Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Авторы хотели бы отметить своих спонсоров: Канадские институты исследований в области здравоохранения (CIHR) (грант #153082 CC, MAJ, NC); Ресиу SIDA и недуги infectieuses дю Фонды де recherche дю Квебек-Санте (ФРЗ-S), который предоставил финансирование CC и MAJ и Макгилл университет факультета медицины, которые предоставили финансирование CC. Это исследование было также поддержано в части Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) - финансируемых канадских ВИЧ Cure Enterprise (CanCURE) Команда Грант HB2 - 164064 maj, CC и NC. MAJ имеет CIHR Канады научно-исследовательский председатель уровня 2 в иммуновирусологии и CC и NC провести FR-S Junior 1 и Junior 2 исследования заработной платы премии, соответственно. ET имеет награду RI-MUHC Studentship MSc.
Кроме того, авторы хотели бы отметить Хосе Джируара и весь клинический персонал, участвующий в координации и получении образцов, а также респираторных терапевтов; Екатерина Ивотченко, Элен Паже-Вейетт и Мари-Элен Лакомб на платформе RI-MUHC Immunophenotyping; и д-р Марианна Орлова для предоставления микроскопических фотографий. Самое главное, авторы хотели бы поблагодарить многих добровольцев, без которых это исследование было бы невозможно.

<ol>
	<li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+reservoirs+of+HIV:+obstacles+to+the+eradication+of+virus.">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+infection+of+CD4++T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1,+even+in+patients+on+effective+combination+therapy.">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li><li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection.">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li><li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+Kaposi's+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties,+California.">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li><li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+directions:+lung+aging,+inflammation,+and+human+immunodeficiency+virus.">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li><li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease?.">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO | Tuberculosis and HIV. , (2018).</li><li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function.">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li><li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR&#947;,+NADPH+Oxidases,+and+TGF&#946;.">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPAR&#947;, NADPH Oxidases, and TGF&#946;.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li><li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages.">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li><li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma:+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure.">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage.">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).</li><li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis;+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection.">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).</li><li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses.">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+persistence+in+mucosal+CD4++T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy.">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li><li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , (2004).</li><li>King, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , (2018).</li><li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls.">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li><li>Kuse, R., Schuster, S., Sch&#252;bbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls.">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li><li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung.">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li><li>Rheinl&#228;nder, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood,+Bronchoalveolar+Lavage,+and+Lung+Tissues.">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li><li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles.">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal,+Canada:+A+cross+sectional+study.">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li><li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+(CTN+173).">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li><li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cytokines+in+the+establishment,+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir.">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li><li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution.">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li><li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects.">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease.">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).</li><li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung.">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li><li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages.">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques.">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

В этом мы описали метод обработки жидкости BAL для получения CD4 Т-клеток и AMs, наряду с соответствующими ПБМК, которые могут быть изучены для исследования резервуара ВИЧ в легких. Недавно мы сообщили о количественной оценке ДНК ВИЧ в КЛЕТКах CD4 Т из соответствующих периферических образцов крови и BAL, и наша группа показала, что ВИЧ в 13 раз больше в легочных КЛЕТКах CD4 T, чем в клетках периферической крови15. Тем не менее, уровни ДНК ВИЧ в AMs являются донорами-зависимыми и поэтому, до сих пор не было последовательной корреляции между уровнями ДНК ВИЧ в лимфоцитах по сравнению с макрофагами15. Однако доступ к этим первичным подмноещем макрофаговных клеток будет жизненно важным инструментом для изучения этого вопроса и получения лучшего понимания вирусной нагрузки в легких в контексте резервуара ВИЧ.
