Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Les auteurs aimeraient remercier leurs bailleurs de fonds : les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (subventions #153082 à CC, MAJ, NC); Le Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) qui a accordé un financement à CC et MAJ et à la Faculté de médecine de l'Université McGill qui ont accordé du financement à CC. Cette étude a également été appuyée en partie par l'équipe de l'entreprise canadienne de soins du VIH (CanCURE) HB2 - 164064 du MAJ, du CC et du NC. Le MAJ est titulaire de la Chaire de recherche du Canada des IRSC de niveau 2 en immunovirologie et CC et NC détiennent respectivement un salaire de recherche FRQ-S Junior 1 et Junior 2. ET détient un prix DEm d'études RI-CUSM.
De plus, les auteurs aimeraient remercier Josée Girouard et tout le personnel clinique impliqué dans la coordination et l'obtention des échantillons, ainsi que les inhalothérapeutes; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette et Marie-Hélène Lacombe à la plateforme d'immunophénotypage RI-CUSM; et le Dr Marianna Orlova pour la fourniture des photos de microscopie. Plus important encore, les auteurs tiennent à remercier les nombreux bénévoles sans qui cette recherche ne serait pas possible.

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici, nous avons décrit une méthode de traitement du liquide BAL pour obtenir des lymphocytes T CD4 et des AM, aux côtés des PBMC assortis, qui peuvent être étudiés pour étudier le réservoir du VIH dans les poumons. Nous avons récemment signalé la quantification de l'ADN du VIH dans les lymphocytes T CD4 à partir d'échantillons de sang périphérique et de BAL appariés, et notre groupe a démontré que le VIH est 13 fois plus abondant dans les lymphocytes T CD4 pulmonaires que dans ceux du sang périphérique15. Cependant, les niveaux d'ADN du VIH dans les MA sont dépendants des donneurs et, jusqu'à présent, il n'y a pas eu de corrélation cohérente entre les niveaux d'ADN du VIH dans les lymphocytes par rapport aux macrophages15. L'accès à ces sous-ensembles de cellules macrophages primaires sera toutefois un outil essentiel pour interroger cette question et mieux comprendre la charge virale dans le poumon dans le contexte du réservoir du VIH.
Dans l'ère pré-ART et dans plusieurs autres études utilisant le fluide de BAL, les participants ont subila bronchoscopie afin de diagnostiquer une pathologie suspectée ou d'obtenir un diagnostic microbiologique pour des symptômes respiratoires 3. Cependant, nous avons pu recruter des participants sans aucun symptôme pulmonaire actif ou des pathologies et tous les participants ont signé un formulaire de consentement éthique15. Nous avons pu recruter des participants de notre centre qui participaient à d'autres études, comme une étude de dépistage de la spirométrie pour les maladies pulmonaires obstructives24, ainsi que ceux subissant d'autres procédures de recherche, telles que la leuphrèse et Coloscopie. Des recherches antérieures menées auprès de personnes vivant avec le VIH ont démontré que l'altruisme est un facteur clé qui motive la participation aux études de recherche25. Comme avec beaucoup de spécimens humains, nous avons noté beaucoup de variabilité de personne à personne. Il n'y avait aucun moyen de « prédire » à partir desquels nous obtiendrions le BAL avec de bons résultats cellulaires contre de mauvais rendements cellulaires. Contrairement au sang périphérique, qui donne un nombre assez constant de lymphocytes, les nombres de cellules dans le liquide BAL sont très variables. L'injection d'un plus grand volume de solution saline normale dans les poumons (avec l'espoir d'obtenir un plus grand retour du liquide BAL) n'est pas toujours possible car de plus grands volumes de solution saline normale sont souvent associés à plus de toux et à un risque plus élevé de postbronchoscopie de fièvre. Nous avons remarqué que l'utilisation d'un bronchoscope de diamètre plus petit (plutôt que plus grand) a permis au pneumologue d'atteindre plus profondément dans les bronches et d'obtenir du liquide contenant de plus grandes quantités de cellules. Une conclusion cohérente était que les fumeurs de tabac avaient des proportions beaucoup plus grandes d'AMs que les lymphocytes dans leur fluide DEBAL, qui est prévu pendant que les AMs engloutissent des débris et des particules. En outre, nous avons observé que le liquide BAL des fumeurs contenait des débris qui peuvent bloquer l'équipement utilisé, comme les machines PCR et les cytomètres d'écoulement. Des problèmes similaires peuvent être observés dans les zones de forte pollution ou les individus exposés plus fréquemment à une mauvaise qualité de l'air.
En ce qui concerne leur rôle dans l'établissement des réservoirs de VIH et la persistance virale, la pureté des lymphocytes T CD4 et des AM est une considération clé. Pour cette raison, nous avons choisi d'utiliser le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour obtenir des populations cellulaires très pures. Il est également possible que le liquide BAL recueilli soit contaminé par du sang, car on s'attend à des saignements mineurs lors d'une bronchoscopie; la présence des cellules Naïves de B indiquerait ceci, et les cellules peuvent être lavées dans un tampon de lyse de globule rouge pour contourner ce problème. Un autre défi avec l'étude du fluide BAL concerne la quantification des marqueurs inflammatoires et des cytokines, qui sont importants pour comprendre la persistance du VIH26. Comme la saline inculquée dilue le fluide BAL, les niveaux de médiateurs inflammatoires et de cytokines peuvent être difficiles à mesurer. Bien qu'un facteur de correction de l'urée ait été proposé pour tenir compte de la dilution, il y a relativement peu de documentation décrivant son utilisation27,28.
