Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

وقد دعمت الدراسة الخطة الوطنية الرئيسية للبحث والتطوير (المنحة رقم 2016YFD0500401) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31302043).

تمت الموافقة علي استخدام الفئران في هذا البروتوكول من قبل اللجنة الاداريه لرعاية الماشية التابعة لمعهد الطب البيطري العسكري ، واكاديميه العلوم الطبية العسكرية ، والصين (ترخيص لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المختبري ، والسماح عدد JSY-DW-2010-02). واتبعت جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والو...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

وفي الوقت الراهن ، فان الشركة هي أحد الفيروسات الرئيسية المسؤولة عن تقريبا كل داء البشر والحيوانية في الصين ، وكذلك في بلدان أخرى. الاضافه إلى ذلك ، تم التعرف أولا علي متغير من نوع irkv من الخفافيش التي كانت من نوع "اورنا ليوكواستر " في مقاطعه جيلين في شمال شرق الصين في ال2012...

داء الإنفلونزا هو مرض حيواني في جميع انحاء العالم تسببه الفيروسات داخل جنس Lyssavirus1. Lyssavirusesات (الاسره Rhabdoviridae) هي واحده سالبه-التي تقطعت بهم السبل الفيروسات RNA مع ما يقرب من 12 كيلو بايت الجينوم ان ترميز خمسه بروتينات: N, فوسفوبروتين (P), مصفوفة البروتين (M), بروتين سكري (G), والبروتين الكبير أو البوليميريز (L). استنادا إلى متواليات النيوكليوتيد من جين N ، والمسافة الجينية ، وأنماط انتيغينيك ، وقد تم تقسيم الفيروسات إلى 16 نوعا ، والتي تتالف من فيروس الداء الكلاسيكي (RABV) والفيروسات المرتبطة بداء البشر (RRV): فيروس الخفافيش لاغوس (LBV) ، وفيروس Duvenhage ), [موتولا] حمي ([موكف]), اوروبيه خفاش [ليسسفيروس] 1 ([ايبلف-1]), الاوروبيه الخفافيش lyssavirus 2 (EBLV-2), الاستراليه الخفافيش lyssavirus (ABLV), الفيروس Aravan (ARAVAN), فيروس Ikoma (IKOV), Bokeloh بات lyssavirus (BBLV), Gannoruwa بات lyssavirus (GBLV), Irkut الفيروسات (IRKUT), [خوجند] حمي ([خوف]), غربيه قوقازية خفاش حمي ([وكبف]), [شيموني] خفاش حمي ([شبف]), و [ليدا] خفاش [ليسسفيروس] ([ليبف])2. وفي الاونه الاخيره ، تم التعرف علي فيروسين إضافيين هما: كوتالاهتي بات ليسسوفيروس (KBLV) معزولة عن مضرب براندت (MyotisBrandistti) في فنلندا في 20173 وتايوان الخفافيش LYSSAVIRUSES (twblv) معزولة عن بييستوريل اليابانية ( Pipistrellus ابراكوس) في تايوان ، الصين في 2016-20174.
جميع الثدييات عرضه لداء المرض. ومع ذلك ، لا آلافات المرضية الاجماليه أو العلامات السريرية المحددة تسمح بتحديدها ، ويمكن اجراء التشخيص فقط في المختبر5. الأسلوب الأكثر استخداما لتشخيص داء السرطان هو الدهون ، والتي تعتبر معيار الذهب من قبل كل من منظمه الصحة الرسمية و5،6. ومع ذلك ، يمكن ان تنتج FAT نتائج غير موثوق بها علي عينات الانسجه الدماغية المتدهورة/الاوتوزيد. بالاضافه إلى ذلك ، فانه لا يمكن استخدامها لفحص عينات السوائل البيولوجية مثل السائل الدماغي الشوكي ، واللعاب ، والبول ، التالي إلى حد كبير الحيلولة دون توظيفها في التشخيص قبل وفات7. الاختبارات التشخيصية التقليدية البديلة ، مثل اختبار العدوى الثقافة الانسجه داء الجلد (رتجيت) واختبار التلقيح الماوس (MIT) ، تتطلب عده أيام6، وهو العيب الرئيسي عندما التشخيص السريع أمر ضروري.
الاختبارات التشخيصية الجزيئية المختلفة (علي سبيل المثال ، الكشف عن الحمض الريبي الفيروسي عن طريق RT-PCR ، الفحص المناعي المرتبط بالانزيم PCR [PCR-ELISA] ، في التهجين الموضعي ، وفي الوقت الحقيقي PCR) تستخدم كتقنيات سريعة وحساسة لتشخيص داء السرطان8. ويوصي الآن RT-PCR من قبل المعهد البيطري لتشخيص داء السرطان الروتيني ، ويوصف PCR (hn) في دليل الاختبارات التشخيصية واللقاحات للحيوانات البرية للكشف عن جميع الفيروسات المضادة للفيروسات5. هنا نحن وصف لعموم lyssavirus المتداخلة RT-PCR ، الذي يسمح الكشف المحددة والحساسة لجميع أنواع الفيروسات الثمانية عشره مقارنه أو تتجاوز التي حصلت عليها FAT. المبدا من الأسلوب [رت] من الهدف [رنا] (يحفظ منطقه من ال [ليسسفيروس] ن مورثه) داخل [كدنا], يتبع بالتضخيم من ال [كدنا] باثنان جولات [بكر]. يخضع cDNA الجولة الاولي PCR مع الإشعال الخارجي لتضخيم جزء bp 845; ثم ، يستخدم PCR الجولة الثانية المنتج PCR الجولة الاولي كقالب لتضخيم جزء bp 371 مع الإشعال الداخلية. الطلقتين من PCR زيادة كبيره في حساسية الفحص.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