В доарт эпохи и в ряде других исследований с использованием BAL жидкости, участники прошли бронхоскопию для того, чтобы диагностировать предполагаемую патологию или получить микробиологический диагноз для респираторных симптомов3. Тем не менее, мы смогли набрать участников без каких-либо активных легочных симптомов или патологий, и все участники подписали этические согласия форме15. Мы смогли набрать участников из нашего центра, которые принимали участие в других исследованиях, таких как скрининг-исследование спирометрии на обструктивную болезнь легких24, а также тех, кто проходит другие исследовательские процедуры, такие как лейкаперез и Колоноскопия. Предыдущие исследования среди людей, живущих с ВИЧ, показали, что альтруизм является ключевым фактором, мотивирующим участие в научных исследованиях25. Как и многие человеческие образцы, мы отметили большую изменчивость от человека к человеку. Существовал никоим образом не "предсказать", из которых участники мы получим BAL с хорошим и плохим и плохой урожайности клеток. В отличие от периферической крови, которая дает довольно последовательное количество лимфоцитов, номера клеток в жидкости BAL очень изменчивы. Впрыскивание большего объема нормального солева в легкие (в надежде получить большую отдачу от жидкости BAL) не всегда возможно, так как большие объемы нормального солевая часто связаны с большим кашлем и более высоким риском лихорадки постбронхоскопии. Мы заметили, что использование меньшего (а не большего) диаметра бронхоскопа позволило респиратору глубже проникнуть в бронхи и получить жидкость, содержащую большее количество клеток. Последовательный вывод заключался в том, что курильщики табака имели гораздо большую долю АМ, чем лимфоциты в их жидкости BAL, которая, как ожидается, по мере поглощения мусора и твердых частиц. Кроме того, мы заметили, что жидкость BAL от курильщиков содержала мусор, который может блокировать используемое оборудование, такое как пЦР-машины и цитометры потока. Аналогичные проблемы могут наблюдаться в районах с высоким уровнем загрязнения или в районах с высоким уровнем загрязнения или в районах, где люди чаще подвергаются воздействию низкого качества воздуха.
Что касается их роли в создании резервуаров для ВИЧ и вирусной настойчивости, то ключевым фактором является чистота Т-клеток и АМ CD4. По этой причине мы решили использовать флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS) для получения очень чистой популяции клеток. Также возможно, что собранная жидкость BAL может быть загрязнена кровью, так как во время бронхоскопии ожидаются незначительные кровотечения; наличие наивных В-клеток будет означать это, и клетки могут быть вымыты в буфере лиза красных кровяных телец, чтобы обойти эту проблему. Еще одна проблема с изучением жидкости BAL относится к количественной воспалительной маркеров и цитокинов, которые важны для понимания сохранения ВИЧ26. Как привили солен разбавляет BAL жидкости, уровни воспалительных посредников и цитокинов может быть трудно измерить. Хотя коэффициент коррекции мочевины был предложен для учета разбавления, есть относительно мало литературы, описывающей его использование27,28.
АМ являются высокой аутофлуоресцентной, которая создает проблемы во время сортировки клеток и потока цитометрического анализа цинотипии. В частности, эффект более выражен у курильщиков, чьи АМ могут быть полностью черного цвета, что существенно влияет на их автофлюоресценцию. При возбуждении стандартным синим 488 нм лазером, am autofluorescence находится на пике примерно 540 нм, который перекрывается с флуоресценции спектры обычно используемых конъюгатов, таких как FITC и PE29,30. Стоит отметить, что два отдельных лазера могут быть использованы для возбуждения FITC и PE (например, PE желтым/зеленым и FITC синим лазером 488). Чтобы преодолеть присущую автофлюоресценцию с FITC, мы использовали неокрашенные AMs для определения фоне автофлюоресценции. Кроме того, использование средств контроля за флуоресценцией минус один (FMO) может быть очень полезным для борьбы с этими техническими проблемами. Можно использовать более крупные бусы (например, 7,5 мкм), которые ближе по размеру для компенсации популяций макрофагов, по сравнению с меньшими бусинами (например, 3,0 мкм), которые могут быть использованы для компенсации популяций лимфоцитов. Еще более подходящим подходом было бы использовать небольшую часть клеток в качестве одного пятна управления, используя известный, высоко выраженный маркер на подмножестве, таких как HLA-DR или CD45, сопряжены с каждым из желаемых флюорохромов, что позволило бы гораздо больше точная компенсация, чем может быть достигнуто с бисером. В случае образцов курильщиков эта тактика особенно полезна, так как макрофаги гораздо крупнее и более автофлуоресцентны. Кроме того, с момента подготовки весь образец BAL может быть культивирован в тарелке перед сортировкой, как описано в разделе 3 протокола, чтобы позволить разделение популяций путем присоединения. Таким образом, адепт макрофаги могут быть изолированы от других непридерживаться клеток, таких как лимфоциты. Компенсация является гораздо менее сложной задачей, если лимфоциты и популяции АМ разделены, а не рассматриваются вместе; однако, полагаясь на присоединение приведет к потере макрофагов, что является важным фактором, когда число клеток уже ограничено. Кроме того, шаг присоединения может привести к нежелательной активации адептмонов, которые могут повлиять на результаты вниз по течению, генерируемые с помощью этих клеток. Значение эффективной сортировки клеток в более чистые популяции должно быть взвешено против ограничения наличия меньшего количества таких ячеек для последующих экспериментов.