Les AM sont très autofluorescents, ce qui pose un problème lors du tri cellulaire et de l'analyse phénométrie cytométrie. En particulier, l'effet est plus prononcé chez les fumeurs dont les AM peuvent être complètement de couleur noire, affectant de manière significative leur autofluorescence. Lorsqu'elle est excitée par un laser bleu standard de 488 nm, l'autofluorescence AM est à son apogée à environ 540 nm, qui chevauche les spectres de fluorescence des conjugués couramment utilisés tels que FITC et PE29,30. Il est à noter que deux lasers distincts peuvent être utilisés pour exciter FITC et PE (par exemple, PE par le jaune / vert et FITC par le laser bleu 488). Pour surmonter l'autofluorescence inhérente à la FITC, nous avons utilisé des AM non tachés pour déterminer le fond d'autofluorescence. En outre, l'utilisation de la fluorescence moins un (FMO) contrôles peuvent être très utiles pour lutter contre ces problèmes techniques. De plus grandes perles (p. ex., 7,5 m) peuvent être utilisées, qui sont plus proches en taille pour compenser les populations de macrophages, comparativement aux perles plus petites (p. ex., 3,0 m), qui peuvent être utilisées pour compenser les populations de lymphocytes. Une approche encore plus appropriée serait d'utiliser une petite fraction de cellules comme les contrôles à seule tache, en utilisant un marqueur connu, très exprimé sur le sous-ensemble, tels que HLA-DR ou CD45, conjugué à chacun des fluorochromes désirés, ce qui permettrait un bien plus une compensation précise que l'on peut obtenir avec des perles. Dans le cas des échantillons de fumeurs, cette tactique est particulièrement utile car les macrophages sont beaucoup plus grands et plus autofluorescents. De plus, à partir de l'étape de préparation, l'ensemble de l'échantillon BAL pourrait être cultivé dans une assiette avant le tri décrit à la section 3 du protocole, afin de permettre une séparation des populations par l'observance. De cette façon, les macrophages adhérents peuvent être isolés d'autres cellules non adhérentes telles que les lymphocytes. L'indemnisation est beaucoup moins difficile si les populations de lymphocytes et de AM sont séparées plutôt que examinées ensemble; cependant, le fait de compter sur l'observance entraînera une perte de macrophages, ce qui est une considération importante lorsque le nombre de cellules est déjà limitatif. En outre, une étape d'adhérence pourrait avoir comme conséquence l'activation non désirée des monocytes adhérents, qui peuvent affecter des résultats en aval produits utilisant ces cellules. La valeur du tri efficace des cellules en populations plus pures doit être évaluée par rapport à la restriction d'avoir moins de ces cellules pour les expériences ultérieures.
D'autres modèles, notamment des modèles murins, ont été utilisés pour étudier les caractéristiques immunologiques et la biologie des macrophages. Bien que ces modèles soient extrêmement utiles et permettent un grand aperçu d'un type de cellule difficile à manipuler, ils ont des limites. Beaucoup de marqueurs de surface cellulaire varient entre les souris et les humains de telle sorte que l'immunophénotype des AM saviennes humaines n'est pas complètement comprise. Cependant, ce système modèle nécessite la mise en commun de plusieurs souris pour les essais en raison du faible nombre de cellules disponibles de chaque animal. En outre, la nécessité de mettre en commun les spécimens empêche les considérations de prédisposition génétique et de sexe. Récemment, il a été démontré que le sexe joue un rôle dans l'infectivité des macrophages par le VIH-1 en raison de l'expression disparate du facteur de restriction SAMHD-131. Les primates non humains (PsN) représentent le modèle le plus proche de l'homme et ont facilité l'étude de l'infection par le virus de l'immunodéficience simienne (IVS) et de son effet sur le système immunitaire, donnant un aperçu du rôle des macrophages tissulaires par rapport aux macrophages dérivés du monocyte. Dans les macaques rhésus, il a également été démontré que les isolats de macrophage pulmonaire de BAL hébergent un virus réplication-compétent ; un analyse virale de excroissance (VOA) a été employé pour analyser le comportement de SIV dans les cellules de tissu-résident32. Une telle constatation est d'une grande valeur de recherche, mais doit encore être validée chez l'homme avant de pouvoir être appliquée, et le coût élevé de l'utilisation des PSN empêche l'utilisation de grandes populations d'échantillons. En outre, les MA humaines seront utiles pour de nombreuses autres applications telles que les essais d'infection virale/microbienne in vitro et dans les études d'autres agents pathogènes tels que la tuberculose/coinfection par le VIH.

