Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

המחברים רוצים להכיר בתורמים שלהם: המכונים הקנדים לחקר הבריאות (CIHR) (הענק153082 לCC, רס ן, NC); הנגועים בצ סידה ומאלמת משתמשים בעלי כפות העור דה קוויבק (FRQ-S) שהעניק מימון ל-CC ו-רס"ן ולפקולטה לרפואה של אוניברסיטת מקגיל, אשר העניקה מימון ל-CC. מחקר זה נתמך גם בחלק המכונים הקנדיים של מחקר הבריאות (CIHR)-ממומן הקנדי לריפוי ארגוני HIV (יכול) צוות גרנט HB2 – 164064 ל-רס"ן, CC ו-NC. רס ן מחזיקה CIHR בראש המחקר קנדה ברמה 2 ב חיסוני והעתק ו-NC להחזיק FRQ-S זוטר 1 ו ג'וניור 2 פרס שכר מחקר, בהתאמה. ב-ET מתקיים פרס של מסעדת הארגון.
בנוסף, המחברים רוצים להכיר בחוסה Girouard ובכל העובדים הקליניים המעורבים בתיאום ובהשגת הדגימות, כמו גם במטפלים בדרכי הנשימה; קטרינה איניקוצ'נקו, הלן פלואה-ואיללט, ומארי-הלן לקובל בפלטפורמת ההקלדה החיסונית של RI-MUHC; וד ר מריאנה אורלובה לאספקת תמונות המיקרוסקופיה. והכי חשוב, המחברים רוצים להודות למתנדבים הרבים שבלעדיהם המחקר הזה לא יהיה אפשרי.

<ol>
	<li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+reservoirs+of+HIV:+obstacles+to+the+eradication+of+virus.">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+infection+of+CD4++T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1,+even+in+patients+on+effective+combination+therapy.">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li><li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection.">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li><li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+Kaposi's+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties,+California.">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li><li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+directions:+lung+aging,+inflammation,+and+human+immunodeficiency+virus.">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li><li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease?.">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO | Tuberculosis and HIV. , (2018).</li><li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function.">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li><li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR&#947;,+NADPH+Oxidases,+and+TGF&#946;.">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPAR&#947;, NADPH Oxidases, and TGF&#946;.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li><li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages.">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li><li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma:+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure.">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage.">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).</li><li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis;+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection.">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).</li><li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses.">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+persistence+in+mucosal+CD4++T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy.">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li><li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , (2004).</li><li>King, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , (2018).</li><li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls.">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li><li>Kuse, R., Schuster, S., Sch&#252;bbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls.">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li><li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung.">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li><li>Rheinl&#228;nder, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood,+Bronchoalveolar+Lavage,+and+Lung+Tissues.">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li><li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles.">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal,+Canada:+A+cross+sectional+study.">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li><li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+(CTN+173).">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li><li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cytokines+in+the+establishment,+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir.">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li><li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution.">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li><li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects.">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease.">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).</li><li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung.">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li><li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages.">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques.">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן תיארנו שיטה לעיבוד נוזל BAL כדי להשיג CD4 T תאים AMs, לצד PBMCs התאמה, אשר ניתן ללמוד לחקור את מאגר ה-HIV בתוך הריאות. אנו דיווחו לאחרונה על כימות ה-DNA של HIV בתאי CD4 T מתוך דם היקפי ודגימות BAL, והקבוצה שלנו הפגינו כי HIV הוא 13 פעמים שופע יותר בתאי הריאות CD4 T מאשר אלה של דם היקפי15. עם זאת, רמות ה-DNA של HIV ב AMs הם התורמים תלוי ולכן, עד כה, לא היה מתאם עקבי בין רמות ה-DNA של האיידס בתוך לימפוציטים לעומת מקרופאגים15. הגישה לקבוצות המשנה הראשיות של תאים מקרופאג, עם זאת, יהיה כלי חיוני כדי לחקור את השאלה הזאת ולקבל הבנה טובה יותר של עומס ויראלי בריאה בהקשר של מאגר ה-HIV.