Другие модели, в первую очередь моделя мурин, были использованы для изучения макрофагов иммунологических характеристик и биологии. Хотя эти модели чрезвычайно полезны и позволяют получить представление о типе ячейки, которым трудно манипулировать, они имеют ограничения. Многие из маркеров поверхности клеток различаются между мышами и людьми таким образом, что иммунофенотип человека AMs не до конца понял. Тем не менее, эта модель наячнтребует объединения нескольких мышей для анализов из-за низких количеств клеток, доступных от каждого животного. Кроме того, необходимость объединения образцов исключает соображения генетической предрасположенности и пола. Недавно было показано, что секс играет роль в инфекционности макрофагов ВИЧ-1 из-за разрозненных выражения фактора ограничения SAMHD-131. Нечеловеческие приматы (NHP) представляют собой ближайшую к человеку модель и способствовали изучению инфекции вируса иммунодефицита (SIV) и его влияния на иммунную систему, обеспечивая понимание роли макрофагов, проживающих в тканях по сравнению с макрофагов, полученных моноцитами. В резус макаки, было также показано, что легкие макрофаг изоляты из BAL гавани репликации компетентных вирусов; вирусный анализ нароста (VOA) был использован для анализа поведения SIV в клетках-резидентах тканей32. Такой вывод имеет важное значение для исследований, но все еще должен быть проверен на людях, прежде чем он может быть применен, и высокая стоимость использования NHPs исключает использование больших популяций выборки. Кроме того, аМ-аМ для человека будут полезны для многих других применений, таких как анализы вирусных/микробных инфекций in vitro, а также при исследованиях других патогенных микроорганизмов, таких как туберкулез/ВИЧ-инфекция.

Одной из наиболее значительных проблем, стоящих перед лекарством от ВИЧ-инфекции, является наличие скрытого резервуара ВИЧ, который вызывает отскок плазменной виремии после прерывания антиретровирусной терапии (АРТ)1,2. В то время как резервуар ВИЧ во время длительной АРТ хорошо документирован в нескольких отделениях тканей, включая вторичные лимфоидные органы, связанную с кишечником лимфоидную ткань (GALT) и центральную нервную систему (ЦНС), легкие были упущены из виду как область исследования с эпохи до АРТ3. Однако легкие играют центральную роль в патогенезах ВИЧ. Действительно, легочные симптомы были одними из первых показателей связанных со СПИДом оппортунистических инфекций4. Даже в современную эпоху АРТ люди с ВИЧ подвергаются большему риску развития как инфекционных, так и неинфекционных заболеваний легких, чем лица без ВИЧ. Например, лица с ВИЧ-инфекцией подвергаются повышенному риску развития инвазивной стрептококковой пневмонии, а также хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ)5,6. Кроме того, коинфекция туберкулеза (ТБ) и ВИЧ является серьезной проблемой общественного здравоохранения в некоторых регионах мира, в частности в странахАфрики к югу от Сахары, поскольку вероятность заражения ВИЧ ВИЧ в 16-27 раз выше, чем у лиц, не имеющих ВИЧ-7. Хотя некоторые объяснения этой восприимчивости к легочной инфекции и хронических заболеваний были предложены8,9,10, точные клеточные механизмы, с помощью которых люди с подавленным ВИЧ плазменной вирусной нагрузки остаются на более высокий риск легочных осложнений не были полностью выяснены. Важно отметить, что ВИЧ является очень сильным фактором риска легочной инфекции и хронических заболеваний, независимо от статуса курения6.
