste uitdagingen voor een remedie tegen HIV-infectie is de aanwezigheid van het latente HIV-reservoir, dat een opleving van de plasma viremie veroorzaakt na de onderbreking van de antiretrovirale therapie (art)1,2. Terwijl het HIV-reservoir tijdens lange termijn kunst goed is gedocumenteerd in verschillende weefsel compartimenten, waaronder secundaire lymfoïde organen, gut-geassocieerde lymfoïde weefsel (GALT), en het centrale zenuwstelsel (CNS), zijn de longen over het hoofd gezien als een studiegebied Sinds de pre-ART tijdperk3. De longen spelen echter een centrale rol in de pathogenese van HIV. Pulmonale symptomen behoorden immers tot de eerste indicatoren van aan AIDS gerelateerde opportunistische infecties4. Zelfs in de moderne kunst tijd lopen personen met HIV een groter risico op het ontwikkelen van zowel infectieuze als niet-infectieuze longziekten dan personen zonder HIV. Bijvoorbeeld, personen met een HIV-infectie zijn verhoogd risico op invasieve streptokokken pneumoniae infectie, evenals chronische obstructieve longziekte (COPD)5,6. Bovendien is coinfectie van tuberculose (TBC) en HIV een belangrijke volksgezondheids uitdaging in bepaalde regio's van de wereld, met name Afrika ten zuiden van de Sahara, omdat HIV-geïnfecteerde individuen 16 tot 27 keer meer kans hebben om TB te hebben dan personen zonder HIV7. Hoewel sommige verklaringen voor deze gevoeligheid voor longinfectie en chronische ziekte zijn voorgesteld8,9,10, de precieze cellulaire mechanismen waarmee individuen met onderdrukt HIV Plasma-virale belasting blijft een hoger risico voor pulmonale complicaties zijn niet volledig opgehelderd. Belangrijk is dat HIV een zeer sterke risicofactor is voor longinfectie en chronische ziekte, onafhankelijk van de rook status6.
Analyse van het immuunsysteem van de longen is daarom cruciaal om zijn rol in gezondheid en ziekte te begrijpen. Hoewel niet-invasieve, geïnduceerde sputum monsters hebben de neiging om grote hoeveelheden epitheelcellen en puin met zeldzame pulmonaire lymfocyten en geen AMs bevatten, hun rol te beperken tot specifieke toepassingen. Omgekeerd kunnen grote biopsieën van weefsel niet worden verkregen bij afwezigheid van vermoedelijke ziekte als gevolg van de bijbehorende Risico's van significante bloedingen en pneumothorax (ineenstorting van de longen). Bovendien, de meerderheid van de pulmonale immuuncellen zijn voornamelijk gelegen op het mucosale niveau waar de longen voortdurend worden gestimuleerd door antigenen tijdens de ademhaling. Daartoe heeft bronchoscopie om BAL vloeistof te verkrijgen het voordeel dat het relatief veilige toegang biedt tot lymfocyten en AMs (Zie Figuur 1). Macrofagen vormen het grootste deel van de cellen binnen de BAL vloeistof, gevolgd door lymfocyten11. Het is daarom nuttig om een methode vast te stellen waarmee BAL vocht kan worden verwerkt voor gebruik in volgende toepassingen, zoals immunophenotypering, celkweek, transcriptomics of andere toepassingen. Het protocol voor de verwerking van de BAL vloeistof die hier wordt geschetst, is aangepast aan de algemene procedures die eerder zijn beschreven en geoptimaliseerd voor de verschillende downstream assays die worden gebruikt. Deze methodologie zorgt voor de isolatie van zowel pulmonale lymfoïde als myeloïde mucosale immuuncellen voor hun fenotypische en functionele karakterisering, evenals een beoordeling van het HIV-reservoir bij volwassenen die met HIV leven.
