Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Los autores desean reconocer a sus funderos: los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR) (conceder #153082 a CC, MAJ, NC); el Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) que otorgó fondos a CC y MAJ y a la Facultad de Medicina de la Universidad McGill que concedió fondos a CC. Este estudio también fue apoyado en parte por los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR)- financiado por el equipo canadiense de la empresa de curación del VIH (CanCURE) Subvención HB2 – 164064 a MAJ, CC y NC. MAJ tiene la Cátedra de Investigación CIHR Canadá tier 2 en Inmunovirología y CC y NC poseen un premio de salario de investigación FRQ-S Junior 1 y Junior 2, respectivamente. ET posee un premio RI-MUHC Studentship MSc.
Además, los autores desean reconocer a Josée Girouard y a todo el personal clínico involucrado en la coordinación y obtención de las muestras, así como a los terapeutas respiratorios; Ekaterina Iourtchenko, Héléne Pagé-Veillette y Marie-Héléne Lacombe en la plataforma de inmunofenotipado RI- MUHC; y la Dra. Marianna Orlova para el suministro de las fotos de la microscopía. Lo más importante es que los autores desean dar las gracias a los muchos voluntarios sin los cuales esta investigación no sería posible.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un método para procesar el líquido BAL para obtener células T CD4 y AM, junto con PBMCs emparejados, que se pueden estudiar para investigar el reservorio de VIH dentro de los pulmones. Recientemente informamos sobre la cuantificación del ADN del VIH en células T CD4 a partir de muestras de sangre periférica y BAL coincidentes, y nuestro grupo demostró que el VIH es 13 veces más abundante en los glóbulos T CD4 pulmonares que en los de sangre periférica15. Sin embargo, los niveles de ADN del VIH en los malens son dependientes de los donantes y, por lo tanto, hasta ahora, no ha habido una correlación constante entre los niveles de ADN del VIH en los linfocitos en comparación con los macrófagos15. El acceso a estos subconjuntos primarios de células macróforas, sin embargo, será una herramienta vital para interrogar esta pregunta y obtener una mejor comprensión de la carga viral en el pulmón en el contexto del reservorio del VIH.
En la era pre-ART y en varios otros estudios utilizando líquido BAL, los participantes se sometieron a broncoscopia con el fin de diagnosticar una sospecha de patología u obtener un diagnóstico microbiológico de los síntomas respiratorios3. Sin embargo, pudimos reclutar participantes sin ningún síntoma pulmonar activo o patologías y todos los participantes firmaron un formulario de consentimiento ético15. Pudimos reclutar participantes de nuestro centro que participaban en otros estudios, como un estudio de detección de espirometría para la enfermedad pulmonar obstructiva24,así como aquellos sometidos a otros procedimientos de investigación, como la leucoféresis y Colonoscopia. Investigaciones previas entre personas que viven con el VIH demostraron que el altruismo es un factor clave que motiva la participación en estudios de investigación25. Al igual que con muchos especímenes humanos, observamos una gran cantidad de variabilidad de persona a persona. No había manera de "predecir" de qué participantes obtendríamos BAL con rendimientos celulares buenos frente a los pobres. A diferencia de la sangre periférica, que produce un número bastante consistente de linfocitos, los números celulares en el líquido BAL son muy variables. Inyectar un mayor volumen de salina normal en los pulmones (con la esperanza de obtener un mayor retorno del líquido BAL) no siempre es posible, ya que los volúmenes más grandes de salina normal a menudo se asocian con más tos y un mayor riesgo de postbroncoscopia de fiebre. Nos dimos cuenta de que el uso de un broncoscopio de diámetro más pequeño (en lugar de mayor) permitió al relecionólogo llegar más profundamente a los bronquios y obtener líquido que contiene mayores cantidades de células. Un hallazgo consistente fue que los fumadores de tabaco tenían proporciones mucho mayores de AMs que los linfocitos dentro de su líquido BAL, lo que se espera cuando los AM envuelven escombros y partículas. Además, observamos que el líquido BAL de los fumadores contenía desechos que pueden bloquear el equipo utilizado, como las máquinas PCR y los citometros de flujo. Pueden observarse problemas similares en áreas de alta contaminación o en individuos expuestos con mayor frecuencia a la mala calidad del aire.
