Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

著者らは、カナダ保健研究所(CIHR)(CC、MAJ、NCに#153082を付与する)の資金提供者を認めしたいと考えています。レソー・シダらマラディ感染症は、CCとMAJとCCに資金を与えたマギル大学医学部に資金を与えたデュ・フォンス・デ・レチェルチェ・デ・ケベック・サンテ(FRQ-S)です。この研究はまた、カナダ保健研究所(CIHR)-資金提供カナダHIVキュアエンタープライズ(CanCURE)チームグラントHB2 - 164064 MAJ、CCおよびNCに一部でサポートされました。MAJは、免疫学とCCとNCのCIHRカナダ研究委員長層2を保持し、それぞれFRQ-Sジュニア1とジュニア2研究給与賞を保持しています。ETはRI-MUHC学生シップ修士賞を受賞しています。
さらに、著者は、ホセ・ジルアードとサンプルの調整と取得に関与するすべての臨床スタッフ、ならびに呼吸療法士を認めしたいと考えています。RI-MUHC免疫フェノタイピングプラットフォームのエカテリーナ・イウルチェンコ、ヘレーヌ・パジェ=ヴェイレット、マリー=ヘレーヌ・ラコンブ。そして、顕微鏡写真の提供のためのマリアンナ・オルロヴァ博士。最も重要なことは、著者は、この研究が不可能であろう多くのボランティアに感謝したいと考えています。