L'un des défis les plus importants auxquels est confronté un remède à l'infection par le VIH est la présence du réservoir latent du VIH qui provoque un rebond de la virémie plasmatique à la suite de l'interruption du traitement antirétroviral (TAR)1,2. Bien que le réservoir du VIH pendant la multithérapie à long terme soit bien documenté dans plusieurs compartiments tissulaires, y compris les organes lymphoïdes secondaires, les tissus lymphoïdes associés à l'intestin (TNA) et le système nerveux central (SNC), les poumons ont été négligés comme zone d'étude. depuis l'ère pré-ART3. Cependant, les poumons jouent un rôle central dans la pathogénie du VIH. En effet, les symptômes pulmonaires ont été parmi les premiers indicateurs d'infections opportunistes liées au sida4. Même à l'ère moderne de la multithérapie, les personnes vivant avec le VIH courent un plus grand risque de développer des maladies pulmonaires infectieuses et non infectieuses que les personnes non vivant avec le VIH. Par exemple, les personnes infectées par le VIH courent un risque élevé d'infection invasive à la pneumonie streptococcique, ainsi que de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)5,6. En outre, la coinfection de la tuberculose (TB) et du VIH est un défi de santé publique important dans certaines régions du monde, notamment en Afrique subsaharienne, car les personnes infectées par le VIH sont 16 à 27 fois plus susceptibles d'avoir la tuberculose que les personnes non séropositives7. Bien que quelques explications de cette susceptibilité à l'infection pulmonaire et aux maladies chroniques aient été proposées8,9,10, les mécanismes cellulaires précis par lesquels les personnes ayant supprimé le VIH La charge virale de plasma reste à un plus grand risque pour des complications pulmonaires n'ont pas été entièrement élucidées. Fait important, le VIH est un facteur de risque très élevé d'infection pulmonaire et de maladie chronique, indépendamment du statut de fumeur6.
L'analyse de l'environnement immunitaire du poumon est donc cruciale pour comprendre son rôle dans la santé et la maladie. Bien que non invasifs, les échantillons induits d'escmiseont tendent à contenir de grandes quantités de cellules épithéliales et de débris avec les lymphocytes pulmonaires rares et aucun AMs, limitant leur rôle aux applications spécifiques. Inversement, de grandes biopsies de tissu ne peuvent pas être obtenues en l'absence de la maladie suspectée due aux risques associés de saignement significatif et de pneumothorax (effondrement du poumon). En outre, la majorité des cellules immunitaires pulmonaires sont principalement situées au niveau muqueux où les poumons sont continuellement stimulés par des antigènes pendant la respiration. À cette fin, la bronchoscopie pour obtenir du liquide BAL a l'avantage d'offrir un accès relativement sécuritaire aux lymphocytes et aux MA (voir la figure 1). Les macrophages constituent la plus grande proportion de cellules dans le liquide BAL, suivies par les lymphocytes11. Il est donc utile d'établir une méthode par laquelle le fluide BAL peut être traité pour une utilisation dans des applications ultérieures, telles que l'immunophénotypage, la culture cellulaire, la transcriptomique, ou toute autre application. Le protocole de traitement du fluide BAL décrit ici est adapté des procédures générales précédemment décrites et optimisées pour les divers essais en aval utilisés. Cette méthodologie permet l'isolement des lymphoïdes pulmonaires et des cellules immunitaires muqueuses myéloïdes pour leur caractérisation phénotypique et fonctionnelle, ainsi qu'une évaluation du réservoir du VIH chez les adultes vivant avec le VIH.
Pour établir ce protocole, nous avons utilisé les critères suivants pour recruter les participants à l'étude15. Pour que les participants soient admissibles à participer à cette étude, il fallait qu'il s'agisse de personnes infectées par le VIH qui satisfaisaient aux critères suivants : (1) sous multithérapie pendant au moins 3 ans; (2) charge virale supprimée (VL) pendant au moins 3 ans; (3) Nombre de lymphocytes T CD4 de 200/mm3; (4) prêt à subir une spirométrie de recherche et une bronchoscopie. Les patients ayant les critères suivants ont été exclus de l'étude : (1) contre-indication(s) à la bronchoscopie; (2) risque élevé de saignement : coagulopathie ou traitement de la warfarine ou du clopidogrel; (3) thrombocytopenia (faibles plaquettes); (4) infection pulmonaire active ou un autre processus pulmonique aigu; (5) enceinte/essayer de devenir enceinte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
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		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