Con respecto a su papel en el establecimiento de los reservorios del VIH y la persistencia viral, la pureza de los células T CD4 y los AM es una consideración clave. Por esta razón, optamos por utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para obtener poblaciones celulares altamente puras. También es posible que el líquido BAL recogido pueda estar contaminado con sangre, ya que se espera un sangrado menor durante una broncoscopia; la presencia de células B ingenuas indicaría esto, y las células se pueden lavar en un tampón de lisis de glóbulos rojos para evitar este problema. Otro desafío con el estudio del líquido BAL se relaciona con la cuantificación de marcadores inflamatorios y citoquinas, que son importantes para entender la persistencia del VIH26. Como la salina inculcada diluye el líquido BAL, los niveles de mediadores inflamatorios y citoquinas pueden ser difíciles de medir. Aunque se ha propuesto un factor de corrección de la urea para dar cuenta de la dilución, hay relativamente poca literatura que describa su uso27,28.
Los aMs son altamente autofluorescentes, lo que plantea un problema durante la clasificación celular y el análisis fenotípico de citometría de flujo. En particular, el efecto es más pronunciado en los fumadores cuyos MAL pueden ser completamente de color negro, afectando significativamente a su autofluorescencia. Cuando se excita con un láser azul estándar de 488 nm, la autofluorescencia AM se encuentra en su apogeo en aproximadamente 540 nm, que se superpone con los espectros de fluorescencia de conjugados de uso común como FITC y PE29,30. Vale la pena señalar que dos láseres separados se pueden utilizar para excitar FITC y PE (por ejemplo, PE por el amarillo / verde y FITC por el láser azul 488). Para superar la autofluorescencia inherente con FITC, utilizamos AMs no manchados para determinar el fondo de autofluorescencia. Además, el uso de controles de fluorescencia menos uno (FMO) puede ser muy útil para combatir estos problemas técnicos. Se pueden utilizar perlas más grandes (p. ej., 7,5 m), que son más de tamaño para compensar las poblaciones de macrófagos, en comparación con las cuentas más pequeñas (por ejemplo, 3,0 m), que se pueden utilizar para compensar las poblaciones de linfocitos. Un enfoque aún más adecuado sería utilizar una pequeña fracción de celdas como los controles de una sola mancha, utilizando un marcador conocido y altamente expresado en el subconjunto, como HLA-DR o CD45, conjugado con cada uno de los fluorocromos deseados, lo que permitiría un marcador mucho más compensación precisa que se puede lograr con cuentas. En el caso de las muestras de los fumadores, esta táctica es particularmente útil ya que los macrófagos son mucho más grandes y más autofluorescentes. Además, a partir del paso de preparación, toda la muestra BAL podría ser cultivada en una placa antes de clasificarse como se describe en la sección 3 del protocolo, para permitir una separación de las poblaciones por adherencia. De esta manera, los macrófagos adherentes pueden aislarse de otras células no adherentes como los linfocitos. La compensación es mucho menos difícil si las poblaciones de linfocitos y AM se separan en lugar de examinarse juntas; sin embargo, confiar en la adherencia resultará en una pérdida de macrófagos, lo que es una consideración importante cuando los números de celda ya están limitando. También, un paso de adherencia podría resultar en la activación no deseada de monocitos adherentes, que puede afectar los resultados posteriores generados utilizando estas células. El valor de clasificar eficientemente las células en poblaciones más puras debe sopesarse frente a la restricción de tener menos de estas células para experimentos posteriores.
Otros modelos, sobre todo los modelos murinos, se han utilizado para estudiar las características inmunológicas de los macrófagos y la biología. Aunque estos modelos son extremadamente útiles y permiten una gran visión de un tipo de celda que es difícil de manipular, tienen limitaciones. Muchos de los marcadores de superficie celular varían entre ratones y humanos, de manera que el inmunofenotipo de los MAL humanos no se entiende completamente. Sin embargo, este sistema modelo requiere la agrupación de varios ratones para ensayos debido a los bajos números de celda disponibles de cada animal. Además, la necesidad de agrupar especímenes impide consideraciones de predisposición genética y sexo. Recientemente, se ha demostrado que el sexo juega un papel en la infectividad de los macrófagos por el VIH-1 debido a la expresión dispar del factor de restricción SAMHD-131. Los primates no humanos (NHP) representan el modelo más cercano a los seres humanos y facilitaron el estudio de la infección por el virus de inmunodeficiencia simio (SIV) y su efecto en el sistema inmunitario, proporcionando información sobre el papel de los macrófagos residentes en los tejidos en comparación con macrófagos derivados de monocitos. En los macacos de rhesus, también se ha demostrado que los macrófagos pulmonares se aíslan de BAL albergan un virus competente para la replicación; un ensayo de crecimiento viral (VOA) se utilizó para analizar el comportamiento del SIV en células residentes en tejidos32. Tal hallazgo es de un valor de investigación significativo, pero todavía debe ser validado en los seres humanos antes de que pueda ser aplicado, y el alto costo de usar NCP impide el uso de grandes poblaciones de muestras. Además, los MI humanos serán útiles para muchas otras aplicaciones, como los ensayos de infección viral/microbiana in vitro y en estudios de otros patógenos como la coinfección por tuberculosis/VIH.

