Name: processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Yazarlar onların fon kabul etmek istiyorum: Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CıCR) (CC, MAJ, NC #153082 hibe); Réseau SıDA et maladies, CC ve MAJ 'a ve CC 'ye fon veren McGill Üniversitesi Tıp Fakültesi 'ne fon veren du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) ' e bulaşır. Bu çalışmada ayrıca Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIR)-Kanadalı HıV Cure Enterprise (CanCURE) Team Grant HB2-164064 MAJ, CC ve NC tarafından finanse edilmiştir. MAJ, Immünviroloji ve CC ve NC 'de, sırasıyla FRQ-S Junior 1 ve Junior 2 araştırma maaş ödülünü taşıyan CıSC Kanada araştırma koltuğu seviye 2 ' ye sahiptir. ET, RI-MUHC Studentship MSc ödülüne sahiptir.
Buna ek olarak, yazarlar Josée Girouard ve tüm klinik personel örnekleri koordine ve alma dahil olmak üzere, yanı sıra respiratuar terapistler kabul etmek istiyorum; Ekaterina ıourtchenko, Hélène Pagé-Veillette, ve Marie-Hélène Lacombe RI-MUHC Immünophenotyping platformunda; ve Dr. Marianna Orlova mikroskopi fotoğrafları sağlanması için. En önemlisi, yazarlar bu araştırma mümkün olmayacaktır kim olmadan birçok gönüllülere teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+reservoirs+of+HIV:+obstacles+to+the+eradication+of+virus.">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li><li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+infection+of+CD4++T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1,+even+in+patients+on+effective+combination+therapy.">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li><li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection.">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li><li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+Kaposi's+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties,+California.">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li><li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+directions:+lung+aging,+inflammation,+and+human+immunodeficiency+virus.">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li><li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease?.">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO | Tuberculosis and HIV. , (2018).</li><li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function.">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li><li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR&#947;,+NADPH+Oxidases,+and+TGF&#946;.">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPAR&#947;, NADPH Oxidases, and TGF&#946;.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li><li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages.">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li><li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma:+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure.">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li><li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage.">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).</li><li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis;+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection.">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).</li><li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses.">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+persistence+in+mucosal+CD4++T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy.">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li><li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , (2004).</li><li>King, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , (2018).</li><li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls.">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li><li>Kuse, R., Schuster, S., Sch&#252;bbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls.">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li><li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung.">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li><li>Rheinl&#228;nder, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine.">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li><li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood,+Bronchoalveolar+Lavage,+and+Lung+Tissues.">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li><li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles.">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li><li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal,+Canada:+A+cross+sectional+study.">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li><li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+(CTN+173).">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li><li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cytokines+in+the+establishment,+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir.">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li><li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution.">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li><li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects.">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease.">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).</li><li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung.">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li><li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages.">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques.">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada, ciğerleri içinde HıV rezervuar araştırmak için incelenebilir uyumlu PBMCs ile birlikte CD4 T hücreleri ve AMs elde etmek için BAL sıvısı işleme için bir yöntem açıklanmıştır. Biz son zamanlarda HIV DNA kantifikasyon içinde CD4 t hücrelerinde eşleşen periferik kan ve bal örnekleri bildirilen, ve bizim grup HIV olduğunu göstermiştir 13 pulmoner CD4 t hücrelerinde daha bol periferik kan olanlar daha15. Ancak, AMs HıV DNA seviyeleri donör bağımlı ve bu yüzden, şimdiye kadar, macrofajlar15ile karşılaştırıldığında lenfositlerde HIV DNA seviyeleri arasında tutarlı bir korelasyon olmamıştır. Bu birincil makrophaj hücre subsets erişim, ancak, bu soruyu sorgulamak ve HıV rezervuar bağlamında akciğer viral yük daha iyi bir anlayış kazanıyor için hayati bir araç olacaktır.