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著者は何も開示していない。

ここでは、BAL液を処理してCD4 T細胞およびAMを得る方法を説明し、一致したPBMCと共に、肺内のHIV貯留部を調べるために研究することができる。我々は最近、一致した末梢血およびBALサンプルからのCD4 T細胞におけるHIVDNA定量について報告し、我々のグループは、HIVが末梢血15のものよりも肺CD4 T細胞に13倍多く存在することを実証した。しかし、AMにおけるHIV DNAのレベルはドナー依存であり、これまでのところ、マクロファージ15と比較してリンパ球中のHIV DNAレベルとの間に一貫した相関関係は存在しない。しかし、これらの主要なマクロファージ細胞サブセットへのアクセスは、この質問を尋問し、HIV貯蔵所の文脈で肺のウイルス負荷のより良い理解を得るための重要なツールとなります。
ART前の時代およびBAL流体を利用した他のいくつかの研究では、参加者は疑わしい病理を診断するか、呼吸器症状3の微生物学的診断を得るために気管支鏡検査を受けた。しかし、我々は、任意のアクティブな肺症状や病理なしで参加者を募集することができ、すべての参加者は、倫理的な同意フォーム15に署名しました.閉塞性肺疾患24のスピロメトリースクリーニング研究など、他の研究に参加した当センターから参加者を募集することができました。大腸 内視鏡 検査。HIVと一緒に住んでいる人々の間で以前の研究は利他主義が研究研究への参加を動機づける重要な要因であることを実証しました 25.多くの人間の標本と同様に、我々は人と人のばらつきの多くを指摘した。良好な細胞収率と低い細胞収率でBALを得る参加者を「予測」する方法はありませんでした。リンパ球のかなり一貫した数を生み出す末梢血とは異なり、BAL流体の細胞数は非常に変動する。肺に通常の生理食べ物のより多くの量を注入する(BAL液のより大きなリターンを得ることを期待して)通常の生理食生活の大きなボリュームは、多くの場合、より多くの咳と発熱後の気管支鏡検査のリスクが高いと関連しているので、常に可能ではありません。直径が小さい(大きい)気管支鏡を使用することで、呼吸器科医は気管支の奥深くに到達し、より多くの細胞を含む流体を得ることができることに気づきました。一貫した発見は、タバコ喫煙者はBAL流体内のリンパ球よりもはるかに大きな割合を持っていたというもので、これはAMが破片や粒子状物質を巻き込むと予想される。さらに、喫煙者からのBAL流体には、PCR装置や流量計などの機器を遮断する破片が含まれていることを観察しました。同様の問題は、汚染の多い地域や、大気の質の悪さにさらされる頻度が高い個人でも見られる可能性があります。
HIV貯留槽の確立とウイルス持続性における役割に関しては、CD4 T細胞およびAMの純度が重要な考慮事項である。このため、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、高純度の細胞集団を得ることを選びました。また、気管支鏡検査中に軽度の出血が予想されるため、採取されたBAL液が血液で汚染される可能性もある。ナイーブB細胞の存在はこれを示し、この問題を回避するために赤血球リシスバッファーで細胞を洗浄することができる。BAL流体を研究するもう一つの課題は、HIV持続性26を理解するために重要である炎症マーカーおよびサイトカインの定量化に関する。インスティファインされた生理食液がBAL液を希釈するにつれて、炎症性メディエーターおよびサイトカインのレベルを測定することは困難である場合がある。希尿素補正因子は希釈を考慮して提案されているが、その使用を説明する文献は比較的少ない27,28である。