בתקופה שלפני האמנות ובמחקרים נוספים באמצעות נוזל BAL, המשתתפים עברו ברונכוסקופיה כדי לאבחן את החשד לפתולוגיה או לקבל אבחנה מיקרוביולוגית לתסמיני הנשימה3. עם זאת, הצלחנו לגייס משתתפים ללא כל תסמיני הריאות הפעילים או הפתווגיות, וכל המשתתפים חתמו על טופס הסכמה מוסרי15. הצלחנו לגייס משתתפים מהמרכז שלנו, אשר השתתפו במחקרים אחרים, כגון מחקר הקרנה מספירומטריה למחלת ריאות חסימתית24, כמו גם לאלה העוברים תהליכי מחקר אחרים, כגון לוקיהרזיס ו קולונוסקופיה. המחקר הקודם בקרב אנשים החיים עם HIV הוכיח כי אלטרואיזם הוא גורם מפתח מוטיבציה השתתפות במחקרים מחקר25. כמו עם הרבה דגימות אנושיות, ציינו הרבה מאוד השתנות אדם-לאדם. לא הייתה שום דרך "לנבא" מאילו משתתפים היינו משיגים את באל עם התשואות התאים הטובות לעומת העניים. שלא כמו דם היקפי, אשר מניב מספר עקבי למדי של לימפוציטים, מספרי התאים בנוזל BAL הם משתנים מאוד. הזרקת נפח גדול יותר של תמיסת מלח נורמלי לתוך הריאות (עם התקוות של קבלת תשואה גדולה יותר של נוזל BAL) הוא לא תמיד אפשרי כמו כמויות גדולות יותר של תמיסת מלח רגיל משויכים לעתים קרובות עם שיעול יותר סיכון גבוה יותר של משחת שלאחר חום. שמנו לב כי באמצעות ברונסקופ קטן (ולא גדול יותר) בקוטר מופעל הrespirologist להגיע עמוק יותר לתוך הברוצ ולקבל נוזל המכיל כמויות גדולות יותר של תאים. ממצא עקבי היה כי מעשנים טבק היו פרופורציות הרבה יותר גדול של AMs מאשר לימפוציטים בתוך נוזל בל שלהם, אשר צפוי כפסולת AMs המפרץ וחומר חלקיקי. יתר על כן, הבחנו כי נוזל BAL מעשנים הכיל פסולת אשר עשוי לחסום את הציוד המשמש, כגון מכונות PCR ו-cytomטומטריים זורמים. בעיות דומות ניתן לצפות באזורים של זיהום גבוה או אנשים חשופים בתדירות גבוהה יותר לאיכות האוויר המסכן.
ביחס לתפקידם בהקמת מאגרי HIV והתמדה ויראלית, הטוהר של CD4 T תאים ו-AMs הוא שיקול מפתח. מסיבה זו, אנו בחרו להשתמש במיון תא המופעל על ידי זריחה (FACS) כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור ביותר. ייתכן גם כי נוזל BAL שנאסף עשוי להיות מזוהם עם דם כמו דימום קטין צפוי במהלך ברונסקופיה; הנוכחות של תאים תמימים B יציין את זה, ואת התאים ניתן לשטוף במאגר דם אדום הפירוק כדי לעקוף את הבעיה. אתגר נוסף עם לימוד נוזל BAL מתייחס לכמת סמנים דלקתיים ציטוקינים, אשר חשובים להבנת ההתמדה של HIV26. כמו מלוחים החדירו מדלל את הנוזל BAL, רמות של מגשרים דלקתיים וציטוקינים עשויים להיות קשה למדוד. למרות גורם תיקון אוריאה הוצע לחשבון עבור דילול, יש ספרות קטנה יחסית המתארת את השימוש שלה27,28.