La bronchoscopie est une procédure médicale par le fait que la saline normale est injectée dans les poumons par l'intermédiaire d'un bronchoscope, puis l'aspiration est appliquée, en levant le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL). Le fluide BAL est riche en cellules et peut ainsi fournir un «instantané» du milieu immunitaire pulmonaire. Les lymphocytes T CD4 sont les réservoirs de VIH les mieux caractérisés, tandis qu'il existe des preuves solides qui suggèrent que les macrophages tissulaires, y compris les macrophages alvéolaires (AM), servent également de réservoirs viraux. Cependant, on ignore encore beaucoup de choses sur le rôle des MA dans le contexte de l'établissement et de l'entretien des réservoirs de VIH. Par conséquent, l'élaboration d'un protocole de traitement du liquide BAL pour obtenir des cellules qui peuvent être utilisées dans des essais virologiques et immunologiques pour caractériser et évaluer les populations cellulaires et les sous-ensembles dans le poumon est pertinente pour comprendre le rôle des poumons en tant que VIH Réservoirs. Ici, nous décrivons un tel protocole, employant des techniques standard telles que la centrifugation simple et la cytométrie de flux. Les lymphocytes T CD4 et les AM peuvent ensuite être utilisés pour des applications ultérieures, y compris l'immunophénotypage et la quantification de l'ADN et de l'ARN du VIH.