Om dit protocol vast te stellen, gebruikten we de volgende criteria om deelnemers aan de studie15aan te werven. Voordeel nemers om in aanmerking te komen voor deelname aan deze studie, moesten zij HIV-geïnfecteerde personen zijn die aan de volgende criteria voldeden: (1) op de kunst gedurende ten minste 3 jaar; (2) onderdrukte virale belasting (VL) gedurende minimaal 3 jaar; (3) CD4 T-celtelling van ≥ 200/mm3; (4) bereid om onderzoek te ondergaan spirometrie en bronchoscopie. Patiënten met de volgende criteria werden uitgesloten van de studie: (1) contra-indicatie (en) voor bronchoscopie; (2) hoog bloedingsrisico: coagulopathie of warfarine of behandeling met Clopidogrel; (3) trombocytopenie (lage bloedplaatjes); (4) actieve longinfectie of een ander acuut pulmonisch proces; (5) zwanger is/probeert zwanger te worden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

Bronchoscopie is een medische procedure waarbij normale zoutoplossing wordt geïnjecteerd in de longen via een bronchoscoop en vervolgens zuigkracht wordt toegepast, verwijderen van bronchoalveolaire spoeling (bal) vloeistof. De BAL vloeistof is rijk aan cellen en kan dus een ' snapshot ' van het pulmonale immuunmilieu bieden. CD4 T-cellen zijn de best gekarakteriseerde HIV-reservoirs, terwijl er sterk bewijs is dat weefsel macrofagen, waaronder alveolaire macrofagen (AMs), ook dienen als virale reservoirs. Er is echter nog veel onbekend over de rol van AMs in de context van de oprichting en het onderhoud van het HIV-reservoir. Daarom is het ontwikkelen van een protocol voor de verwerking van BAL vloeistof om cellen te verkrijgen die kunnen worden gebruikt in virologische en immunologische testen om de celpopulaties en deelverzamelingen binnen de longen te karakteriseren en te evalueren relevant voor het begrijpen van de rol van de longen als HIV Reservoirs. Hierin beschrijven we een dergelijk protocol, met standaardtechnieken zoals eenvoudige centrifugeren en Flowcytometrie. De CD4 T-cellen en AMs kunnen vervolgens worden gebruikt voor volgende toepassingen, waaronder immunophenotypering en HIV-DNA en RNA-kwantificering.

Bij de meeste niet-rokers wordt BAL vocht ontvangen in een steriele container en is een licht troebele geel-oranje-gekleurde vloeistof. De vloeistof kan Pinker in kleur zijn als de donor tijdens de bronchoscopie endobronchiale biopsieën onderging en er een aantal bloedingen optrad. De vloeistof kan donkerder van kleur zijn als de donor een roker is. Na centrifugeren zal de BAL supernatant bijna helder en licht oranje zijn, terwijl de celpellet in kleur kan variëren van gebroken wit tot zeer donker bruin, afhankelijk van de conditie van het monster en of de donor een roker was of niet.
Bij het tellen van het hele bal monster kunnen verschillende celtypen worden gevisualiseerd, waaronder grotere, ronde macrofagen rond 17 μm in diameter en kleinere ronde lymfocyten rond 7,3 μm in diameter18,19 (Zie Figuur 2). Macrofagen worden bij rokers vergroot met ongeveer 40%18. Het onderscheid tussen de celtypes maakt het mogelijk om de macrofagen en lymfocyten afzonderlijk te tellen. Er kan ook wat puin zichtbaar zijn in het veld, vooral in monsters van rokers. Macrofagen zijn het meest overvloedige celtype in het BAL, dat ongeveer 85% van de cellen in niet-roker20heeft, en ze zijn verrijkt bij rokers, zodat ze bijna exclusief kunnen lijken.
De BAL cellen hebben de neiging om te aggregeren, dus ze moeten goed worden gemengd tijdens alle manipulaties. De pellet kan donker lijken, zelfs na verschillende wasstappen. Als filamenteuze resten zichtbaar zijn in de Fractie na kleuring voor het sorteren van cellen, geeft u de cellen door een filter van 70 μm voordat u ze door de celsorteerder voert.
Het sorteren van BAL cellen moet bij een lage druk worden gedaan om te zorgen dat de druppel groottes groot genoeg zijn voor de macrofagen. De cellen worden eerst omheind met alle CD45+21 cellen, en vervolgens op basis van de levensvatbaarheid om ervoor te zorgen dat alle dode cellen worden uitgesloten (Zie Figuur 3). Singlet-cellen worden dan gekozen en binnen dit, twee populaties worden afgesloten op basis van grootte en morfologie, namelijk grotere myeloïde cellen en kleinere lymfocyten (Zie Figuur 3). Binnen de grotere cellen, cellen worden omheind op CD20622,23 en CD16922 en de dubbel-positieve cellen worden gesorteerd als AMS, terwijl binnen de kleinere cellen, CD3+ cellen worden gekozen en afgesloten op CD4 en CD8; CD4 single-positieve en CD8 enkel-positieve cellen worden gesorteerd (Zie Figuur 3). De gebruikte markers werden gekozen op basis van eerder beschreven fenotypes van AMs, zoals de mannose receptor CD206, gevonden op phagocytische cellen23, en de sialoadhesine receptor CD16922.