AMs הם פלורסנט במיוחד, אשר מהווה בעיה במהלך מיון תאים וזרימה cy, לנסות בניתוח פנוטומי. בפרט, ההשפעה היא בולטת יותר מעשנים אשר AMs עשויים להיות שחור לחלוטין בצבע, המשפיעים באופן משמעותי על הקרינה האוטומטית שלהם. כאשר מתרגש על-ידי תקן כחול 488 ננומטר לייזר, AM autoפלואורסצנטית הוא בשיאו ב בקירוב כ 540 ננומטר, אשר חופף עם ספקטרום של זריחה של שערי מעלה נפוץ כגון fitc ו-PE29,30. ראוי לציין כי שני לייזרים נפרדים ניתן להשתמש כדי להלהיב FITC ו PE (למשל, PE על ידי צהוב/ירוק ו-FITC על ידי כחול 488 לייזר). כדי להתגבר על האוטוסונטית הפנימי עם FITC, השתמשנו בלתי מוכתם AMs כדי לקבוע את הרקע האוטומטי. בנוסף, השימוש של הזריחה מינוס אחד (FMO) בקרות יכול להיות מאוד שימושי כדי להילחם בנושאים טכניים אלה. מחרוזות גדולות יותר (למשל, 7.5 μm) ניתן להשתמש, אשר קרוב יותר בגודל עבור מקרופאג אוכלוסיות פיצוי, לעומת חרוזים קטנים יותר (למשל, 3.0 μm), אשר ניתן להשתמש בהם עבור אוכלוסיות לימפוציטים פיצוי. גישה מתאימה עוד יותר יהיה להשתמש בחלק קטן של תאים כמו שולטת כתם אחד, באמצעות סמן ידוע, ביטוי מאוד על קבוצת המשנה, כגון HLA-DR או CD45, מעלה באוב לכל את fluorochromes הרצוי, אשר תאפשר הרבה יותר פיצוי מדויק מאשר ניתן להשיג עם חרוזים. במקרה של מעשנים דגימות, טקטיקה זו היא שימושית במיוחד כמו מקרופאגים הם הרבה יותר גדול ואוטומטי יותר פלורסנט. בנוסף, משלב ההכנה, כל דגימת בל יכולה להיות תרבותית בצלחת לפני מיון כפי שמתואר בסעיף 3 לפרוטוקול, כדי לאפשר הפרדה בין האוכלוסיות בדבקות. בדרך זו, מקרופאגים חסיד יכול להיות מבודד מתאים אחרים שאינם חסיד כגון לימפוציטים. פיצוי הוא הרבה פחות מאתגר אם אוכלוסיית הלימפוציטים ו-AM מופרדים ולא נבדקת ביחד; עם זאת, הסתמכות על דבקות תגרום לאובדן של מקרופאגים, שהוא שיקול חשוב כאשר מספרי התאים כבר מגבילים. גם, צעד הדבקות יכול לגרום להפעלה לא רצויה של חסיד מונוציטים, אשר עשוי להשפיע על תוצאות במורד הזרם שנוצר באמצעות תאים אלה. הערך של ביעילות מיון תאים לאוכלוסיות טהור חייב להיות שוקלת נגד ההגבלה שיש פחות תאים כאלה לניסויים הבאים.
דגמים אחרים, בעיקר מודלים murine, שימשו כדי ללמוד מקרופאג אימונולוגיים המאפיינים וביולוגיה. בעוד מודלים אלה הם שימושיים מאוד ולאפשר תובנה גדולה לתוך סוג תא קשה לתמרן, יש להם מגבלות. רבים מסמני פני השטח של התאים משתנים בין עכברים לבני אדם, כך שהאימונואופטיטיפ של האדם אינו מובן לחלוטין. עם זאת, מערכת מודל זו דורשת צירוף של מספר עכברים עבור בחני בשל מספרי התאים הנמוכים הזמינים מכל בעל חיים. בנוסף, הצורך בדגימות של בריכות מונע שיקולים של נטייה גנטית ומין. לאחרונה, זה הוכח כי מין משחק תפקיד הנגועים של מקרופאגים על ידי HIV-1 בשל הביטוי שונים של פקטור ההגבלה SAMHD-131. פרימטים לא אנושיים (nhp) מייצגים את המודל הקרוב ביותר לבני אדם והקלה על המחקר של וירוס הכשל החיסוני קופיים (סיב) זיהום השפעתו על מערכת החיסון, מתן תובנה לתפקיד של מקרופאגים המתמחים ברקמות לעומת מקרופאגים הנגזרים מונוציט. ב רזוס קופי, זה הוכח גם כי הריאה מקרופאג מבודד BAL הנמל וירוס המוסמכת השכפול; שיטת הצמיחה הנגיפית (VOA) שימש לניתוח ההתנהגות של סיב בתאים שוכני-רקמות32. ממצא כזה הוא בעל ערך מחקרי משמעותי אך חייב להיות עדיין מאומת אצל בני אדם לפני שניתן יהיה להחילו, והעלות הגבוהה של שימוש ב-NHPs מונע את השימוש באוכלוסיות גדולות לדוגמה. בנוסף, ה-AMs האנושיים יהיו שימושיים ליישומים רבים אחרים, כגון בעלי מבחנה ויראלי/מיקרוביאלית של זיהום ובמחקרים של פתוגנים אחרים כגון שחפת/איידס.