Ön sanat döneminde ve BAL sıvısı kullanan diğer çeşitli çalışmalarda, katılımcılar şüpheli bir patolojinin teşhisi veya solunum belirtileri için mikrobiyolojik tanı almak amacıyla bronkoskopi yapıldı3. Ancak, herhangi bir Aktif akciğer belirtileri veya patolojileri olmadan katılımcılar işe başardık ve tüm katılımcılar etik onay formu imzaladı15. Obstrüktif akciğer hastalığı24için Spirometri tarama çalışması gibi diğer çalışmalara katılan merkezimizin katılımcılarının yanı sıra lökoferez gibi diğer araştırma prosedürlerini de geçirebiliriz. Kolonoskopi. HıV ile yaşayan insanlar arasında önceki araştırma, bu fedakarlık araştırma çalışmaları25önemli bir faktör motive katılımı olduğunu göstermiştir. Birçok insan numuneleri gibi, biz kişi-to-Person değişkenlik büyük bir kaydetti. Hangi katılımcılar biz iyi karşı kötü hücre verimi ile BAL elde edeceğini "tahmin" için bir yolu yoktu. Periferik kanın aksine, hangi lenfosit oldukça tutarlı sayılar verir, BAL sıvı hücre numaraları çok değişkendir. Akciğer içine normal tuz daha büyük bir hacim enjekte (BAL sıvı daha büyük bir dönüş elde umuduyla ile) normal tuz daha büyük hacimli genellikle daha öksürük ve ateş postbronkoskopi daha yüksek bir risk ile ilişkili olduğu gibi her zaman mümkün değildir. Biz daha küçük bir (yerine daha büyük) çapı bronkoskop kullanarak respirolog bronş daha derin ulaşmak ve hücre daha büyük miktarlarda içeren sıvı elde etmek için etkin olduğunu fark ettik. Tutarlı bir bulgu, tütün içenlerin, AMs 'in enkaz ve partikül maddeyi yutması olarak beklendiği gibi, BAL sıvısı içinde lenfositlerden çok daha büyük orantıları vardı. Ayrıca, sigara içenlerden gelen BAL sıvısının, PCR makineleri ve akış cytometreleri gibi kullanılan donanımı engelleyen enkaz içerdiği gözlenmiştir. Benzer sorunlar, yüksek kirlilik veya bireyler daha sık zayıf hava kalitesine maruz alanlarda görülebilir.
HıV rezervuarlarının kurulması ve viral Kalıcılık ile ilgili olarak, CD4 T hücrelerinin saflığı ve AMs önemli bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, son derece saf hücre popülasyonları elde etmek için floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanmayı tercih ettik. Bir bronkoskopi sırasında bazı küçük kanama bekleniyor olarak toplanan BAL sıvısı kan ile kontamine olabilir de mümkündür; naif B hücrelerinin varlığı bunu gösterecektir, ve hücreler bu sorunu aşmak için kırmızı kan hücresi liziz tamponunun içinde yıkanabilir. BAL sıvısının incelenmesi ile ilgili bir diğer zorluk, HıV Kalıcılık26' nın anlaşılması için önemli olan inflamatuar belirteçleri ve sitokinlerin ölçüleceği ile ilgilidir. Sertleştirilen tuz BAL sıvısını seyreltilince, inflamatuar mediatörlerin ve sitokinlerin seviyeleri ölçmek zor olabilir. Seyreltme için bir üre düzeltme faktörü önerilse de, kullanımı27, 28 ' iaçıklayan nispeten az literatür vardır.
AMs son derece autofluorescent, hangi hücre sıralama ve akış sitometri fenotipik analizi sırasında bir sorun oluşturmaktadır. Özellikle, etkisi, AMs tamamen siyah renk olabilir sigara içenler daha belirgindir, önemli ölçüde kendi otomatik yağ etkileyen. Standart mavi 488 nm lazer ile heyecanlı olduğunda, otofloresans yaklaşık 540 NM, fitc ve PE29,30gibi yaygın olarak kullanılan Konjugat floresan spektrumlu ile çakışıyor zirvesinde. İki ayrı lazerin FITC ve PE 'yi heyecanlandırmak için kullanıldığına dikkat çekiyor (örn. mavi 488 lazer tarafından sarı/yeşil ve FITC tarafından PE). FITC ile içsel otomatik yağışların üstesinden gelmek için, otomatik netleme arka planını belirlemek için lekelenmeli AMs kullandık. Buna ek olarak, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanımı bu teknik konularda mücadele için çok yararlı olabilir. Daha büyük boncuklar (örn. 7,5 μm), makrofaj nüfusu telafi etmek için daha yakın olan, daha küçük boncuklar (örn., 3,0 μm) ile karşılaştırıldığında, lenfosit nüfusu telafi etmek için kullanılabilir. Daha uygun bir yaklaşım, tek leke kontrolleri olarak hücrelerin küçük bir kısmını kullanmak olacaktır, HLA-DR veya CD45 gibi, alt üzerinde bilinen, yüksek ifade marker kullanarak, her istenilen fluorochromes için conjuated, hangi için izin verecek bir çok daha boncuk ile elde edilebilir daha doğru tazminat. Sigara içenlerin numuneleri durumunda, bu taktik özellikle makrofajlar çok daha büyük ve daha fazla autofluorescent olarak yararlıdır. Buna ek olarak, hazırlık adımından, tüm BAL örnek protokolün Bölüm 3 ' te açıklandığı gibi sıralamadan önce bir plaka kültürlü olabilir, bağlılık tarafından nüfus ayrılması izin. Bu şekilde, bağlı macrofajlar lenfositler gibi diğer yapışmaz hücrelerden izole edilebilir. Lenfosit ve nüfusu birlikte incelendiğinde yerine ayrılırsa, tazminat çok daha az zordur; Ancak, bağlılık güvenmek makrofajlar kaybına neden olur, hangi hücre numaraları zaten sınırlarken önemli bir önem taşımaktadır. Ayrıca, bir yapışma adım bu hücreler kullanılarak oluşturulan aşağı sonuç etkileyebilir yapışan monositlerin istenmeyen aktivasyonuna neden olabilir. Hücrelerde daha az etkili olan hücreleri sıralama değeri, sonraki deneyler için bu tür hücrelerin daha düşük olması kısıtlamasına karşı tartılması gerekir.
Diğer modeller, en önemlisi duvar modelleri, makrophaj immunolojik özellikleri ve biyoloji çalışması için kullanılmıştır. Bu modeller son derece yararlıdır ve manipüle etmek zor bir hücre türü içine büyük anlayış izin verirken, sınırlamalar var. Hücre yüzeyi işaretçileri birçok insan AMs immünofenotip tamamen anlaşılmadı gibi fareler ve insanlar arasında değişir. Ancak, bu model sistemi, her hayvanın kullanılabilir düşük hücre numaraları nedeniyle çeşitli fareler havuzu gerektirir. Buna ek olarak, havuz numuneleri gereksinimi genetik yatkınlık ve cinsiyet hususlarını önler. Son zamanlarda, cinsiyet kısıtlama faktörü SAMHD-131farklı ifade nedeniyle HIV-1 tarafından makrofajların infeksiyonunda bir rol oynar gösterildi. İnsanlık dışı primatlar (NHP) insanlara en yakın modeli temsil eder ve Simian immünyetmezlik virüsü (SıV) enfeksiyonunun ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkisinin incelenmesi, doku-yerleşik makrofajların rolüne göre anlayış sağlayan monosit türevi makrofajlar. Rhesus Macaques içinde, aynı zamanda bir çoğaltma-yetkili virüs BAL limanından akciğer makrophage yalıtır gösterildi; bir viral büyüme tahlil (VOA) doku yerleşik hücreler32SIV davranışını analiz etmek için kullanıldı. Böyle bir bulgu önemli bir araştırma değeri ama yine de uygulanabilir önce insanlarda doğrulanmalıdır ve NHPs kullanarak yüksek maliyetli büyük örnek nüfus kullanımını önler. Buna ek olarak, insan AMs in vitro viral/mikrobiyal enfeksiyon ve tüberküloz/HıV koenfeksiyon gibi diğer patojenlerin çalışmaları gibi birçok diğer uygulamalar için yararlı olacaktır.