Chez la plupart des non-fumeurs, le liquide BAL est reçu dans un contenant stérile et est un liquide légèrement turbide de couleur jaune-orange. Le fluide peut être plus rose dans la couleur si le donneur a subi des biopsies endobronchiques pendant la bronchoscopie et quelques saignements se sont produits. Le liquide peut être de couleur plus foncée si le donneur est un fumeur. Après la centrifugation, le supernatant BAL sera presque clair et légèrement orange, tandis que la pastille cellulaire peut varier en couleur du blanc cassé au brun très foncé, selon l'état de l'échantillon et si le donneur était un fumeur ou non.
En comptant l'ensemble de l'échantillon BAL, différents types de cellules peuvent être visualisés, y compris les macrophages plus grands et ronds d'environ 17 m de diamètre et les lymphocytes ronds plus petits d'environ 7,3 m de diamètre18,19 (voir la figure 2). Les macrophages sont agrandis chez les fumeurs d'environ 40 %18. La distinction entre les types de cellules permet de compter les macrophages et les lymphocytes séparément. Il peut également y avoir des débris visibles sur le terrain, en particulier dans les échantillons de fumeurs. Les macrophages sont le type de cellules le plus abondant dans le BAL, représentant environ 85% des cellules chez les non-fumeurs20, et ils sont enrichis chez les fumeurs de sorte qu'ils peuvent sembler presque exclusifs.
Les cellules BAL ont tendance à s'agréger, elles doivent donc être bien mélangées lors de toutes les manipulations. La pastille peut sembler foncée même après plusieurs étapes de lavage. Si des débris filamenteux sont évidents dans la fraction après la coloration pour le tri cellulaire, passez les cellules à travers un filtre de 70 m avant de les faire passer à travers le trieur cellulaire.
Le tri des cellules BAL doit être fait à basse pression pour assurer des tailles de gouttelettes assez grandes pour accueillir les macrophages. Les cellules sont d'abord fermées pour inclure toutes les cellules CD45et21, puis basées sur la viabilité pour s'assurer que toutes les cellules mortes sont exclues (voir La figure 3). Les cellules singlet sont ensuite choisies et à l'intérieur de celle-ci, deux populations sont fermées en fonction de la taille et de la morphologie, à savoir des cellules myéloïdes plus grandes et des lymphocytes plus petits (voir la figure 3). Dans les plus grandes cellules, les cellules sont fermées sur CD20622,23 et CD16922 et les cellules à double positif sont triées comme AMs, tandis que dans les cellules plus petites, les cellules CD3 sont choisies et fermées sur CD4 et CD8; Les cellules cD4 monopositives et CD8 sont triées (voir la figure 3). Les marqueurs utilisés ont été choisis sur la base de phénotypes précédemment décrits des AM, tels que le récepteur de mannose CD206, trouvé sur les cellules phagocytiques23, et le récepteur de sialoadhesin CD16922.
Lors du tri des PBMC, les cellules sont d'abord fermées sur la diffusion vers l'avant et latérale qui devrait montrer une population homogène de lymphocytes, qui sont tous prises, à l'exclusion du bruit proche de l'axe zéro (données non montrées). La population est fermée sur la viabilité et CD45, et les cellules CD45vivantes sont utilisées. Cette population est alors fermée sur CD3; pour isoler les monocytes, le CD3- population est ensuite fermée sur CD14 et toutes les cellules positives simples sont triées. Pour isoler les sous-ensembles de lymphocytes, les cellules CD3sont fermées sur cD4 et CD8 et les populations positives et cellulaires uniques sont triées.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> Figure 1 : Aperçu du protocole. Un schéma montrant le flux de travail du protocole, y compris les utilisations potentielles en aval des échantillons générés. PBMC - cellules mononucléaires sanguines périphériques; BAL - lavage bronchoalveolar; LSM et milieu de séparation des lymphocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> Figure 2 : Vue de champ de microscope du fluide entier de BAL. Images de microscope de (A) un non-fumeur et (B) un fumeur avec des lymphocytes visibles (L), des macrophages (M), et des globules rouges (RBC). Le grossissement est de 1 000x (10x lentille oculaire et 100x avec immersion à l'huile). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> Figure 3 : Stratégie de gating représentative pour le tri cellulaire de cellules BAL entières. Stratégie de gating utilisée pour trier les macrophages alvéolaires (AM), CD4 et CD8 lymphocytes T à partir d'échantillons entiers de cellules BAL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>échantillon</td>
			<td>anticorps</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>cloner</td>
			<td>Volume par test (L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL et PBMC</td>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>APC-H7 (en anglais seulement)</td>
			<td>-</td>
			<td>1 Fois</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45 (en)</td>
			<td>PE-Cy7 (en)</td>
			<td>HI30 (HI30)</td>
			<td>5 Annonces</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 (en)</td>
			<td>Alexa700 Alexa700 Alexa700</td>
			<td>UCHT1 (en)</td>
			<td>2 (en)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4 (en)</td>
			<td>PE-cy5 (en)</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4 ( en plus)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8 (en)</td>
			<td>BV605 (en anglais seulement)</td>
			<td>SK1 SK1</td>
			<td>3 (en)</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAL seulement</td>
			<td>CD206 (en)</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19,2</td>
			<td>10 Ans et plus</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169 (en)</td>
			<td>Le BB515</td>
			<td>7 à 239</td>
			<td>5 Annonces</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBMC seulement</td>
			<td>CD14 (en)</td>
			<td>BV786 (en anglais seulement)</td>
			<td>M5E2 (en)</td>
			<td>5 Annonces</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Panneau de débit pour le tri des cellules BAL entières et des PBMC isolés.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>cible</td>
			<td>pas</td>
			<td>Nom d'amorce</td>
			<td colspan="4">Séquence d'apprêt</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">VIH ADN total ou ARN LTR-Gag VIH</td>
			<td>Pré-amplification PCR</td>
			<td>UR1 (UR1)</td>
			<td colspan="4">5'-CCA TCT CTC TC TC TAG C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ULF1 ULF1</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en temps réel</td>
			<td>UR2 (UR2)</td>
			<td colspan="4">5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT LambdaT</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>UHIV FamZen:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN CD3</td>
			<td>Pré-amplification PCR</td>
			<td>HCD3 sur 5'</td>
			<td colspan="4">5'-ACT GAC GAG GAA CAG GGG AAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 sur 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en temps réel</td>
			<td>HCD3 en 5'</td>
			<td colspan="4">5'-GGC TAT TCT TCT TCT TCA AGG T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 en 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Famzen CD3:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/AG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARN GUSB</td>
			<td>Pré-amplification PCR</td>
			<td>GUSB Avant 1:</td>
			<td colspan="4">5'-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Revers 1:</td>
			<td colspan="4">5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en temps réel</td>
			<td>GUSB Avant 2:</td>
			<td colspan="4">5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Inversé 2:</td>
			<td colspan="4">5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Séquences d'apprêt et de sonde pour la quantification de l'ADN et de l'ARN du VIH.