אחד האתגרים המשמעותיים ביותר מול תרופה לזיהום HIV היא הנוכחות של מאגר האיידס החבוי הגורם לריבאונד של פלזמה viremia בעקבות ההפרעה של טיפול תרופתי (אמנות)1,2. בעוד מאגר ה-HIV במהלך לטווח ארוך אמנות מתועדת היטב בכמה תאי רקמה, כולל איברי הלימפה המשני, הבטן הקשורה רקמת הלימפה (גולט), ואת מערכת העצבים המרכזית (CN), הריאות כבר התעלמו כאזור המחקר מאז התקופה הקדם-אמנותית3. עם זאת, הריאות לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של HIV. אכן, הסימפטומים הריאתי היו בין האינדיקטורים הראשונים של הקשורות איידס זיהומים אופורטוניסטים4. גם בעידן האמנות המודרנית, אנשים עם HIV נמצאים בסיכון גבוה יותר לפתח מחלות ריאות זיהומיות ולא זיהומיות מאשר אנשים ללא HIV. לדוגמה, אנשים עם זיהום HIV נמצאים בסיכון מוגבר לזיהום דלקת ריאות streptococcal פולשנית, כמו גם מחלת ריאות חסימתית כרונית (copd)5,6. יתר על כן, זיהום coinfection שחפת (TB) ו-HIV הוא אתגר בריאות הציבור משמעותי באזורים מסוימים של העולם, בעיקר, אפריקה שמדרום לסהרה, כמו אנשים נגועים באיידס הם 16 עד 27 סביר יותר להיות שחפת מאשר אנשים ללא HIV7. למרות כמה הסברים על הרגישות הזאת לזיהום ריאתי ומחלה כרונית הוצעו8,9,10, מנגנונים סלולריים מדויקים שבהם אנשים עם HIV מודחק העומס פלזמה ויראלי להישאר בסיכון גבוה יותר עבור סיבוכים ריאתי לא הובהר לגמרי. חשוב מכך, HIV הוא גורם סיכון חזק מאוד לזיהום ריאתי מחלה כרונית, ללא תלות בסטטוס עישון6.
הניתוח של הסביבה החיסונית של הריאה הוא, לכן, חיוני כדי להבין את תפקידה בבריאות ומחלות. למרות שאינם פולשני, דגימות רוק המושרה נוטים להכיל כמויות גדולות של תאים אפיתל ופסולת עם לימפוציטים ריאתי נדיר ולא AMs, הגבלת תפקידם יישומים ספציפיים. לעומת זאת, לא ניתן להשיג ביופסיות גדולות של רקמות בהיעדר חשד למחלה עקב הסיכונים הכרוכים בדימום ובחזה האוויר המשמעותי (קריסת הריאה). יתר על כן, רוב התאים החיסוניים הריאתי ממוקמים בעיקר ברמה רירית שבו הריאות מגורה ברציפות על ידי אנטיגנים במהלך הנשימה. לשם כך, ברונכוסקופיה להשגת נוזל BAL יש את היתרון של מתן גישה בטוחה יחסית לימפוציטים ו-AMs (ראה איור 1). מקרופאגים מהווים את החלק הגדול ביותר של תאים בתוך נוזל BAL, ואחריו לימפוציטים11. היא שימושית, לפיכך, כדי ליצור שיטה שבאמצעותה ניתן לעבד את הנוזל BAL לשימוש ביישומים הבאים, כגון מסוג immunophenotyping קלדה, תרבית תאים, טרנססקריפט או כל יישום נוסף. הפרוטוקול לעיבוד הנוזל BAL המתואר כאן מותאם מהליכים כלליים שתוארו בעבר ממוטב עבור הזרם השונים במורד שונים המועסקים. מתודולוגיה זו מאפשרת בידוד של שני הלימפה הריאתי ואת התאים מיאלואידית רירית החיסונית שלהם והאפיון פונקציונלי, כמו גם הערכה של מאגר ה-hiv אצל מבוגרים החיים עם HIV.