HIV enfeksiyonu için bir tedavi karşı karşıya en önemli zorluklardan biri antiretroviral tedavinin kesilmesi sonrasında plazma viremi bir rebound nedenleri gizli HIV rezervuar varlığı (sanat)1,2. Uzun vadeli sanat sırasında HıV rezervuar iyi, ikincil lenfoid organları, bağırsak ilişkili lenfoid doku (GALT) ve merkezi sinir sistemi (CNS) de dahil olmak üzere çeşitli doku bölmeleri, belgelenmiştir, akciğerler çalışma alanı olarak gözden geçti Pre-ART çağından beri3. Ancak, akciğerler HıV patogenezinde merkezi bir rol oynamaktadır. Gerçekten de, pulmoner semptomlar AıDS 'le ilgili fırsatçı enfeksiyonların ilk göstergeleri arasında yer aldı4. Modern sanat döneminde bile, HIV 'li kişiler HıV olmayan kişilerden daha fazla bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan akciğer hastalıkları geliştirme riskine sahiptir. Örneğin, HIV enfeksiyonu olan kişiler invazif streptococcal pneumoniae enfeksiyonunun yanı sıra kronik obstrüktif pulmoner hastalık (kod)5,6için de yüksek risk altındadır. Ayrıca, tüberküloz (TB) ve HıV koenfeksiyon dünyanın belirli bölgelerinde önemli bir kamu sağlığı meydan okuma, özellikle de, Sahra-altı Afrika, HıV-enfekte bireyler 16 ila 27 kat daha fazla tüberküloz HıV olmadan kişiler daha olasılığı7. Pulmoner enfeksiyon ve kronik hastalığa bu duyarlılık için bazı açıklamalar8,9,10, HIV bastırılmış olan bireyler tarafından hassas hücresel mekanizmalar önerilmiştir rağmen akciğer komplikasyonları için yüksek risk altında kalan plazma viral yük tamamen elükidated olmamıştır. Önemlisi, HıV akciğer enfeksiyonu ve kronik hastalık için çok güçlü bir risk faktörüdür, Sigara durumu6bağımsız.
Akciğer bağışıklık ortamının analizi, bu nedenle, sağlık ve hastalık rolünü anlamak için çok önemlidir. Noninvaziv, indüklenmiş balgam örnekleri nadir pulmoner lenfositler ve hiçbir AMs ile epitelyal hücreler ve enkaz büyük miktarlarda içeren eğilimindedir rağmen, belirli uygulamalar için rol sınırlamaktadır. Bunun tersine, önemli kanama ve pnömotoraks (akciğerin çöküşü) ile ilgili riskler nedeniyle şüpheli hastalığın yokluğunda büyük miktarda doku biyopsisi elde edilemez. Ayrıca, pulmoner bağışıklık hücrelerinin çoğunluğu özellikle akciğerlerin sürekli solunum sırasında antijenler tarafından uyarılan mukozal düzeyde bulunur. Bu amaçla, BAL sıvısı elde etmek için bronkoskopi lenfositler ve AMs nispeten güvenli erişim sağlayan avantajı vardır (bkz. Şekil 1). Makrofajlar BAL sıvısı içindeki hücrelerin en büyük oranını oluşturmaktadır, ardından lenfositler11. Bu nedenle, BAL sıvısı tarafından immunophenotyping, hücre kültürü, transcriptomics veya başka uygulamalar gibi sonraki uygulamalarda kullanılmak üzere işlenecek bir yöntem oluşturmak için yararlıdır. Burada özetlenen BAL sıvısının işlenmesi için protokol, daha önce açıklanan ve kullanılan çeşitli akış uygulamaları için optimize edilmiş genel prosedürlerden uyarlanmıştır. Bu metodoloji hem pulmoner lenfoid ve miyeloid mukozal bağışıklık hücrelerinin onların fenofonal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yalıtım, hem de HIV ile yaşayan yetişkinlerde HıV rezervuar bir değerlendirme sağlar.
Bu protokolü kurmak için, çalışma katılımcıları15' i işe almak için aşağıdaki kriterleri kullandık. Katılımcıların bu araştırmaya katılmalarına uygun olmaları için, aşağıdaki kriterlere uyan HıV enfekte bireyler olmaları gerekiyordu: (1) ART üzerinde en az 3 yıl; (2) bastırılmış viral yük (VL) en az 3 yıl; (3) ≥ 200/mm3CD4 T hücre sayısı; (4) araştırma Spirometri ve bronkoskopi geçmesi istekli. Aşağıdaki kriterlere sahip hastalar çalışma dışında bırakıldı: (1) bronkoskopi için kontrendikasyon (ler); (2) yüksek kanama riski: koagulopati veya warfarin veya klopidogrel tedavisi; (3) trombositopeni (düşük platelets); (4) aktif pulmoner enfeksiyon veya başka bir akut pulmoner süreç; (5) hamile/hamile olmaya çalışıyorum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1052px;" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainer</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">22363548</td>
			<td style="width:525px;">Nylon mesh filters with 70 &#181;m pores to remove impurities from BAL sample before sorting</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">ACH-2 Cells</td>
			<td style="width:177px;">NIH</td>
			<td>349</td>
			<td style="width:525px;">HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">BD FACSAria</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:525px;">Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">BD LSRFortessa X-20</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:145px;">N/A&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:204px;">Bronchoscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:145px;">BF-1TH190&#160;</td>
			<td style="width:525px;">EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Cell Disassociation Solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>C5914&#160;</td>
			<td style="width:525px;">Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD169&#160; BB515</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>565353</td>
			<td style="width:525px;">Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD14&#160; BV786</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>563698</td>
			<td style="width:525px;">Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD206&#160; PE</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555954</td>
			<td style="width:525px;">Mannose receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD3&#160; Alexa700</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557943</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD4&#160; PE-Cy5</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>555348</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:204px;">CD45&#160; PE Cy-7</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td style="width:525px;">Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">CD8&#160; BV605</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564116</td>