AMは高度に自己蛍光性であり、細胞の選別とフローサイトメトリーのプノティピック解析中に問題を引き起します。特に、AMが完全に黒色で、自己蛍光に大きな影響を与える喫煙者では、その効果がより顕著です。標準的な青色の488 nmレーザーによって励起されると、AMの自己蛍光は約540 nmでピークにあり、FITCおよびPE29、30のような一般的に使用されるコンジュゲートの蛍光スペクトルと重なる。2つの別々のレーザーは、FITCとPEを励起するために使用することができることは注目に値します(例えば、青い488レーザーによって黄色/緑とFITCによるPE)。FITCで固有の自己蛍光を克服するために、染色されていないAMを使用して自己蛍光の背景を決定しました。さらに、蛍光マイナス1(FMO)制御の使用は、これらの技術的な問題に対処するために非常に有用であることができます。より大きなビーズ(例えば、7.5 μm)を使用することができ、これは、リンパ球集団の補償に使用できる小さなビーズ(例えば、3.0 μm)と比較して、マクロファージ集団を補償するためのサイズが近い。さらに適切なアプローチは、HLA-DRやCD45などのサブセット上の既知の高発現マーカーを使用して、単一染色コントロールとして細胞のごく一部を使用することです。ビーズで達成することができるよりも正確な補償。喫煙者のサンプルの場合、マクロファージがはるかに大きく、より自己蛍光性が高いため、この戦術は特に有用である。さらに、調製工程から、BALサンプル全体を、プロトコルのセクション3に記載されているようにソートする前にプレート内で培養することができ、接着により集団の分離を可能にする。このようにして、付着性マクロファージは、リンパ球などの他の非付着細胞から単離することができる。リンパ球とAM集団が一緒に調べるのではなく分離されている場合、補償ははるかに困難です。ただし、付着に頼るとマクロファージが失われ、セル数が既に制限されている場合に重要な考慮事項となります。また、付着ステップは、これらの細胞を使用して生成された下流の結果に影響を与える可能性があり、付着性単球の不要な活性化をもたらす可能性があります。細胞を効率的に純粋な集団に分類する価値は、その後の実験のためにそのような細胞を少なくするという制限に対して重み付けされなければならない。
他のモデル、特にマウスモデルは、マクロファージ免疫学的特性および生物学を研究するために使用されてきた。これらのモデルは非常に便利であり、操作が困難なセルタイプに対する大きな洞察を可能にしますが、制限があります。細胞表面マーカーの多くはマウスとヒトの間で変化し、ヒトAMの免疫表現型が完全に理解されていない。しかし、このモデルシステムは、各動物から入手可能な低い細胞数のためにアッセイのためにいくつかのマウスのプールを必要とします。さらに、標本をプールする必要性は、遺伝的素因と性別の考慮を排除します。近年、制限因子SAMHD-131の異なる発現に起因するHIV-1によるマクロファージの感染性において性が役割を果たすることが示されている。非ヒト霊長類(NHP)は、ヒトに最も近いモデルを表し、シミアン免疫不全ウイルス(SIV)感染の研究と免疫系への影響を促進し、組織常駐マクロファージの役割に関する洞察を提供した。単球由来マクロファージ。カゲサスマカクでは、肺マクロファージがBAL港から複製性の高いウイルスを単離することも示されている。ウイルス増殖アッセイ(VOA)は、組織常駐細胞32におけるSIVの挙動を分析するために用いた。このような知見は重要な研究価値であるが、適用する前にヒトで検証する必要があり、HPを使用するコストが高いため、大規模なサンプル集団の使用が妨げられます。さらに、ヒトAMは、インビトロウイルス/微生物感染アッセイなどの他の多くの用途や、結核/HIV共感染などの他の病原体の研究に役立ちます。