כדי לבסס פרוטוקול זה, השתמשנו בקריטריונים הבאים כדי לגייס את משתתפי המחקר15. עבור המשתתפים להיות זכאים להשתתף במחקר זה, הם היו צריכים להיות אנשים נגועים באיידס שנפגשו הקריטריונים הבאים: (1) על אמנות לפחות 3 שנים; (2) מדוכא מטען נגיפי (VL) למינימום של 3 שנים; (3) ספירת תאים CD4 T של ≥ 200/mm3; (4) מוכן לעבור מחקר ספירומטריה וברונכוסקופיה. חולים עם הקריטריונים הבאים לא נכללו במחקר: (1) התוויות של ברונסקופיה; (2) הסיכון לדימום גבוה: הקואגופתיה או על וורפרין או טיפול קלופידוגרל; (3) תרומבוציטופניה (טסיות נמוך); (4) זיהום ריאתי פעיל או בתהליך אחר של שבלול אקוטי; (5) הריון/מנסה להיכנס להריון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

ברונכוסקופיה היא הליך רפואי לפיו תמיסת מלח נורמלי מוזרק לתוך הריאות באמצעות ברונסקופ ולאחר מכן יניקה מוחל, הסרת ששטיפה ברונדושיים (BAL) נוזל. נוזל בל הוא עשיר בתאים ובכך יכול לספק "תצלום" של הסביבה החיסונית של הריאות. CD4 T תאים הם מאגרי HIV מאופיין הטוב ביותר, בעוד יש ראיות חזקות להציע כי מקרופאגים רקמות, כולל מכתשי מקרופאגים (AMs), גם לשמש מאגרים ויראלי. עם זאת, הרבה עדיין לא ידוע על התפקיד של AMs בהקשר של הקמת מאגר HIV ותחזוקה. לכן, פיתוח פרוטוקול לעיבוד נוזל BAL להשיג תאים שעשויים לשמש virological ואימונולוגיים בחני לאפיין ולהעריך את אוכלוסיות התאים וקבוצות המשנה בריאות הוא רלוונטי להבנת התפקיד של הריאות כמו HIV אגרים. להלן, אנו מתארים פרוטוקול כזה, העסקת טכניקות סטנדרטיות כגון צנטריפוגה פשוטה וזרימה cy try. התאים CD4 T ו-AMs לאחר מכן ניתן להשתמש עבור יישומים הבאים, כולל immunophenotyping קלדה ו-DNA HIV ו-RNA כימות.

ברוב שאינם מעשנים, נוזל BAL מתקבל במיכל סטרילי והוא נוזל בצבע צהוב כתום במקצת. הנוזל עשוי להיות פינקר בצבע אם התורם עבר ביופסיה אנדוסימפונות במהלך הסימפכוסקופיה וקצת דימום אירע. הנוזל עשוי להיות כהה יותר בצבע אם התורם הוא מעשן. לאחר צנטריפוגה, BAL supernatant יהיה כמעט ברור וכתום מעט, בעוד הגלולה התא יכול לנוע בצבע מחוץ ללבן כדי חום כהה מאוד, בהתאם למצב של המדגם והאם התורם היה מעשן או לא.
כאשר סופרים את כל המדגם BAL, סוגי תאים שונים יכולים להיות דמיינו, כולל גדול יותר, עגול מקרופאגים סביב 17 יקרומטר קוטר ולימפוציטים עגולים קטנים יותר סביב 7.3 יקרומטר בקוטר18,19 (ראה איור 2). מקרופאגים מוגדלים למעשנים על ידי כ 40%18. ההבחנה בין סוגי תאים מאפשר לספור את מקרופאגים ו לימפוציטים בנפרד. ייתכנו גם כמה פסולת לראות בשדה, במיוחד בדגימות של מעשנים. מקרופאגים הם סוג תא שופע ביותר באל, חשבונאות עבור כ 85% של תאים בלתי מעשנים20, והם מועשר מעשנים כך שהם עשויים להיראות כמעט בלעדית.