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Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Nous décrivons une méthode pour traiter le liquide de lavage bronchoalveolar et le sang périphérique assorti des individus chroniquement HIV-infectés sur la thérapie antirétrovirale pour évaluer les réservoirs pulmonaires de HIV. Ces méthodes ont comme conséquence l'acquisition des cellules T cD4 très pures et des macrophages alvéolaires qui peuvent plus tard être employés pour l'immunophénotypage et les quantifications d'ADN/ARN de HIV par réaction en chaîne ultrasensible de polymérase.

Traitement du liquide de lavage bronchoalvéolaire et du sang apparié pour le macrophage alvéolaire et le CD4- Immunophénotypage à cellules T et évaluation du réservoir du VIH

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Le VIH est incurable en raison de sa persistance dans les réservoirs cellulaires et anatomiques. Cette méthode permet une évaluation du réservoir vih des cellules immunitaires isolées des poumons. Cette technique permet l’isolement des cellules T muqueuses pulmonaires et des macrophages alvéolaires du liquide BAL pour une évaluation phénotypique ou virologique plus poussée en tant que réservoirs cellulaires du VIH.La compréhension de la biologie des macrophages alvéolaires et des lymphocytes T CD4 positifs et leur contribution au réservoir vih pourraient donner un aperçu important des défis auxquels est confrontée une guérison du VIH. L’isolement des macrophages primaires du BAL peut être appliqué à divers autres domaines de recherche, y compris les maladies pulmonaires inflammatoires ou infectieuses telles que l’asthme et la tuberculose. Après avoir obtenu le liquide BAL d’un patient humain selon les protocoles standard, vortex le fluide dans le tube de collecte d’origine avant de transférer l’échantillon à un tube de 50 millilitres dans une armoire de biosécurité.Si le liquide semble très trouble ou contaminé par des tissus filamenteux, filtrez l’échantillon à travers un filtre à mailles en nylon de 70 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Après centrifugation, transférer le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres et utiliser une pointe de pipette pour briser délicatement la pastille contenant toutes les cellules BAL. Resuspendez la pastille en un millilitre de RPMI 1640 moyen et ajoutez un millilitre du supernatant réservé de chacun des 10 tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Ajouter des aliquots de 10 millilitres du supernatant restant dans des tubes coniques de 15 millilitres et placer tous les échantillons de supernatants dans le stockage de moins 80 degrés Celsius. Diluer la suspension des cellules à granulés en 10 millilitres de milieu pour chaque tranche de 25 millilitres d’échantillon d’origine et recueillir les cellules BAL par centrifugation. Puis resuspendez la pastille en un millilitre de milieu complété par 10% sérum bovin fœtal, ou FBS, pour le comptage.Pour le tri de cellules mononucléaires entières de BAL et périphériques de sang, ajoutez cinq fois 10 aux cinq cellules à chacun des deux tubes de polystyrène rond de cinq millilitres par sous-ensemble pour les contrôles de compensation non tachés et vitrés de viabilité et ajoutez le reste de chaque échantillon de sous-ensemble dans un tube de cinq millilitres par échantillon. Recueillir les cellules par centrifugation et réutiliser les granulés de contrôle dans 100 microlitres de PBS par tube sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Resuspendez les granulés des cellules pour trier en 250 microlitres d’une dilution sur 20 du tampon de blocage des récepteurs Fc pendant une heure à quatre degrés Celsius pour bloquer toute liaison non spécifique.