HIV感染の治療に直面する最も重要な課題の1つは、抗レトロウイルス療法(ART)1、2の中断後に血漿ウイルス血症のリバウンドを引き起こす潜伏HIV貯蔵所の存在である。長期ART中のHIV貯蔵所は、二次リンパ球器官、腸関連リンパ組織(GALT)、中枢神経系(CNS)を含むいくつかの組織区画でよく文書化されているが、肺は研究の領域として見落とされてきた。プレアート時代から3.しかし、肺はHIVの病因において中心的な役割を果たしている。実際、肺症状はエイズ関連の日和見感染症の最初の指標の一つであった4.現代のART時代でさえ、HIVを持つ人は、HIVを持たない人よりも感染性および非感染性肺疾患の両方を発症するリスクが高い。例えば、HIV感染者は、侵襲性連鎖球菌性肺炎感染症、ならびに慢性閉塞性肺疾患(COPD)5、6のリスクが高い。さらに、結核(結核)とHIVの共感染は、世界の特定の地域、特にサハラ以南のアフリカでは、HIV感染者がHIV7を持たない人よりも結核を有する可能性が16~27倍高いため、公衆衛生上の重要な課題である。肺感染症や慢性疾患に対するこの感受性に関するいくつかの説明が提案されているが、HIVを抑制した個人による正確な細胞機構は8、9、10である。血漿ウイルス負荷は、肺合併症のリスクが高いままで、完全には解明されていない。重要なことに、HIVは肺感染症および慢性疾患の非常に強い危険因子であり、喫煙状況6とは無関係である。
したがって、肺の免疫環境の分析は、健康および疾患におけるその役割を理解するために重要である。非侵襲的であるが、誘導された痰サンプルは、まれな肺リンパ球とAMを持つ大量の上皮細胞および破片を含む傾向があり、その役割は特定の用途に限定される。逆に、組織の大きな生検は、重大な出血および気胸(肺の崩壊)の関連リスクのために疑わしい疾患がない場合には得ることができない。さらに、肺免疫細胞の大部分は、主に呼吸中に抗原によって肺が継続的に刺激される粘膜レベルに位置しています。そのために、BAL液を得るための気管支鏡検査は、リンパ球およびAMへの比較的安全なアクセスを提供するという利点がある(図1参照)。マクロファージはBAL流体内の細胞の最大の割合を構成し、続いてリンパ球11が続く。したがって、免疫表現型、細胞培養、トランスクリプトミクス、またはそれ以上のアプリケーションなどの後続のアプリケーションで使用するためにBAL流体を処理する方法を確立することは有用である。ここで概説するBAL流体を処理するためのプロトコルは、前述の一般的な手順から適合され、採用される様々な下流アッセイ用に最適化されています。この方法論は、肺リンパ球と骨髄粘膜免疫細胞の両方の表現型および機能的特徴付けのための分離を可能にするだけでなく、HIVと一緒に住んでいる成人におけるHIV貯蔵所の評価を可能にする。
このプロトコルを確立するために、以下の基準を使用して、研究参加者15を募集しました。この研究に参加するには、(1)ARTに関する基準を満たすHIV感染者が少なくとも3年間、その人である必要がありました。(2)最低3年間のウイルス負荷(VL)を抑制した。(3) CD4 T セル数 ≥200/mm3;(4)スピロメトリーと気管支鏡検査の研究を受けることを喜んで。以下の基準を有する患者は、研究から除外された: (1) 気管支鏡検査への禁忌;(2)高出血リスク:凝固症またはワルファリンまたはクロピドグレル療法;(3) 血小板減少症 (低血小板);(4)活動的な肺感染症または他の急性肺プロセス;(5)妊娠/妊娠しようとしている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