תאים בל יש נטייה צבירה, כך הם חייבים להיות מעורבים היטב במהלך כל המניפולציות. הגלולה עשויה להיראות כהה גם לאחר כמה צעדים לשטוף. אם פסולת filamentous ניכרת בשבר לאחר צביעת למיון תא, להעביר את התאים באמצעות מסנן 70 יקרומטר לפני הפעלת אותם דרך סדרן התא.
המיון של תאים BAL חייב להיעשות בלחץ נמוך כדי להבטיח גדלי droplet גדול מספיק כדי להתאים את מקרופאגים. התאים מגודרת תחילה לכלול את כל CD45+21 תאים, ולאחר מכן מבוסס על כדאיות כדי להבטיח את כל התאים מתים אינם נכללים (ראה איור 3). התאים סינגאז נבחרו ובתוך זה, שתי אוכלוסיות מגודרת מבוסס על גודל מורפולוגיה, כלומר תאים מיאלואידית גדול יותר לימפוציטים קטנים יותר (ראה איור 3). בתוך התאים הגדולים, תאים מגודרת על CD20622,23 ו CD16922 ואת התאים כפול חיובי ממוינים כמו AMs, בעוד בתוך התאים הקטנים, CD3+ תאים נבחרים ומגודרת על CD4 ו CD8; CD4 תאים חד-חיוביים וCD8-חיוביים בודדים ממוינים (ראה איור 3). הסמנים בשימוש נבחרו על בסיס הפנוטיפים שתוארו בעבר של AMs, כגון קולטן האף מנוז CD206, נמצא על תאים phagocytic23, ואת הקולטן sialo החטא CD16922.
בשעת מיון PBMCs, התאים מגודרת תחילה על גבי פיזור בצד הקדמי, אשר צריך להציג אוכלוסיית לימפוציטים אחידה, כולם נלקחים, למעט רעש קרוב לציר אפס (נתונים לא מוצגים). האוכלוסייה מגודרת על כדאיות ו CD45, ולחיות CD45+ תאים משמשים. אוכלוסייה זו מגודרת אז על CD3; כדי לבודד את המונולוציטים, האוכלוסיה CD3 מגודרת לאחר מכן ב- CD14 וכל התאים החיוביים היחידים ממוינים. כדי לבודד תת-ערכות לימפוציטים, התאים CD3+ מסודרים בCD4 ובCD8 ואוכלוסיית התאים החיובית היחידה ממוינת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> איור 1 : מבט כולל על פרוטוקול. סכימטי המציג את זרימת העבודה של הפרוטוקול, כולל השימוש הפוטנציאלי במורד הזרם של דגימות שנוצרו. PBMC = דם היקפי תאים מונחדרורים; בל = ששטיפה ברונשיים; LSM = מדיום הפרדה לימפוציטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> איור 2 : שדה מיקרוסקופ תצוגה של נוזל שלם בל. מיקרוסקופ תמונות מ (א) ללא מעשן ו (ב) מעשן עם לימפוציטים גלויים (L), מקרופאגים (M), ותאי דם אדומים (rbc). ההגדלה היא 1, 000x (עדשה 10x ועדשת 100x עם טבילה בשמן). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> איור 3 : הנציגה באסטרטגיה למיון התא של תאי BAL שלמים. האסטרטגיה המשמשת למיון מכתשי, מקרופאגים (AM), CD4 וCD8 T מדגימות שלמות של תאי בל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>דוגמה</td>
			<td>נוגדן</td>
			<td>פלואורוכרום</td>
			<td>שיבוט</td>
			<td>אמצעי אחסון לבדיקה (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">בל ו-PBMC</td>
			<td>חי/מת</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>מיכל 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-cy5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>בלבד</td>
			<td>CD206</td>
			<td>PE</td>
			<td>19.2</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>מיכל 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBMC בלבד</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>מיכל 5</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: לוח זרימה למיון של תאי BAL שלמים ומבודדים PBMCs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>יעד</td>
			<td>צעד</td>
			<td>שם תחל</td>
			<td colspan="4">פריימר סדרה</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HIV סה כ DNA או HIV משמאל למטה RNA</td>