Анализ иммунной среды легких, поэтому, имеет решающее значение для того, чтобы понять его роль в здоровье и болезни. Хотя неинвазивные, индуцированные образцы грядки, как правило, содержат большое количество эпителиальных клеток и мусора с редкими легочными лимфоцитами и без АМ, ограничивая их роль конкретными приложениями. И наоборот, крупные биопсии тканей не могут быть получены при отсутствии подозрений на заболевание из-за связанных с этим рисков значительного кровотечения и пневмоторакса (коллапса легких). Кроме того, большинство легочных иммунных клеток в основном расположены на уровне слизистой оболочки, где легкие постоянно стимулируются антигенами во время дыхания. С этой целью бронхоскопия для получения жидкости BAL имеет то преимущество, что обеспечивает относительно безопасный доступ к лимфоцитам и АМ (см. рисунок1). Макрофаги составляют наибольшую долю клеток в жидкости BAL, за которыми следуют лимфоциты11. Поэтому полезно создать метод, с помощью которого жидкость BAL может быть обработана для использования в последующих приложениях, таких как иммунофенотипирование, клеточная культура, транскриптомика или любые дальнейшие применения. Протокол для обработки жидкости BAL, изложенные здесь, адаптирован из общих процедур, описанных ранее и оптимизированных для различных анализов вниз по течению. Эта методология позволяет проводить изоляцию как легочных лимфоидных, так и миелоидных слизистой иммунных клеток для их фенотипической и функциональной характеристики, а также оценку резервуара ВИЧ у взрослых, живущих с ВИЧ.
Для установления этого протокола мы использовали следующие критерии для набора участников исследования15. Для того чтобы участники имели право участвовать в этом исследовании, они должны были быть ВИЧ-инфицированными лицами, которые отвечали следующим критериям: (1) по АРТ в течение по крайней мере 3 лет; (2) подавленная вирусная нагрузка (VL) в течение как минимум 3 лет; (3) количество клеток CD4 T вразмере 200/мм 3; (4) готовы пройти исследования спирометрии и бронхоскопии. Пациенты со следующими критериями были исключены из исследования: (1) противопоказание (ы) к бронхоскопии; (2) высокий риск кровотечения: коагулопатия или на варфарин или клопидогрел терапии; (3) тромбоцитопения (низкие тромбоциты); (4) активная легочная инфекция или другой острый пульмонный процесс; (5) беременная/пытаясь забеременеть.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

Бронхоскопия является медицинской процедурой, в которой нормальный сосуд вводится в легкие через бронхоскоп, а затем всасывание применяется, удаление бронхоальвеолярной лавыни (BAL) жидкости. BAL жидкости богата клетками и, таким образом, может обеспечить "снимок" легочной иммунной среды. CD4 Т-клетки являются наиболее характеризуемыми резервуарами ВИЧ, в то время как есть веские доказательства того, что макрофаги тканей, в том числе альвеолярные макрофаги (AMs), также служат в качестве вирусных резервуаров. Тем не менее, многое еще неизвестно о роли AMs в контексте создания и поддержания резервуаров ВИЧ. Таким образом, разработка протокола для обработки жидкости BAL для получения клеток, которые могут быть использованы в вирусологических и иммунологических анализов для характеристики и оценки популяций клеток и подмножеств в легких имеет отношение к пониманию роли легких, как ВИЧ Водохранилищ. Здесь мы описываем такой протокол, используя стандартные методы, такие как простая центрифугация и цитометрия потока. CD4 Т-клеток и AMs могут быть использованы для последующего применения, в том числе иммунофенотипирования и ВИЧ ДНК и РНК количественной оценки.

У большинства некурящих жидкость BAL поступает в стерильный контейнер и представляет собой слегка мутную желто-оранжево-оранжевую жидкость. В жидкости может быть розовый цвет, если донор перенес эндобронхиальной биопсии во время бронхоскопии и некоторые кровотечения произошло. Если донором является курильщик, жидкость может быть более темного цвета. После центрифугации, BAL супернатант будет почти ясным и слегка оранжевым, в то время как клеточные гранулы могут варьироваться в цвете от белого до очень темно-коричневого, в зависимости от состояния образца и был ли донор курильщиком или нет.