気管支鏡検査は、正常な生理食塩水を気管支鏡を介して肺に注入し、吸引を適用し、気管支肺胞洗浄(BAL)液を除去する医療処置である。BAL流体は細胞が豊富であり、したがって、肺免疫milieuの「スナップショット」を提供することができます。CD4 T細胞は、最高の特徴を持つHIV貯蔵所であり、肺胞マクロファージ(AM)を含む組織マクロファージもウイルス貯留部として機能することを示唆する強力な証拠がある。しかし、HIV貯水池の設置とメンテナンスの文脈におけるAMの役割については、まだ多くは不明です。したがって、BAL流体を処理して、肺内の細胞集団およびサブセットを特徴付け、評価するためにウイルス学的および免疫学的アッセイに使用できる細胞を得るためのプロトコルを開発することは、HIVとしての肺の役割を理解するのに関連する。貯水池。ここでは、このようなプロトコルについて説明し、単純遠心分離およびフローサイトメトリーなどの標準的な技術を用いる。CD4 T細胞およびAMは、免疫フェノタイピングおよびHIV DNAおよびRNA定量を含むその後の用途に使用されてもよい。

ほとんどの非喫煙者では、BAL液は無菌容器で受け取られ、わずかに濁った黄色とオレンジ色の液体である。ドナーが気管支鏡検査中に気管支内生検を受け、いくつかの出血が起こった場合、流体は色がピンカーである可能性があります。ドナーが喫煙者である場合、流体は色が暗くなることがあります。遠心分離の後、BAL上清はほぼ透明でわずかにオレンジ色になり、細胞ペレットはサンプルの状態とドナーが喫煙者であったかどうかに応じて、オフホワイトから非常に暗い茶色に色の範囲をすることができます。
BALサンプル全体をカウントする場合、直径17μm前後の大きな丸いマクロファージと直径18,19の約7.3μmの小さな丸いリンパ球を含む、異なる細胞タイプを可視化することができます(図2参照)。マクロファージは喫煙者で約40%18まで拡大される。細胞型の区別は、マクロファージとリンパ球を別々にカウントすることを可能にする。また、特に喫煙者からのサンプルでは、フィールドに見えるいくつかの破片があるかもしれません。マクロファージはBALの中で最も豊富な細胞型であり、非喫煙者20の細胞の約85%を占めており、喫煙者に富んでいるため、ほとんど排他的に見えるかもしれません。
BAL セルは凝集する傾向があるため、すべての操作中に適切に混合する必要があります。ペレットは、いくつかの洗浄ステップの後でも暗く見えることがあります。細胞選別のために染色した後の分数に糸状の破片が明らかな場合は、細胞選別機を通してそれらを実行する前に、70 μmフィルターを通して細胞を通過します。
BAL細胞の選別は、マクロファージを収容するのに十分な大きさの液滴サイズを確保するために、低圧で行う必要があります。細胞は、最初にすべてのCD45 +21細胞を含むようにゲートされ、次に、すべての死んだ細胞が除外されることを確実にするために生存率に基づいています(図3参照)。その後、単一細胞が選択され、この中で、2つの集団は、サイズと形態、すなわちより大きな骨髄細胞とより小さなリンパ球に基づいてゲートされます(図3参照)。より大きなセル内では、細胞はCD20622、23およびCD16922でゲートされ、二重陽性細胞はAMとしてソートされ、小さなセル内ではCD3+セルが選択され、CD4およびCD8上でゲートされます。 CD4単正および CD8 単一陽性細胞がソートされます (図 3参照)。使用されたマーカーは、前述のAMの表現型に基づいて選択した、例えばマンノース受容体CD206、咽頭細胞23、およびシアロゲシン受容体CD16922に見出される。
PBMCをソートする場合、細胞は最初に前方および側散乱にゲートされ、そのすべてが均質なリンパ球集団を示す必要があり、そのすべてがゼロ軸に近いノイズを除いて撮影される(データは示されていない)。集団は生存率およびCD45にゲートされ、生きているCD45+細胞が使用される。この人口は CD3 にゲートされます。単球を単球に単離するために、CD3-集団はCD14上でゲートされ、すべての単一陽性細胞がソートされる。リンパ球サブセットを単離するために、CD3+細胞はCD4およびCD8上でゲートされ、単一陽性および細胞集団の両方がソートされる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> 図 1: プロトコルの概要。生成されたサンプルの潜在的なダウンストリーム使用を含む、プロトコルのワークフローを示す回路図。PBMC = 末梢血単核細胞;BAL = 気管支藻胞洗浄;LSM=リンパ球分離培地。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> 図 2:BAL液全体の顕微鏡視野。(A)非喫煙者および(B)目に見えるリンパ球(L)、マクロファージ(M)、および赤血球(RBC)を有する喫煙者からの顕微鏡画像。倍率は1,000倍(10倍眼、油浸入100倍レンズ)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> 図 3:BAL細胞全体の細胞選別のための代表的なゲーティング戦略。ALVEolarマクロファージ(AM)、CD4、およびCD8 T細胞をBAL細胞全体サンプルからソートするために使用されるゲーティング戦略。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>サンプル</td>
			<td>抗体</td>
			<td>フルオロクロム</td>
			<td>クローン</td>
			<td>テストあたりの体積(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">バルおよび PBMC</td>
			<td>ライブ/デッド</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-サイ7</td>
			<td>こんにちは30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>アレクサ700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-サイ5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAL のみ</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19.2年</td>
			<td>10歳</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7~239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBMC のみ</td>
			<td>CD14</td>
			<td>バンブ786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:BALセル全体と単離されたPBMCのソートのためのフローパネル。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ステップ</td>
			<td>プライマー名</td>
			<td colspan="4">プライマーシーケンス</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HIV総DNAまたはHIV LTR-ギャグRNA</td>
			<td>プリアンプ化 PCR</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5'-CCA TCT CTC TCC TTC タグ C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ウルフ1</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リアルタイム PCR</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5'-CTG AGGガット CTC タグ TTA CC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ラムダット</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ウヒヴ・ファムゼン:</td>
			<td colspan="4">5'-//56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TGA GGC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 DNA</td>
			<td>プリアンプ化 PCR</td>
			<td>HCD3 アウト 5'</td>
			<td colspan="4">5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 アウト 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCA GCT CTG タグ GGA ACA TAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リアルタイム PCR</td>
			<td>HCD3 in 5'</td>
			<td colspan="4">5'-GGCタットキャットTCT TCT TCA Agg T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 in 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 ファムゼン:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/AG CAG AGA AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA CCA T/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUSB RNA</td>
			<td>プリアンプ化 PCR</td>
			<td>GUSBフォワード1:</td>
			<td colspan="4">5'-ACC タグ AAT CTG CTG GCT ACT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSBリバース1:</td>
			<td colspan="4">5'- GTT CAAアカガットCAC ATC CAC ATA C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リアルタイム PCR</td>
			<td>GUSBフォワード2:</td>
			<td colspan="4">5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSBリバース2:</td>
			<td colspan="4">5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT タグ A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5'-/5HEX/TCGCTCACA/禅/CCAAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:HIVDNAおよびRNA定量のためのプライマーおよびプローブ配列。