			<td>הגברה מראש</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5 '-אמנות עכשווית TCT CTC TCT TTC תג C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ULF1</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG אמנות עכשווית CGT AAG CGT מעבד AAC TCT GGG TCT CTC TCT טה GAC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR בזמן אמת</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5 '-CTG AGG גת CTC תג טה CC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>למדת '</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG אמנות עכשווית CGT AAG CGT AAC T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>: משפחה</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/זן/C AAG CTT למעלה/3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנ א CD3</td>
			<td>הגברה מראש</td>
			<td>HCD3 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-הפעל GAC ATG גה הקאג הג AAG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-אמנות עכשווית GCT CTG התגית GCT ACA-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR בזמן אמת</td>
			<td>HCD3 בתוך 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-GGC החתול TCT TCT TCT AGG T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 ב 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT CTC TTC חתול טה AGC A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 משפחה:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/AG הקאג אגא A/זן/C AGT TAA מחסום CCT אמנות עכשווית T/3, 3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>המנון בלבד</td>
			<td>הגברה מראש</td>
			<td>GUSB קדימה 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-תג ACC AAT CTG CTG פעולה A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>היפוך GUSB 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-GTT הסוכנות האווירית למזגן גת C-3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR בזמן אמת</td>
			<td>GUSB קדימה 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-TGC TGC CTA CTA CTA גה גת G-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>היפוך GUSB 2:</td>
			<td colspan="4">מחבר 5-תג A-3 '-CCT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 2: פריימר ורצפים בדיקה עבור האיידס DNA ו-RNA הקוונפיקציה.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

אנו מתארים שיטה לעיבוד מכתשיים נוזל ששטיפה בהתאמה דם היקפי מאנשים כרוניים הנגועים באיידס על טיפול תרופתי להערכת מאגרי HIV ריאתי. שיטות אלה תוצאה של רכישת תאים CD4 T טהור מאוד מכתשי מקרופאגים שעשויים להיגרם לאחר מכן עבור immunophenotyping קלדה ו-DNA האיידס/RNA כימות על ידי תגובת שרשרת באולטרסאונד.

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

HIV הוא חשוך מרפא בשל התמדתו במאגרים הסלולר והאנטומי. שיטה זו מאפשרת הערכת מאגר HIV של תאים חיסוניים מבודדים מהריאות. טכניקה זו מאפשרת בידוד של תאי T ריאתיים ומאקרופאגים מכתש מנוזל BAL להערכה פנוטיפית או וירולוגית נוספת כמאגרים תאיים של HIV.הבנת הביולוגיה של מקרופאגים מכתליים ותאי T חיוביים CD4 ותרומתם למאגר HIV יכול להוביל תובנות חשובות על האתגרים העומדים בפני תרופה HIV. הבידוד של מקרופאגים ראשוניים מ- BAL יכול להיות מיושם על תחומי מחקר שונים אחרים, כולל מחלות ריאות דלקתיות או זיהומיות כגון אסטמה ושחפת. לאחר קבלת נוזל BAL מחולה אנושי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, מערבולת הנוזל בצינור האיסוף המקורי לפני העברת המדגם לצינור 50 מיליליטר בתוך ארון biosafety.אם הנוזל נראה מאוד עכור או מזוהם על ידי רקמה filamentous, לסנן את המדגם דרך מסנן רשת ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, להעביר את supernatant לצינור חדש 50 מיליליטר ולהשתמש קצה פיפטה כדי לשבור בעדינות את גלולה המכילה את כל תאי BAL. תוסיפו את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מדיום RPMI 1640 והוסיפו מיליליטר אחד של העל-טבעי השמור של כל אחד מ-10 צינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.