Uno de los desafíos más importantes a los que se enfrenta una cura a la infección por el VIH es la presencia del reservorio latente del VIH, que provoca un rebote de la viremia plasmática tras la interrupción de la terapia antirretroviral (ART)1,2. Si bien el reservorio del VIH durante el TAR a largo plazo está bien documentado en varios compartimentos tisulares, incluidos los órganos linfoides secundarios, el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) y el sistema nervioso central (SNC), los pulmones se han pasado por alto como un área de estudio desde la era pre-ART3. Sin embargo, los pulmones desempeñan un papel central en la patogénesis del VIH. De hecho, los síntomas pulmonares fueron uno de los primeros indicadores de infecciones oportunistas relacionadas con el SIDA4. Incluso en la era moderna del TAR, las personas con VIH corren un mayor riesgo de desarrollar enfermedades pulmonares infecciosas y no infecciosas que las personas sin VIH. Por ejemplo, las personas con infección por VIH tienen un riesgo elevado de infección invasiva por neumonía estreptocócica, así como de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)5,6. Además, la coinfección de la tuberculosis (TB) y el VIH es un desafío importante de la salud pública en ciertas regiones del mundo, enparticular en el Africa subsahariana, ya que las personas infectadas por el VIH tienen entre 16 y 27 veces más probabilidades de tener tuberculosis que las personas sin VIH 7. Aunque se han propuesto algunas explicaciones para esta susceptibilidad a la infección pulmonar y a las enfermedades crónicas8,9,10, los mecanismos celulares precisos por los cuales las personas con VIH suprimido la carga viral plasmática sigue teniendo un mayor riesgo de que las complicaciones pulmonares no hayan sido completamente aclaradas. Es importante destacar que el VIH es un factor de riesgo muy fuerte para la infección pulmonar y las enfermedades crónicas, independientemente del estado de tabaquismo6.
Por lo tanto, el análisis del entorno inmunológico del pulmón es crucial para entender su papel en la salud y la enfermedad. Aunque no son invasivas, las muestras de esputo inducidas tienden a contener grandes cantidades de células epiteliales y desechos con linfocitos pulmonares raros y sin AM, limitando su papel a aplicaciones específicas. Por el contrario, no se pueden obtener grandes biopsias de tejido en ausencia de sospecha de enfermedad debido a los riesgos asociados de sangrado significativo y neumotórax (colapso pulmonar). Además, la mayoría de las células inmunitarias pulmonares se encuentran principalmente en el nivel de la mucosa, donde los pulmones son estimulados continuamente por antígenos durante la respiración. Para ello, la broncoscopia para obtener líquido BAL tiene la ventaja de proporcionar un acceso relativamente seguro a linfocitos y amantes (ver Figura 1). Los macrófagos constituyen la mayor proporción de células dentro del líquido BAL, seguidos de los linfocitos11. Por lo tanto, es útil establecer un método mediante el cual el líquido BAL pueda procesarse para su uso en aplicaciones posteriores, como inmunofenotipado, cultivo celular, transcriptomica o cualquier otra aplicación. El protocolo para el procesamiento del fluido BAL descrito aquí está adaptado de los procedimientos generales descritos previamente y optimizados para los diversos ensayos posteriores empleados. Esta metodología permite el aislamiento de las células inmunitarias de la mucosa linfoide pulmonar y mieloide para su caracterización fenotípica y funcional, así como una evaluación del reservorio de VIH en adultos que viven con vih.