При подсчете всего образца BAL, различные типы клеток могут быть визуализированы, в том числе большие, круглые макрофаги около 17 мкм в диаметре и меньше круглых лимфоцитов около 7,3 мкм в диаметре18,19 (см. Рисунок 2). Макрофаги увеличены у курильщиков примерно на 40%18. Различие между типами клеток позволяет рассчитывать макрофаги и лимфоциты отдельно. Там также могут быть некоторые обломки видны в поле, особенно в образцах от курильщиков. Макрофаги являются наиболее распространенным типом клеток в BAL, на долю которых приходится около 85% клеток у некурящих20, и они обогащаются у курильщиков, поэтому они могут показаться почти эксклюзивными.
КЛЕТКи BAL имеют тенденцию к агрегированию, поэтому они должны быть хорошо смешаны во время всех манипуляций. Гранулы могут казаться темными даже после нескольких шагов мытья. Если нитевидный мусор проявляется в фракции после окрашивания для сортировки клеток, пройти клетки через 70 мкм фильтр, прежде чем запустить их через сортировку ячейки.
Сортировка BAL-клеток должна осуществляться под низким давлением, чтобы обеспечить размеры капель, достаточно большие для размещения макрофагов. Клетки сначала закрыты, чтобы включить все CD45и21 ячейки, а затем на основе жизнеспособности, чтобы обеспечить все мертвые клетки исключены (см. Рисунок 3). Singlet клетки затем выбрали и в рамках этого, две популяции закрыты на основе размера и морфологии, а именно большие миелоидные клетки и меньшие лимфоциты (см. Рисунок 3). В более крупных ячеек, клетки закрыты на CD20622,23 и CD16922 и двойные положительные клетки сортируются как AMs, в то время как в меньших ячеек, CD3- клетки выбираются и закрыты на CD4 и CD8; Сортируются одноположительные и cd8 одноположительные ячейки CD4 (см. рисунок3). Используемые маркеры были выбраны на основе ранее описанных фенотипов AMs, таких как рецептор маннозы CD206, найденный на фагоцитарных клетках23, и рецептор sialoadhesin CD16922.
При сортировке ПБМК, клетки сначала закрыты на передний и боковой рассеяния, которые должны показать однородную популяцию лимфоцитов, все из которых взяты, исключая шум близко к нулевой оси (данные не показаны). Население закрыто на жизнеспособность и CD45, и живые клетки CD45 используются. Это население затем закрыто на CD3; чтобы изолировать моноциты, CD3- население впоследствии закрыто на CD14 и все одиночные положительные клетки сортируются. Чтобы изолировать подмножества лимфоцитов, клетки CD3и закрыты на CD4 и CD8 и как одиночные положительные и клеточные популяции сортируются.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> Рисунок 1 обзор протокола. Схема, показывающая рабочий процесс протокола, включая потенциальное использование сгенерированных образцов. PBMC - периферийные моноядерные клетки крови; БАЛ - бронхоальвеолярная лаваж; ЛСМ и среда разделения лимфоцитов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> Рисунок 2 : Микроскоп поле зрения всей жидкости BAL. Микроскоп изображения из (A) некурящий и (B) курильщик с видимыми лимфоцитами (L), макрофаги (M), и эритроцитов (РБК). Увеличение 1000x (10x глазной и 100x объектив с погружением масла). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> Рисунок 3 : Представитель gating стратегии для сортировки клеток целых BAL ячеек. Стратегия Gating используется для сортировки альвеолярных макрофагов (AM), CD4 и CD8 T-клеток из целых образцов BAL-клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Образец</td>
			<td>Антитела</td>
			<td>Фторхром</td>
			<td>Клон</td>
			<td>Объем на тест (КЛ)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL и PBMC</td>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-cy5</td>
			<td>РПА-Т4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAL только</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19.2</td>
			<td>10 Лет</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Только PBMC</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Панель потока для сортировки целых балков и изолированных ПБМК.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Целевой</td>
			<td>Шаг</td>
			<td>Имя праймер</td>
			<td colspan="4">Праймер Последовательность</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ВИЧ Всего ДНК или ВИЧ LTR-Gag РНК</td>