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Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

肺気管支胞洗浄液を処理し、慢性HIV感染者の末梢血を抗レトロウイルス療法で処理し、肺HIV貯留部を評価する方法を説明する。これらの方法は、超高感性ポリメラーゼ連鎖反応による免疫フェノタイピングおよびHIV DNA/RNA定量に使用できる、非常に純粋なCD4 T細胞および肺胞マクロファージの獲得をもたらす。

肺胞マクロファージおよびCD4+T細胞免疫フェノタイピングおよびHIV貯蔵所評価のための気管支藻胞洗浄液および一致血液の処理

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

HIVは、細胞および解剖学的貯水池の持続性のために不治である。この方法は、肺から単離された免疫細胞のHIV貯留層評価を可能にする。この技術は、HIVの細胞貯留部としてさらなる表現性またはウイルス学的評価のために、BAL液から肺粘膜T細胞および肺胞マクロファージを単離することを可能にする。肺胞マクロファージとCD4陽性T細胞の生物学とHIVリザーバーへの貢献を理解することは、HIV治療が直面している課題に関する重要な洞察につながる可能性があります。BALからの主要なマクロファージの分離は、喘息および結核などの炎症性または感染性肺疾患を含む様々な他の研究分野に適用することができる。標準的なプロトコルに従って人間の患者からBAL液を得た後、バイオセーフティキャビネット内の50ミリリットルのチューブにサンプルを移す前に、元のコレクションチューブ内の流体を渦液。流体が非常に濁ったり、糸状組織によって汚染されている場合は、70マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターを通してサンプルを新しい50ミリリットルチューブにフィルターします。遠心分離後、上清を新しい50ミリリットルチューブに移し、ピペットチップを使用してBAL細胞全体を含むペレットをそっと分解します。ペレットをRPMI 1640培地の1ミリリットルに再懸濁し、10個の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管のそれぞれの予約上清の1ミリリットルを加える。残りの上清の10ミリリットルのアリコートを15ミリリットルの円錐管に加え、すべての上清サンプルをマイナス80°Cの貯蔵に入れます。元のサンプルの25ミリリットルごとに10ミリリットルの培地でペレット細胞懸濁液を希釈し、遠心分離によってBAL細胞を収集します。その後、10%の胎児ウシ血清(FBS)を添加した培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し、カウントする。BALおよび末梢血単核細胞全体の選別については、5つの細胞に5倍の5倍の10を5倍の5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブをサブセットごとに加え、染色されていない補償制御と生存性染色補償コントロールを行い、残りのサブセットサンプルを1つの5ミリリットルチューブに1本ずつ加えます。遠心分離によって細胞を収集し、それらが使用されるまで氷の上のチューブあたりPBSの100マイクロリットルでコントロールペレットを再中断します。細胞のペレットを20マイクロリットルのFc受容体遮断バッファーの20マイクロリットルで摂氏4度で1時間ずつ再懸濁し、非特異的結合を遮断する。ブロッキングインキュベーションの最後に、摂氏4度でさらに1時間のインキュベーションを目的とする適切な抗体カクテルを追加します。一次抗体インキュベーションの終わりに、遠心分離のために各チューブにPBSを1ミリリットル加え、選別するまで氷上の選別バッファーの250マイクロリットルでペレットを再中断します。補償制御を調製するために、PBSの1ミリリットル当たりの抗マウス免疫グロブリンκ補償ビーズと陰性対照補償ビーズをマイクロ遠心チューブにそれぞれ3滴ずつ加え、各サンプルに100マイクロリットルのビーズ溶液を移して補償に使用する。カクテル中の各抗体の1マイクロリットルをビーズを含む各チューブに1マイクロリットル加え、各生存性染色補償制御チューブに1マイクロリットルの生存性染色剤を加えます。光から保護された摂氏4度で20分後、チューブあたり1ミリリットルのPBSでサンプルを洗浄し、1チューブあたり新鮮なPBSの250マイクロリットルでペレットを再中断します。BALセルの非染色対照サンプルをフローサイトメーターにロードし、補償マトリックスを設定します。次にサンプルチューブをロードし、低圧で細胞をソートし、ノイズを除外し、生細胞およびCD45陽性細胞を含み、ダブレットを除外する。より大きな骨髄系の母集団の中で、CD206およびCD169二重陽性細胞を肺胞マクロファージとして並べ替える。小さなリンパ球集団内で、CD3陽性細胞を単離し、CD4およびCD8単一陽性集団を選別する。末梢血単核細胞試料を並べ替えるために、ゲートは、ノイズおよびダブレットを除外し、実証されるように生きたCD45陽性細胞を含む。CD3をゲーティングした後、CD3陰性、CD14陽性細胞をゲートして単一陽性単球を選別し、CD3陽性、CD4、およびCD8陽性細胞をゲートして、両方の単一陽性集団を選別します。BAL全体のサンプルを数えるとき、より大きい丸いマクロファージおよびより小さく、丸いリンパ球を含む異なった細胞タイプを視覚化することができる。マクロファージはBAL液中で最も豊富な細胞型であり、非喫煙者肺の細胞の約85%を占める。これらの細胞は、ほとんど排他的に見えるほど喫煙者に富んでおり、非喫煙者で観察されたマクロファージと比較して約40%拡大する傾向がある。BAL流体サンプルから肺胞マクロファージを選別するために用いられるマーカーは、貪食細胞およびシアロシェシン受容体CD169に存在するマンノース受容体CD206のような肺胞マクロファージの以前に記載された表現型に基づいて選択された。その分離後、肺胞マクロファージおよび他の細胞タイプは、フローサイトメトリー、免疫学的機能アッセイ、または超高感度PCRによるリザーバ定量による免疫整型に使用することができる。この技術は、歴史的に達成することが困難であった非常に純粋な組織居住マクロファージへのアクセスを可能にし、重要な免疫細胞集団の以前に達成不可能な検査を可能にする。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...