À la fin de l’incubation de blocage, ajouter le cocktail d’anticorps approprié d’intérêt pour une incubation supplémentaire d’une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation primaire d’anticorps, ajouter un millilitre de PBS à chaque tube pour la centrifugation et réutiliser les granulés dans 250 microlitres de tampon de tri sur la glace protégé de la lumière jusqu’au tri. Pour préparer les contrôles de compensation, ajoutez trois gouttes chacune des perles de compensation d’immunoglobuline anti-souris et les perles négatives de compensation de contrôle par millilitre de PBS à un tube de microcentrifugeuse et transférez 100 microlitres de la solution de perle à chaque échantillon pour être employé pour la compensation.Ajouter un microlitre de chaque anticorps dans le cocktail à chaque tube séparé contenant des perles et ajouter un microlitre de tache de viabilité à chaque tube de contrôle de la compensation des taches de viabilité. Après 20 minutes à quatre degrés Celsius protégés de la lumière, lavez les échantillons avec un millilitre de PBS par tube et réutilisez les granulés dans 250 microlitres de PBS frais par tube. Chargez l’échantillon de commande non taché de la cellule BAL entière sur le cytomètre d’écoulement et installez la matrice de compensation.Chargez ensuite le tube d’échantillon et triez les cellules sous basse pression, en ténuant pour exclure le bruit, pour inclure les cellules vivantes et cd45-positives, et pour exclure les doublets. Au sein de la population myéloïde plus grande, trier les cellules CD206 et CD169 à double positif sous forme de macrophages alvéolaires. Au sein de la plus petite population de lymphocytes, isoler les cellules CD3 positives et trier les populations cd4 et CD8 mono-positives.Pour trier l’échantillon périphérique de cellules mononucléaires sanguines, portez pour exclure le bruit et les doublets et pour inclure les cellules CD45-positives vivantes comme démontré. Après avoir tété sur CD3, portez les cellules CD3-négatives, CD14-positives pour trier les monocytes mono-positifs et portez les cellules CD3-positives, CD4, et CD8-positives pour trier les deux populations mono-positives. Lorsque l’on compte l’échantillon bal entier, différents types de cellules peuvent être visualisés, y compris les macrophages ronds plus grands et les lymphocytes ronds plus petits.Les macrophages sont le type de cellule le plus abondant dans le liquide BAL, représentant environ 85% des cellules dans les poumons non-fumeurs. Ces cellules sont enrichies chez les fumeurs au point de sembler presque exclusives et ont tendance à être agrandies d’environ 40% par rapport aux macrophages observés chez les non-fumeurs. Les marqueurs utilisés pour trier les macrophages alvéolaires à partir d’échantillons de liquide BAL ont été choisis sur la base de phénotypes précédemment décrits de macrophages alvéolaires, tels que le récepteur mannose CD206 qui est présent sur les cellules phagocytiques et le récepteur de la sialoadhesine CD169.Après leur isolement, les macrophages alvéolaires et d’autres types de cellules peuvent être utilisés pour l’immunophéotypage par cytométrie d’écoulement, analyses fonctionnelles immunologiques, ou quantification de réservoir par PCR ultrasensible. Cette technique permet l’accès à des macrophages très purs résidant dans les tissus, qui ont toujours été difficiles à atteindre, permettant l’examen auparavant inaccessible de la population importante de cellules immunitaires.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Recherche

Immunologie et infection

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

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Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

L&#39;utilisation de l&#39;oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

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L&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation de queue peau d&#39;étudier allogéniques CD4 réponses des cellules T chez la souris

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Haut Débit Fluorometric Technique pour l&#39;évaluation de phagocytose des macrophages et l&#39;actine polymérisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavage bronchoalvéaire des poumons murins pour analyser l&#39;infiltration cellulaire inflammatoire

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...