Para establecer este protocolo, utilizamos los siguientes criterios para reclutar participantes del estudio15. Para que los participantes pudieran participar en este estudio, tenían que ser personas infectadas por el VIH que cumplieran los siguientes criterios: (1) sobre TAR durante al menos 3 años; (2) la carga viral suprimida (VL) durante un mínimo de 3 años; (3) Recuento de células T CD4 de 200/mm3; (4) dispuestoa a someterse a la espirometría de investigación y la broncoscopia. Los pacientes con los siguientes criterios fueron excluidos del estudio: (1) contraindicación(es) a broncoscopia; 2) alto riesgo de sangrado: coagulopatía o en terapia con warfarina o clopidogrel; (3) trombocitopenia (plaquetas bajas); (4) infección pulmonar activa u otro proceso pulmónico agudo; (5) embarazada/intentando quedar embarazada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

La broncoscopia es un procedimiento médico por el cual se inyecta salina normal en los pulmones a través de un broncoscopio y luego se aplica la succión, eliminando el líquido de lavado broncoalveolar (BAL). El líquido BAL es rico en células y, por lo tanto, puede proporcionar una "instantánea" del entorno inmunológico pulmonar. Los cd4 t son los reservorios de VIH mejor caracterizados, mientras que hay pruebas sólidas que sugieren que los macrófagos tisulares, incluidos los macrófagos alveolares (AM), también sirven como reservorios virales. Sin embargo, todavía se desconoce mucho sobre el papel de los hombres de aMe en el contexto del establecimiento y el mantenimiento de los embalses de VIH. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo para procesar el líquido BAL para obtener células que pueden ser utilizadas en ensayos virológicos e inmunológicos para caracterizar y evaluar las poblaciones celulares y subconjuntos dentro del pulmón es relevante para entender el papel de los pulmones como VIH Embalses. Aquí, describimos este protocolo, empleando técnicas estándar como la centrifugación simple y la citometría de flujo. Las células T CD4 y los AM pueden utilizarse para aplicaciones posteriores, incluidos el inmunofenotipado y la cuantificación del ADN y ARN del VIH.

En la mayoría de los no fumadores, el líquido BAL se recibe en un recipiente estéril y es un líquido ligeramente turbio de color amarillo-naranja. El líquido puede ser de color más rosado si el donante se sometió a biopsias endobronquiales durante la broncoscopia y se produjo algo de sangrado. El líquido puede ser de color más oscuro si el donante es fumador. Después de la centrifugación, el sobrenadante BAL será casi claro y ligeramente naranja, mientras que el pellet celular puede variar en color de blanquecino a marrón muy oscuro, dependiendo de la condición de la muestra y si el donante era fumador o no.
Al contar toda la muestra de BAL, se pueden visualizar diferentes tipos de células, incluyendo macrófagos más grandes y redondos de alrededor de 17 m de diámetro y linfocitos redondos más pequeños de alrededor de 7,3 m de diámetro18,19 (ver Figura 2). Los macrófagos se agrandan en los fumadores en aproximadamente un 40%18. La distinción entre los tipos de células permite contar los macrófagos y linfocitos por separado. También puede haber algunos desechos visibles en el campo, especialmente en muestras de fumadores. Los macrófagos son el tipo celular más abundante en el BAL, representando aproximadamente el 85% de las células en los no fumadores20,y están enriquecidos en fumadores por lo que pueden parecer casi exclusivos.
Las células BAL tienen una tendencia a agregar, por lo que deben mezclarse bien durante todas las manipulaciones. El pellet puede aparecer oscuro incluso después de varios pasos de lavado. Si los desechos filamentosos son evidentes en la fracción después de la tinción para la clasificación celular, pase las células a través de un filtro de 70 m antes de ejecutarlas a través del clasificador de células.
La clasificación de las células BAL debe realizarse a baja presión para garantizar tamaños de gotas lo suficientemente grandes como para acomodar los macrófagos. Las celdas se bloquean primero para incluir todas las celdas CD45+21 y, a continuación, se basan en la viabilidad para asegurarse de que se excluyen todas las celdas muertas (consulte la figura3). A continuación, se eligen células singlet y, dentro de esta, dos poblaciones se agaran en función del tamaño y la morfología, a saber, células mieloides más grandes y linfocitos más pequeños (ver Figura 3). Dentro de las células más grandes, las células se anegan en CD20622,23 y CD16922 y las celdas doble-positivas se ordenan como AMs, mientras que dentro de las células más pequeñas, CD3+ las células se eligen y se anegan en CD4 y CD8; Las células unipositivas y CD8 de CD4 se ordenan (consulte la figura 3). Los marcadores utilizados se eligieron sobre la base de fenotipos descritos previamente de los AMs, como el receptor de la nonósa CD206, que se encuentra en las células fagocíticas23,y el receptor de sialoadhesina CD16922.