Bij het sorteren van de PBMCs worden cellen eerst op voorwaartse en zijverstrooiing gezet, die een homogene lymfocyten populatie moeten vertonen, die allemaal worden genomen, met uitzondering van ruis dicht bij de nulas (gegevens niet weergegeven). De bevolking is omheind op levensvatbaarheid en CD45, en live CD45+ cellen worden gebruikt. Deze populatie wordt vervolgens op CD3 afgesloten; om monocyten te isoleren, wordt de CD3- populatie vervolgens op CD14 afgesloten en worden alle enkelvoudige positieve cellen gesorteerd. Om lymfocyten subgroepen te isoleren, worden de CD3+ cellen afgesloten op CD4 en CD8 en beide enkelvoudige positieve en celpopulaties worden gesorteerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> Figuur 1 : Protocol overzicht. Een schematische weergave van de workflow van het Protocol, met inbegrip van mogelijke downstream toepassingen van de gegenereerde monsters. PBMC = perifere bloed mononucleaire cellen; BAL = bronchoalveolaire spoeling; LSM = scheidings medium voor lymfocyten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> Figuur 2 : Microscoop veld weergave van hele bal vloeistof. Microscoop beelden van (a) een niet-roker en (B) een roker met zichtbare lymfocyten (L), macrofagen (M) en rode bloedcellen (RBC). Vergroting is 1.000 x (10x oculair en 100x lens met olie onderdompeling). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> Figuur 3 : Representatieve gating strategie voor de celsortering van hele bal cellen. Gating strategie gebruikt voor het sorteren van alveolaire macrofagen (AM), CD4, en CD8 T cellen uit hele BAL celmonsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Monster</td>
			<td>Antilichaam</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Kloon</td>
			<td>Volume per test (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL en PBMC</td>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-Cy5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alleen BAL</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19,2</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alleen PBMC</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: stromings paneel voor het sorteren van hele BAL cellen en geïsoleerde PBMCs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Doel</td>
			<td>Stap</td>
			<td>Naam primer</td>
			<td colspan="4">Primer sequentie</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HIV totaal DNA of HIV LTR-gag RNA</td>
			<td>Pre-amplificatie PCR</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ULF1</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Real-time PCR</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5 '-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>UHIV FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 DNA</td>
			<td>Pre-amplificatie PCR</td>
			<td>HCD3 uit 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 uit 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Real-time PCR</td>
			<td>HCD3 in 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 in 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUSB-RNA</td>
			<td>Pre-amplificatie PCR</td>
			<td>GUSB forward 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB reverse 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Real-time PCR</td>
			<td>GUSB forward 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB reverse 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: primer en sonde sequenties voor HIV DNA en RNA kwantificering.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

HIV is ongeneeslijk door zijn persistentie in cellulaire en anatomische reservoirs. Deze methode maakt een HIV-reservoir beoordeling van immuuncellen geïsoleerd uit de longen. Deze techniek maakt het mogelijk om longslijmvlies T-cellen en alveolaire macrofagen van BAL-vloeistof te isoleren voor verdere fenotypische of virologic-beoordeling als cellulaire reservoirs van HIV.Inzicht in de biologie van alveolaire macrofagen en CD4-positieve T-cellen en hun bijdrage aan het HIV-reservoir kan leiden tot belangrijke inzichten in de uitdagingen waarmee een HIV-kuur wordt geconfronteerd. De isolatie van primaire macrofagen van BAL kan worden toegepast op verschillende andere onderzoeksgebieden, waaronder ontstekings- of infectieuze longziekten zoals astma en tuberculose. Na het verkrijgen van de BAL-vloeistof van een menselijke patiënt volgens de standaardprotocollen, vortex de vloeistof in de originele collectie buis voor de overdracht van het monster naar een 50-milliliter buis in een bioveiligheid kabinet.Als de vloeistof lijkt zeer troebel of besmet door filamenteuze weefsel, filter het monster door middel van een 70-micrometer nylon mesh filter in een nieuwe 50-milliliter buis. Breng na centrifugatie de supernatant over naar een nieuwe buis