			<td>Предусилительация ПЦР</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5'-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ULF1</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTa GAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ПЦР в реальном времени</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTa CC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ЛамбдаТ</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>УВИЧ Фамзен:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ЗЕН/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkF'/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 ДНК</td>
			<td>Предусилительация ПЦР</td>
			<td>HCD3 из 5'</td>
			<td colspan="4">5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 из 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ПЦР в реальном времени</td>
			<td>HCD3 в 5'</td>
			<td colspan="4">5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 в 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTa AGT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 Фамзен:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkF'/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГУСБ РНК</td>
			<td>Предусилительация ПЦР</td>
			<td>ГУСБ Вперед 1:</td>
			<td colspan="4">5'-АКК TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Обратный 1:</td>
			<td colspan="4">5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC ATA ATA C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ПЦР в реальном времени</td>
			<td>ГУСБ Вперед 2:</td>
			<td colspan="4">5'-TGC TGG CTA CTT GAA GAT G-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Обратный 2:</td>
			<td colspan="4">5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ГУСБ-ХЕКС:</td>
			<td colspan="4">5'-/5HEX/TCGCACA/ЗЕН/CCAAATCCTGGACC/3IABkF/-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Праймер и последовательности зондов для количественной оценки ДНК ВИЧ и РНК.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Мы описываем метод обработки бронхоальвеолярной жидкости для лаважа и соответствующей периферической крови хронически ВИЧ-инфицированных лиц на антиретровирусной терапии для оценки легочных резервуаров ВИЧ. Эти методы приводят к приобретению высокочистых CD4 Т-клеток и альвеолярных макрофагов, которые впоследствии могут быть использованы для иммунофенотипирования и количественных показателей ДНК/РНК с помощью сверхчувствительной полимеразной цепной реакции.

Обработка бронхоальвеолярной жидкости и совмещенных крови для альвеолярного макрофага и CD4- Т-клеточного иммунофенотипирования и оценки водохранилища ВИЧ

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

ВИЧ неизлечим из-за его сохранения в клеточных и анатомических резервуарах. Этот метод позволяет оценку резервуара ВИЧ иммунных клеток, изолированных из легких. Этот метод позволяет изоляции легочных слизистых Т-клеток и альвеолярных макрофагов из жидкости BAL для дальнейшей фенотипической или вирусологической оценки в качестве клеточных резервуаров ВИЧ.Понимание биологии альвеолярных макрофагов и CD4-положительных Т-клеток и их вклад в резервуар для ВИЧ может привести к важному пониманию проблем, стоящих перед лечением ВИЧ. Изоляция первичных макрофагов от BAL может быть применена в различных других областях исследований, включая воспалительные или инфекционные заболевания легких, такие как астма и туберкулез. После получения жидкости BAL от пациента человека в соответствии со стандартными протоколами, вихрь жидкости в оригинальной трубке сбора перед передачей образца в 50-миллилитровую трубку в биобезопасности кабинета.Если жидкость кажется очень мутной или загрязненной нитей ткани, фильтровать образец через 70-микрометровый фильтр нейлоновой сетки в новую 50-миллилитровую трубку. После центрифугации перенесите супернатант в новую 50-миллилитровую трубку и используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно разбить гранулы, содержащие целые клетки BAL. Повторное использование гранул в один миллилитр RPMI 1640 среды и добавить один миллилитр зарезервированных supernatant каждого из 10 1,5-миллилитров микроцентрифуг труб.Добавьте 10-миллилитровые алициты оставшегося супернатанта в 15-миллилитровые конические трубки и поместите все образцы супернатанта в хранилище по температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разбавить подвеску гранулы в 10 миллилитров среды на каждые 25 миллилитров оригинального образца и собирать клетки BAL центрифугации. Затем повторно посовечите гранулы в один миллилитр среды, дополненный 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота, или FBS, для подсчета.