הוסיפו 10 מיליליטר של העל-טבעי הנותר לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר והצבו את כל הדגימות העל-טבעיות באחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לדלל את ההשעיה תא גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום עבור כל 25 מיליליטר של המדגם המקורי ולאסוף את התאים BAL על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן לחץ מחדש את גלולה במיליליטר אחד של בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי, או FBS, לספירה.למיון תאים מונונוקלאריים שלמים של BAL ודם היקפי, הוסיפו חמש פעמים 10 לחמשת התאים לכל אחד משני צינורות פוליסטירן מעוגלים של חמישה מיליליטר לכל קבוצת משנה עבור פקדי הפיצוי הבלתי נגועים ומוכתמים בכדאיות והוסיפו את שאר דגימת קבוצת המשנה לצינור אחד של חמישה מיליליטר לדגימה. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את כדורי הבקרה ב 100 microliters של PBS לכל צינור על קרח עד שהם משמשים. תן שימוש חוזר כדורי התאים למיון ב 250 microliters של אחד ב 20 דילול של חיץ חסימת קולטן Fc במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום כל כריכה לא ספציפית.בסוף הדגירה החוסמת, מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המתאים למשך שעה נוספת של דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה העיקרית של הנוגדנים, הוסיפו מיליליטר אחד של PBS לכל צינור לצנטריפוגה והוסיפו את הכדורים ב-250 מיקרוליטרים של חיץ מיון על קרח המוגן מפני אור עד למיון. כדי להכין את בקרות הפיצוי, להוסיף שלוש טיפות כל אחד בחנוזי פיצוי קאפה אימונוגלובולין נגד עכבר וחרוזי פיצוי שליטה שלילית לכל מיליליטר של PBS לצינור microcentrifuge ולהעביר 100 microliters של פתרון חרוזים לכל מדגם לשמש לפיצוי.מוסיפים מיקרוליטר אחד של כל נוגדן בקוקטייל לכל צינור נפרד המכיל חרוזים ומוסיפים מיקרוליטר אחד של כתם כדאיות לכל צינור בקרת פיצוי כתמי כדאיות. לאחר 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של PBS לצינור ולתלות מחדש את כדורי ב 250 microliters של PBS טרי לצינור. טען את דגימת הבקרה הלא-נגועה של התא BAL כולו על ציטרומטר הזרימה והגדר את מטריצת הפיצוי.לאחר מכן לטעון את הצינור לדוגמה למיין את התאים תחת לחץ נמוך, gating כדי לא לכלול רעש, לכלול תאים חיים ו- CD45 חיובי, ולא לכלול את הכפילים. בתוך אוכלוסיית המיאלואידים הגדולה יותר, מיין את התאים הדו-חיוביים הכפולים CD206 ו- CD169 כמאקרופאגים מכתביים. בתוך אוכלוסיית הלימפוציטים הקטנה יותר, בודדו את התאים החיוביים ל-CD3 ומינו את האוכלוסיות החד-חיוביות CD4 ו-CD8.כדי למיין את דגימת התא המונונוקלארי בדם ההיקפי, שער כדי לא לכלול את הרעש והכפילות ולכלול את התאים החיים CD45 חיובי כפי שהודגם. לאחר gating על CD3, שער CD3 שלילי, CD14 חיובי תאים למיון מונוציטים חיובי יחיד שער CD3 חיובי, CD4, ו CD8 חיובי תאים למיון שתי האוכלוסיות החיוביות יחיד. בעת ספירת מדגם BAL שלם, ניתן לדמיין סוגי תאים שונים, כולל מקרופאגים עגולים גדולים יותר ולימפוציטים עגולים קטנים יותר.מקרופאגים הם סוג התא הנפוץ ביותר בנוזל BAL, המהווים כ -85% מהתאים בריאות שאינן מעשנות. תאים אלה מועשרים במעשנים עד כדי כך שהם נראים כמעט בלעדיים ונוטים להיות מוגדלים בכ -40% בהשוואה למאקרופאגים שנצפו אצל לא מעשנים. סמנים המשמשים למיון מקרופאגים מכתש מדגימות נוזל BAL נבחרו בהתבסס על פנוטיפים שתוארו בעבר של מקרופאגים מכתש, כגון קולטן mannose CD206 אשר קיים על תאים phagocytic ואת קולטן sialoadhesin CD169.לאחר הבידוד שלהם, מקרופאגים מים וסוגי תאים אחרים יכולים לשמש immunophenotyping על ידי ציטומטריה זרימה, בדיקות תפקודיות אימונולוגיות, או כימות מאגר על ידי PCR רגיש במיוחד. טכניקה זו מאפשרת גישה למאקרופאגים טהורים מאוד של תושבי רקמות, אשר מבחינה היסטורית היו קשים להשגה, ומאפשרת בדיקה בלתי מושגת בעבר של אוכלוסיית תאי החיסון המשמעותית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...