van 50 milliliter en gebruik een pipettip om de pellet met de hele BAL-cellen voorzichtig te breken. Resuspend de pellet in een milliliter RPMI 1640 medium en voeg een milliliter van de gereserveerde supernatant van elk van 10 1,5-milliliter microcentrifuge buizen.Voeg 10 milliliter aliquots van de resterende supernatant in 15-milliliter conische buizen en plaats alle supernatant monsters in de min 80-graden Celsius opslag. Verdun de pelletcelsuspensie in 10 milliliter medium voor elke 25 milliliter origineel monster en verzamel de BAL-cellen door middel van centrifugatie. Dan resuspend de pellet in een milliliter medium aangevuld met 10%foetale runderserum, of FBS, voor het tellen.Voor het sorteren van hele BAL- en perifere mononucleaire cellen in het bloed voegt u vijf maal 10 aan de vijf cellen toe aan elk van twee vijf-milliliter polystyreenbuizen met ronde bodem per subset voor de niet-gekleurde en met de levensvatbaarheid bevlekte compensatiecontroles en voeg de rest van elk subsetmonster toe aan één buis van vijf milliliter per monster. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de controle pellets in 100 microliter pbs per buis op ijs totdat ze worden gebruikt. Resuspend de pellets van de cellen voor het sorteren in 250 microliters van een een op de 20 verdunning van Fc receptor blokkeren buffer voor een uur op vier graden Celsius om een niet-specifieke binding te blokkeren.Voeg aan het einde van de blokkerende incubatie de juiste antilichaamcocktail toe voor een extra incubatie van een uur bij vier graden Celsius. Voeg aan het einde van de primaire antilichaaminclubatie één milliliter PBS toe aan elke buis voor centrifugatie en roep de pellets opnieuw op in 250 microliter van sorteerbuffer op ijs dat tot sortering tegen licht wordt beschermd. Om de compensatiecontroles voor te bereiden, voegt u elk van de anti-muisimmunlineimatiekralen en de negatieve controlecompensatiekralen per één milliliter PBS toe aan een microcentrifugebuis en breng 100 microliter van de kraaloplossing over naar elk monster dat voor compensatie moet worden gebruikt.Voeg een microliter van elk antilichaam in de cocktail aan elke aparte buis met kralen en voeg een microliter van de levensvatbaarheid vlek aan elke levensvatbaarheid vlek compensatie controle buis. Na 20 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht, was de monsters met een milliliter PBS per buis en resuspend de pellets in 250 microliters van verse PBS per buis. Laad het onbevlekte controlemonster van de hele BAL-cel op de stroomcytometer en stel de compensatiematrix in.Laad vervolgens de monsterbuis en sorteer de cellen onder lage druk, gating om ruis uit te sluiten, om levende en CD45-positieve cellen op te nemen en de doubletten uit te sluiten. Binnen de grotere myeloïde populatie, sorteren van de CD206 en CD169 dubbel-positieve cellen als alveololator macrofagen. Binnen de kleinere lymfocytenpopulatie isoleren de CD3-positieve cellen en sorteer de CD4 en CD8 single-positive populaties.Om het perifere bloedmononucleaire celmonster te sorteren, poort om het lawaai en doubletten uit te sluiten en om de levende CD45-positieve cellen op te nemen zoals aangetoond. Na het gating op CD3, poort de CD3-negatieve, CD14-positieve cellen voor het sorteren van de single-positieve monocyten en poort van de CD3-positieve, CD4, en CD8-positieve cellen voor het sorteren van zowel van de single-positieve populaties. Bij het tellen van het whole-BAL monster kunnen verschillende celtypen worden gevisualiseerd, waaronder grotere, ronde macrofagen en kleinere, ronde lymfocyten.Macrofagen zijn het meest voorkomende celtype in de BAL-vloeistof, goed voor ongeveer 85% van de cellen in niet-rokerslongen. Deze cellen zijn verrijkt bij rokers tot het punt van schijnbaar bijna exclusief en hebben de neiging om te worden vergroot met ongeveer 40%in vergelijking met de macrofagen waargenomen bij niet-rokers. De markers die worden gebruikt voor het sorteren van alveolaire macrofagen uit BAL-vloeistofmonsters werden gekozen op basis van eerder beschreven fenotypes van alveolaire macrofagen, zoals de mannosereceptor CD206 die aanwezig is op fagocytische cellen en de sialoadhesinereceptor CD169.Na hun isolatie kunnen alveololtische macrofagen en andere celtypen worden gebruikt voor immunophenotypering door stromingscytometrie, immunologische functionele testen of kwantificering van reservoirs door ultragevoelige PCR. Deze techniek biedt toegang tot zeer zuivere weefsel-ingezeten macrofagen, die historisch moeilijk te bereiken, waardoor de voorheen onbereikbare onderzoek van de aanzienlijke immuuncelpopulatie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantatie van Tail Skin aan allogene CD4 T-cel responsen bij muizen

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...