			<td style="width:525px;">T cell co-receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:204px;">CompBead Plus</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td>560497</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse&#160; Ig, &#954;&#160; and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">DNase I</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td style="width:525px;">Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5&#39; phosphate to remove contamination from RNA</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">dNTP Set 100 mM</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>&#160;10297-018</td>
			<td style="width:525px;">Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td style="width:525px;">&#160;Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">EDTA</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>AM9912</td>
			<td style="width:525px;">Used to stop Dnase I enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">080-150</td>
			<td style="width:525px;">Premium fetal bovine serum to supplement media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FcR Blocking Reagent, Human</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:145px;">130-059-901</td>
			<td style="width:525px;">Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">FlowJo v10</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:525px;">Flow cytometry analysis software used for all analyses</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HLA-DR&#160; BV650</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>564231</td>
			<td style="width:525px;">MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">HyClone HEPES solution</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">SH3023701</td>
			<td style="width:525px;">Buffer providing maintenance of physiological pH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Live/Dead&#160; APC-H7</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>L34975</td>
			<td style="width:525px;">Viability marker used for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:177px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:145px;">5100-0001</td>
			<td style="width:525px;">Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1&#176;C/minute, the optimal rate for cell preservation</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td style="width:525px;">Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:525px;">Phosphate buffered saline for cell washing and staining</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">PCR Tubes Corbett Rotor-Gene</td>
			<td style="width:177px;">Axygen</td>
			<td>PCR-0104-C</td>
			<td style="width:525px;">4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">PerfeCTa qPCR ToughMix</td>
			<td style="width:177px;">Quantabio</td>
			<td>95112</td>
			<td style="width:525px;">2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">QiaAmp DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:525px;">Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:204px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td style="width:525px;">Kit for purification of up to 100 &#181;g total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:204px;">Rotor-Gene Q</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>9001550</td>
			<td style="width:525px;">Real-time PCR cycler</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">RPMI 1640 1X</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td style="width:145px;">350-000-CL</td>
			<td style="width:525px;">Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Sterile Water</td>
			<td style="width:177px;">Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td style="width:525px;">DNase, RNase &#38; protease free</td>
		</tr>
		<tr height="206">
			<td height="206" style="height:206px;width:204px;">Superscript&#8482; III One-Step RT-PCR System&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>12574018</td>
			<td style="width:525px;">RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td height="172" style="height:172px;width:204px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>18038-042</td>
			<td style="width:525px;">Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:204px;">Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td>562725</td>
			<td style="width:525px;">Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:204px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T8154</td>
			<td style="width:525px;">Viability dye to count cells using haemacytometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of bronchoalveolar lavage fluid and matched blood for alveolar macrophage and cd4+ t-cell immunophenotyping and hiv reservoir assessment

Bronkoskopi, normal salin bir bronkoskopla akciğerlere enjekte edildiği ve daha sonra emme uygulandığında, Bronkoalveoler Lavaj (BAL) sıvısının kaldırılması ile uygulanan tıbbi bir işlemdir. BAL sıvısı hücrelerde zengindir ve böylece pulmoner immün ortamın ' anlık görüntüsünü ' sağlayabilir. CD4 T hücreleri en iyi karakterize HıV rezervuarları, orada alveoler makrofajlar (AMs) dahil olmak üzere doku makrofajlar, ayrıca viral rezervuar olarak hizmet önermek için güçlü bir kanıt varken. Ancak, çok hala HıV rezervuar kurulması ve bakım bağlamında AMs rolü hakkında bilinmiyor. Bu nedenle, virolojik ve immünolojik olarak kullanılan hücreleri elde etmek için BAL sıvısının işlenmesi için bir protokol geliştirmek, akciğer içindeki hücre nüfusunu ve alt setleri karakterize etmek ve değerlendirmek, akciğerlerin HıV rolünü anlamak için ilgilidir. Rezervuar. Burada, basit santrifüjleme ve Akış sitometrisi gibi standart teknikler kullanan bir protokol açıklanmaktadır. CD4 T hücreleri ve AMs daha sonra immünofenotipleme ve HIV DNA ve RNA ölçümü de dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için kullanılabilir.