Al clasificar los PPM, las células se cierran primero en dispersión hacia adelante y lateral, lo que debe mostrar una población de linfocitos homogénea, todos los cuales se toman, excluyendo el ruido cerca del eje cero (datos no mostrados). La población está cerrada en viabilidad y CD45, y se utilizan células CD45+ en vivo. Esta población se cierra entonces en CD3; para aislar a los monocitos, la población CD3- se cierra posteriormente en CD14 y todas las células positivas individuales se clasifican. Para aislar los subconjuntos de linfocitos, las células CD3+ están cerradas en CD4 y CD8 y se ordenan las poblaciones positivas y celulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> Figura 1 : Visión general del protocolo. Esquema que muestra el flujo de trabajo del protocolo, incluidos los posibles usos posteriores de los ejemplos generados. PBMC - células mononucleares de sangre periférica; BAL - lavado broncoalveolar; LSM - medio de separación de linfocitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> Figura 2 : Vista de campo del microscopio de todo el líquido BAL. Imágenes de microscopio de (A) un no fumador y (B) un fumador con linfocitos visibles (L), macrófagos (M) y glóbulos rojos (RBC). La ampliación es de 1.000x (10x ocular y 100x lente con inmersión en aceite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> Figura 3 : Estrategia de gating representativa para la clasificación celular de células BAL enteras. Estrategia de gating utilizada para clasificar los macrófagos alveolares (AM), CD4 y CD8 T de muestras de células BAL enteras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Muestra</td>
			<td>Anticuerpo</td>
			<td>Fluorocromo</td>
			<td>Clon</td>
			<td>Volumen por prueba (L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL y PBMC</td>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-cy5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>SÓLO BAL</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19.2</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sólo PBMC</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Panel de flujo para la clasificación de células BAL enteras y PMI aislados.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Objetivo</td>
			<td>Paso</td>
			<td>Primer nombre</td>
			<td colspan="4">Secuencia de primer</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">VIH ADN total o ARN LTR-Gag del VIH</td>
			<td>PCR de preamplificación</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5'-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ulf1</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en tiempo real</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>FamZen de UHIV:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN CD3</td>
			<td>PCR de preamplificación</td>
			<td>HCD3 fuera 5'</td>
			<td colspan="4">5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 fuera 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en tiempo real</td>
			<td>HCD3 en 5'</td>
			<td colspan="4">5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 en 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 FamZen:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>ARN GUSB</td>
			<td>PCR de preamplificación</td>
			<td>GUSB Forward 1:</td>
			<td colspan="4">5'-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Inverso 1:</td>
			<td colspan="4">5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR en tiempo real</td>
			<td>GUSB Forward 2:</td>
			<td colspan="4">5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB Inverso 2:</td>
			<td colspan="4">5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Secuencias de imprimación y sonda para la cuantificación del ADN del VIH y el ARN.