Для сортировки целых BAL и периферических моноядерных клеток крови, добавить пять раз 10 к пяти клеткам к каждому из двух пяти-миллилитрового круглого дна полистирола труб на подмножество для необложенных и жизнеспособности окрашенных компенсации контроля и добавить остальную часть каждого подмножества образца в один пятими миллилитров трубки на образец. Соберите клетки путем центрифугации и повторно использовать контрольные гранулы в 100 микролитров PBS на трубку на льду, пока они не будут использованы. Resuspend гранулы клеток для сортировки в 250 микролитров один из 20 разбавления рецепторов Fc блокирование буфера в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию, чтобы заблокировать любые неспецифические связывания.В конце блокирующей инкубации добавьте соответствующий коктейль антител, представляющий интерес для дополнительной часовой инкубации при четырех градусах цельсия. В конце первичной инкубации антител добавьте по миллилитр PBS в каждую трубку для центрифугации и повторно посовестит гранулы в 250 микролитров буфера сортировки на льду, защищенном от света до сортировки. Чтобы подготовить компенсационный контроль, добавьте по три капли каждой из антимошейных иммуноглобулиных каппа компенсационных бусин и отрицательный контроль компенсации шариков на один миллилитр PBS в микроцентрифуг трубки и передать 100 микролитров шарикового раствора для каждого образца, которые будут использоваться для компенсации.Добавьте один микролитер каждого антитела в коктейле к каждой отдельной трубке, содержащей бисер, и добавьте один микролитер пятна жизнеспособности к каждой трубке контроля компенсации пятен жизнеспособности. Через 20 минут при четырех градусах Цельсия защищены от света, мыть образцы с одним миллилитром PBS на трубку и повторно гранулы в 250 микролитров свежего PBS на трубку. Загрузите образец управления всей ячейкой BAL на цитометр потока и навейте матрицу компенсации.Следующая загрузка образца трубки и сортировать клетки под низким давлением, gating исключить шум, включить живые и CD45-положительные клетки, а также исключить дублеты. В пределах большей популяции миелоидов сортируют двойные положительные клетки CD206 и CD169 как альвеолярные макрофаги. В пределах меньшей популяции лимфоцитов изолируйте CD3-положительные клетки и сортируйте однопоймятные популяции CD4 и CD8.Сортировать образец моноядерных клеток периферической крови, ворота, чтобы исключить шум и дублеты и включить живые CD45-положительные клетки, как попродемонстрировано. После gating на CD3, ворота CD3-отрицательные, CD14-положительные клетки для сортировки одно-положительных моноцитов и ворота CD3-положительных, CD4, и CD8-положительных клеток для сортировки обоих одно-положительных популяций. При подсчете образца whole-BAL можно визуализировать различные типы клеток, включая более крупные, круглые макрофаги и меньшие круглые лимфоциты.Макрофаги являются наиболее распространенным типом клеток в жидкости BAL, что составляет около 85% клеток в легких некурящих. Эти клетки обогащаются у курильщиков до точки кажущейся почти эксклюзивной и, как правило, увеличиваются примерно на 40% по сравнению с макрофагами, наблюдаемыми у некурящих. Маркеры, используемые для сортировки альвеолярных макрофагов из образцов жидкости BAL, были выбраны на основе ранее описанных фенотипов альвеолярных макрофагов, таких как маннозный рецептор CD206, который присутствует на фагоцитарных клетках и рецепторе sialoadhesin CD169.После их изоляции альвеолярные макрофаги и другие типы клеток могут быть использованы для иммунофенотипинга путем цитометрии потока, иммунологических функциональных анализов или количественной оценки резервуара сверхчувствительным ПЦР. Этот метод обеспечивает доступ к высоко чистой ткани резидентов макрофагов, которые исторически были трудно достичь, что позволяет ранее недостижимое исследование значительной популяции иммунных клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Индукционная трансплантат против хозяина и<em&gt; В Vivo</em&gt; Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Использование ротоглотки интратрахеального PAMP администрации и бронхоальвеолярного лаважа для оценки иммунного ответа хозяина у мышей

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em&gt; В естественных условиях</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Воображение CD4 Т-клеток Внутритканевая миграции в воспаленном дермы

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Бронхоальвеолярное спазмы легких у мышей для анализа воспалительной клеточной инфильтрации

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...