Çoğu sigara içmeyen BAL sıvısı steril bir kabın içinde alınır ve biraz bulanık sarı-turuncu renkli bir sıvıdır. Donör bronkoskopide Endobronşiyal biopsleri uyguluysa ve bazı kanama meydana geldiği takdirde sıvı Pinker renk olabilir. Eğer donör bir sigara içen ise sıvı renk koyu olabilir. Santrifüjden sonra, bal süpernatant neredeyse açık ve biraz turuncu olacak, hücre peletleri renk kapalı-beyaz çok koyu kahverengi olabilir iken, örnek durumuna bağlı olarak ve donör bir sigara içen ya da olmadığını.
Tüm bal numunesi sayırken,18 μm çapında daha büyük, yuvarlak makrofajlar ve yaklaşık 7,3 μm çapında daha küçük yuvarlak lenfositler dahil olmak üzere farklı hücre tipleri görselleştirilebilir (bkz. Şekil 2). Macrofajlar%18yaklaşık 40 tarafından sigara içenler büyütülür. Hücre türleri arasındaki ayrım ayrı olarak macrofajlar ve lenfosit sayımı için izin verir. Ayrıca, özellikle sigara içenlerin örneklerinde, alanda görülebilir bazı enkaz olabilir. Macrofajlar BAL en bol hücre türüdür, yaklaşık% 85 için muhasebe, Sigara içmeyen20hücrelerin, ve onlar neredeyse özel görünebilir böylece sigara içiciler zenginleştirilmiştir.
BAL hücrelerinin toplama eğilimi vardır, bu nedenle tüm manipülasyonlar sırasında iyi karıştırılmalıdır. Pelet birkaç yıkama adımında bile karanlık görünebilir. Eğer filasentöz enkaz hücre sıralama için boyama sonra fraksiyonda belirgindir, hücre Sıralayıcı aracılığıyla çalıştırmadan önce bir 70 μm filtre ile hücreleri geçirin.
BAL hücrelerinin sıralanması, makrofajları barındıracak kadar büyük damlacık boyutlarını sağlamak için düşük basınçta yapılmalıdır. Hücreler ilk olarak tüm CD45+21 hücrelerini içerecek şekilde tutulur ve ardından tüm ölü hücrelerin dışlanabilmesini sağlamak için dayanılabilirlik temelinde (bkz. Şekil 3). Singlet hücreleri sonra seçilir ve bu içinde, iki nüfus boyutu ve morfoloji, yani daha büyük miyeloid hücreler ve daha küçük lenfositler dayalı (bkz. Şekil 3) Gated. Daha büyük hücreler içinde, hücreler CD20622,23 ve CD16922 ve çift pozitif hücreler AMs olarak sıralanır, daha küçük hücreler içinde, CD3+ hücreler seçilir ve, CD4 ve CD8 üzerinde Gated; CD4 tek pozitif ve CD8 tek pozitif hücreler sıralanır (bkz. Şekil 3). Kullanılan işaretçiler, fagositik hücreler23' te bulunan mannoz reseptör CD206 ve sialoyapışan reseptör CD16922gibi AMs 'nin önceden anlatılan fenotipleri üzerine dayalı olarak seçilmiştir.