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Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

El VIH es incurable debido a su persistencia en reservorios celulares y anatómicos. Este método permite una evaluación del depósito del VIH de células inmunitarias aisladas de los pulmones. Esta técnica permite el aislamiento de células T mucosas pulmonares y macrófagos alveolares del líquido BAL para una evaluación más fenotípica o virológica como reservorios celulares del VIH.Comprender la biología de los macrófagos alveolares y las células T CD4 positivas y su contribución al reservorio del VIH podría conducir a información importante sobre los desafíos que enfrentan una cura para el VIH. El aislamiento de los macrófagos primarios de LA BAL se puede aplicar a varias otras áreas de investigación, incluidas las enfermedades pulmonares inflamatorias o infecciosas como el asma y la tuberculosis. Después de obtener el líquido BAL de un paciente humano de acuerdo con los protocolos estándar, vórtice el líquido en el tubo de recogida original antes de transferir la muestra a un tubo de 50 mililitros dentro de un gabinete de bioseguridad.Si el líquido parece muy turbio o contaminado por tejido filamentoso, filtre la muestra a través de un filtro de malla de nylon de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y utilice una punta de pipeta para romper suavemente el pellet que contiene todas las células BAL. Resuspender el pellet en un mililitro de RPMI 1640 medio y añadir un mililitro del sobrenadante reservado de cada uno de 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Agregue alícuotas de 10 mililitros del sobrenadante restante en tubos cónicos de 15 mililitros y coloque todas las muestras sobrenadantes en el almacenamiento de menos 80 grados centígrados. Diluir la suspensión de la célula de pellets en 10 mililitros de medio por cada 25 mililitros de muestra original y recoger las células BAL por centrifugación. A continuación, resuspender el pellet en un mililitro de medio complementado con 10%suero bovino fetal, o FBS, para el recuento.Para la clasificación de células mononucleares enteras de BAL y sangre periférica, agregue cinco veces 10 a las cinco células a cada uno de dos tubos de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros por subconjunto para los controles de compensación no manchados y manchados de viabilidad y agregue el resto de cada muestra de subconjunto en un tubo de cinco mililitros por muestra. Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets de control en 100 microlitros de PBS por tubo en hielo hasta que se utilicen. Resuspender los pellets de las células para la clasificación en 250 microlitros de una de cada 20 dilución del búfer de bloqueo del receptor Fc durante una hora a cuatro grados centígrados para bloquear cualquier unión no específica.Al final de la incubación de bloqueo, agregue el cóctel de anticuerpos adecuado de interés para una incubación adicional de una hora a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación primaria de anticuerpos, agregue un mililitro de PBS a cada tubo para la centrifugación y resusppend los pellets en 250 microlitros de tampón de clasificación en hielo protegido de la luz hasta la clasificación. Para preparar los controles de compensación, añada tres gotas cada una de las cuentas de compensación kappa de inmunoglobulina antiratón y las cuentas de compensación de control negativo por mililitro de PBS a un tubo de microcentrífuga y transfiera 100 microlitros de la solución de cuentas a cada muestra que se utilizará para la compensación.Agregue un microlitro de cada anticuerpo en el cóctel a cada tubo separado que contenga perlas y agregue un microlitro de mancha de viabilidad a cada tubo de control de compensación de manchas de viabilidad. Después de 20 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz, lave las muestras con un mililitro de PBS por tubo y resusppend los pellets en 250 microlitros de PBS fresco por tubo. Cargue la muestra de control sin mancha de la célula completa-BAL en el citómetro de flujo y configure la matriz de compensación.A continuación, cargue el tubo de muestra y clasifre las células a baja presión, gating para excluir el ruido, para incluir celdas vivas y CD45 positivas, y para excluir los dobletes. Dentro de la población mieloide más grande, clasifre las células de doble positivo CD206 y CD169 como macrófagos alveolares. Dentro de la población más pequeña de linfocitos, aísle las células CD3 positivas y clasifre las poblaciones de CD4 y CD8 de un solo positivo.Para ordenar la muestra de célula mononuclear de sangre periférica, puerta para excluir el ruido y dobletes e incluir las células CD45-positivas en vivo como se ha demostrado. Después de subir a CD3, acote las células CD3 negativas, CD14 positivas para clasificar los monocitos monopositivos positivos y acote las células CD3 positivas, CD4 y CD8 positivas para clasificar ambas poblaciones de un solo positivo positivo. Al contar toda la muestra de BAL, se pueden visualizar diferentes tipos de células, incluidos los macrófagos más grandes y redondos y los linfocitos más pequeños y redondos.Los macrófagos son el tipo de célula más abundante en el fluido BAL, representando aproximadamente el 85% de las células en los pulmones no fumadores. Estas células se enriquecen en fumadores hasta el punto de parecer casi exclusivas y tienden a ser ampliadas en aproximadamente un 40% en comparación con los macrófagos observados en los no fumadores. Los marcadores utilizados para la clasificación de macrófagos alveolares de muestras de fluidos BAL se eligieron sobre la base de fenotipos descritos previamente de macrófagos alveolares, como el receptor de manosa CD206 que está presente en las células fagocíticas y el receptor de sialoadhesina CD169.Después de su aislamiento, los macrófagos alveolares y otros tipos de células se pueden utilizar para el inmunofenotipado por citometría de flujo, ensayos funcionales inmunológicos o cuantificación de reservorios por PCR ultrasensible. Esta técnica permite el acceso a macrófagos altamente puros residentes en tejidos, que históricamente han sido difíciles de alcanzar, permitiendo el examen inalcanzable de la población significativa de células inmunitarias.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Investigación

Inmunología e Infección

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...