PBMCs sıralamada, hücreler ilk olarak ileri ve yan dağılımda, homojen bir lenfosit popülasyon göstermelidir, hepsi alınır, sıfır eksenine yakın gürültü hariç (veriler gösterilmez). Nüfus Gated ve CD45, ve canlı CD45+ hücreler kullanılır. Bu nüfus daha sonra CD3 üzerinde Gated; monosit yalıtmak için, CD3- nüfus daha sonra CD14 üzerinde Gated ve tüm tek pozitif hücreler sıralanır. Lenfosit subsets izole etmek için, CD3+ hücreler CD4 ve CD8 üzerinde Gated ve hem tek pozitif ve hücre nüfus sıralanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg"> Şekil 1 : Protokole genel bakış. Oluşturulan numunelerin olası aşağı akış kullanımları da dahil olmak üzere protokolün iş akışını gösteren şematik. PBMC = periferik kan mononükleer hücreler; BAL = Bronkoalveoler Lavaj; LSM = lenfosit ayırma orta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg"> Şekil 2 : Tüm bal sıvısının mikroskop alanı görünümü. (A) bir sigara içmeyen ve (B) görünür lenfositler (L), makrofajlar (M) ve kırmızı kan hücreleri (RBC) ile bir sigarandan mikroskop görüntüleri. Büyütme 1, 000x (yağ daldırma ile 10X oküler ve 100x lens). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg"> Şekil 3 : Tüm bal hücrelerinin hücre sıralaması Için temsilci gating stratejisi. Alveoler makrofajlar (AM), CD4 ve, tüm BAL hücre örneklerinden CD8 T hücrelerini sıralamak için kullanılan gating stratejisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>Antikor</td>
			<td>Florokrom</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Test başına hacim (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL ve PBMC</td>
			<td>Canlı/ölü</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-cy5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sadece BAL</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19,2</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sadece PBMC</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: tüm BAL hücrelerinin ve yalıtılmış PBMCs 'lerin sıralanması için akış paneli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Adım</td>
			<td>Primer adı</td>
			<td colspan="4">Primer sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HıV Total DNA veya HıV LTR-gag RNA</td>
			<td>Ön amplifikasyon PCR</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA TCT CTC TCC TTC ETIKET C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ULF1</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gerçek zamanlı PCR</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5 '-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>UHIV FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 DNA</td>
			<td>Ön amplifikasyon PCR</td>
			<td>HCD3 dışarı 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 dışarı 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gerçek zamanlı PCR</td>
			<td>HCD3 içinde 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-GGC TAT KEDI TCT TCT TCA AGG T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>3 ' te HCD 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUSB RNA</td>
			<td>Ön amplifikasyon PCR</td>
			<td>GUSB Ileri 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB ters 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gerçek zamanlı PCR</td>
			<td>GUSB Ileri 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB ters 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT TGT CTG CTG KEDI AGT ETIKET A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: HıV DNA ve RNA ölçümü için primer ve prob dizileri.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment at JoVE.co

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

HIV hücresel ve anatomik rezervuarlarda kalıcılığı nedeniyle tedavi edilemez. Bu yöntem akciğerlerden izole bağışıklık hücrelerinin BIR HIV rezervuar değerlendirmesi sağlar. Bu teknik, pulmoner mukozal T hücrelerinin ve alveoler makrofajların BAL sıvısından izole edilmesine izin verir ve hiv hücresel rezervuarları olarak daha fazla fenotipik veya virolojik değerlendirme sağlar.Alveoler makrofajların ve CD4-pozitif T hücrelerinin biyolojisini ve HIV rezervuarına olan katkılarının anlaşılması, HIV tedavisinin karşı karşıya olduğu güçlüklere dair önemli içgörülere yol açabilir. Primer makrofajların BAL'dan izolasyonu astım ve tüberküloz gibi inflamatuar veya enfeksiyöz akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir. Standart protokollere göre bir insan hastadan BAL sıvısı alındıktan sonra, numuneyi biyogüvenlik kabini içinde 50 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce orijinal toplama tüpündeki sıvıyı girdaplayın.Sıvı çok bulanık veya ipliksi doku ile kontamine görünüyorsa, yeni bir 50 mililitrelik tüp içine 70 mikrometre naylon örgü filtre ile örnek filtre. Santrifüjden sonra, süpernatant'ı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve tüm BAL hücrelerini içeren peleti yavaşça parçalamak için bir pipet ucu kullanın. RPMI 1640 orta bir mililitre pelet resuspend ve 10 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerher ayrılmış supernatant bir mililitre ekleyin.15 mililitrelik konik tüpler içine kalan supernatant 10 mililitrelik aliquots ekleyin ve eksi 80 derece santigrat depolama tüm supernatant örnekleri yerleştirin. Pelet hücresi süspansiyonunu her 25 mililitre orijinal numune için 10 mililitre orta lıkta seyreltin ve SANtrifüj ile BAL hücrelerini toplayın. Sonra orta bir mililitre pelet resuspend 10% fetal sığır serumu ile takviye, veya FBS, saymak için.Tüm BAL ve periferik kan mononükleer hücrelerinin sıralanması için, lekesiz ve canlılık lekeli kompanse kontrolleri için alt küme başına iki beş mililitrelik yuvarlak dipli polistiren tüplerin her birine beş hücreye beş kat 10 ekleyin ve her alt küme örneğinin geri kalanını numune başına bir beş mililitrelik tüpe ekleyin. Hücreleri santrifüj le toplayın ve kontrol peletlerini kullanılana kadar buzdaki tüp başına 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Fc reseptör bloke tampon bir saat için dört derece santigrat herhangi bir non-spesifik bağlama engellemek için bir saat için bir 20 seyreltme bir 250 mikrolitre sıralama için hücrelerin pelet resuspend.Engelleme kuluçka sonunda, dört santigrat derece ek bir saatlik kuluçka için ilgi uygun antikor kokteyl ekleyin. Birincil antikor kuluçka sonunda, santrifüj için her tüp e bir mililitre PBS ekleyin ve sıralama kadar ışıktan korunan buz üzerinde sıralama tampon 250 mikrolitre pelet resuspend. Telafi kontrolleri hazırlamak için, üç damla anti-fare immünglobulin kappa tazminat boncuk ve bir mikrosantrifüj tüp pbs bir mililitre başına negatif kontrol tazminat boncuk her ekleyin ve her örnek için kullanılacak boncuk çözeltisi 100 mikrolitre transfer.Boncuk içeren her ayrı tüp için kokteyl her antikor bir mikrolitre ekleyin ve her canlılık leke telafi kontrol tüpü için canlılık leke bir mikrolitre ekleyin. Işıktan korunan dört santigrat derecede 20 dakika sonra, numuneleri tüp başına bir mililitre PBS ile yıkayın ve tüp başına 250 mikrolitre taze PBS'de peletleri yeniden askıya alın. Tüm BAL hücresi lekesiz kontrol örneğini akış sitometresine yükleyin ve telafi matrisini ayarlayın.Sonraki örnek tüp yük ve düşük basınç altında hücreleri sıralamak, gürültü hariç gating, canlı ve CD45-pozitif hücreleri dahil etmek, ve doublets hariç. Daha büyük miyeloid popülasyoniçinde, CD206 ve CD169 çift pozitif hücreleri alveoler makrofajlar olarak sıralayın. Küçük lenfosit popülasyonu içinde, CD3-pozitif hücreleri izole ve CD4 ve CD8 tek pozitif popülasyonları sıralamak.Periferik kan mononükleer hücre örneğini sıralamak için, gürültü ve doublets dışlamak ve gösterildiği gibi canlı CD45-pozitif hücreleri dahil etmek için kapı. CD3'ü gating ettikten sonra, tek pozitif monositleri sıralamak için CD3-negatif, CD14-pozitif hücreleri kaplayın ve cd3-pozitif, CD4 ve CD8-pozitif hücreleri tek pozitif popülasyonların her ikisini de sıralamak için kapılayın. Bal örneğinin tamamı sayıldığında, daha büyük, yuvarlak makrofajlar ve daha küçük yuvarlak lenfositler de dahil olmak üzere farklı hücre tipleri görüntülenebilir.Makrofajlar BAL sıvısında ki en bol hücre tipidir ve sigara içmeyen akciğerlerdeki hücrelerin yaklaşık %85'ini oluşturur. Bu hücreler sigara içenlerde neredeyse özel görünen noktaya kadar zenginleştirilmiş ve sigara içmeyenlerde gözlenen makrofajlara göre yaklaşık %40 oranında büyütülme eğilimindedir. BAL sıvı örneklerinden alveoler makrofajların ayıklanmasında kullanılan belirteçler, fagositik hücrelerde bulunan mannose reseptör CD206 ve sialoadhesin reseptör CD169 gibi daha önce tanımlanmış alveoler makrofajların fenotiplerine göre seçilmiştir.İzolasyonlarını takiben, alveoler makrofajlar ve diğer hücre tipleri, akış sitometrisi, immünolojik fonksiyonel tahliller veya ultraduyarlı PCR ile rezervuar nicelemesi ile immünofenotiyolog için kullanılabilir. Bu teknik, tarihsel olarak ulaşılması zor olan son derece saf doku yerleşik makrofajlara erişim sağlar ve bu da önemli bağışıklık hücresi popülasyonunun daha önce ulaşılmaz bir şekilde incelenmesine olanak sağlar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...