للكشف عن فيروس داء البشر والأنواع الأخرى من الأعضاء من جنس lyssavirus داخل الاسره Rhabdoviridae, وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله (المتداخلة RT-PCR) للكشف عن المنطقة المحفوظة من الجينات النونوبروتين (N) من الليسيفيروسات. ويطبق الأسلوب النسخ العكسي (RT) باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي كقالب و اليغو (dT)15 و hexamers عشوائية كما الإشعال لتوليف الفيروسية المتكاملة DNA (cdna). ثم ، يتم استخدام cDNA الفيروسية كقالب لتضخيم 845 bp N الجينات جزء في PCR الجولة الاولي باستخدام الإشعال الخارجي ، تليها الجولة الثانية PCR المتداخلة لتضخيم النهائية 371 bp جزء باستخدام الإشعال الداخلية. هذا الأسلوب يمكن الكشف عن الشقوق الوراثية المختلفة من فيروسات داء القد (RABV). وأظهرت المصادقة ، باستخدام عينات الدماغ 9,624 من ثمانيه أنواع الحيوانية المحلية في 10 سنوات من تشخيص داء البشر السريرية والمراقبة في الصين ، ان الطريقة لديها 100 ٪ حساسية و 99.97 ٪ خصوصية بالمقارنة مع الفلورسنت المباشر اختبار الأجسام المضادة (FAT) ، وهي الطريقة القياسية الذهبية التي أوصت بها منظمه الصحة العالمية والمنظمة العالمية لصحة الماشية. الاضافه إلى ذلك ، فان الطريقة يمكن أيضا تضخيم علي وجه التحديد جزء الجينات N المستهدفة من 15 الأخرى المعتمدة واثنين من الأنواع lyssavirus الرواية في التقرير العاشر للجنة الدولية لتصنيف الفيروسات (ICTV) كما تم تقييمها من قبل الكشف عن تقليد توليف N مورثه البلازميدات من كل [ليسسفيروس]. يوفر الأسلوب بديلا مناسبا للدهون لتشخيص داء السرطان وقد تمت الموافقة عليه كمعيار وطني (GB/T36789) من الصين.

وترد نتائج المتداخلة RT-PCR للكشف عن 18 أنواع lyssavirus في الشكل 1. وأظهرت جميع الضوابط الايجابيه PCR 845 bp المتوقع في الأول-و 371 bp في التكبير الجولة الثانية مع عدم وجود فرقه في السيطرة السلبية. جميع الفيروسات 18 أنتجت المتوقع 845 و/أو العصابات bp 371 ، مشيرا إلى ان المتداخلة RT-PCR الكشف عن جمي?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله للكشف عن جميع الفيروسات المعروفة علي وجه التحديد. وأظهرت المصادقة باستخدام عينات الدماغ من داء المخ للأنواع الحيوانية المختلفة ان هذه الطريقة لها حساسية وخصوصية مكافئه لاختبار الأجسام المضادة الفلورية القياسية الذهبية ويمكن استخدامها للتشخيص الروتيني لداء البشر.

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

وقد تم تطوير RT-PCR المتداخلة للكشف عن جميع فيروسات ليسا، بما في ذلك جميع 16 ICTV المعتمدة واثنين من أنواع فيروس ليسا رواية. وقد ثبت التحقق من صحة هذه الطريقة باستخدام أكثر من 9000 عينة الدماغ الحيوانية في 10 سنوات من تشخيص داء الكلب السريرية والمراقبة في الصين. لا يمكن للار تي ار ار ان تى ار المتداخلة فقط ان تنتج نتيجة ذات مصداقية على عينات من انسجة المخ الطازجة ولكن ايضا على عينات متدهورة.ويمكن استخدام غمر هذه الطريقة لحصان عينات السوائل البيولوجية مثل السائل النخاعي, اللعاب, والبول, وبالتالي يمكن تطبيق هذه الطريقة في تشخيص إنذار. من أجل تقليل التلوث المنتقل من PCR ، من المهم إعداد ضوابط سلبية وإيجابية من المهم جدًا اتخاذ خطوات. على سبيل المثال، لكل إعداد احتياجات استخراج الحمض النووي الريبي، و PCR إعداد، وينبغي تشغيل جل electrophoresis في مناطق منفصلة جسديا.ويوصى أيضا باستخدام الأشرطة الحلزونية في استخراج الحمض النووي الريبي وعكس النسخ من أجل منع التلوث داء الكلب إلى سلسلة الببتيد. التعامل السليم مثل إعداد وكلاء الخاص بك على الجليد، وتغيير القفازات بانتظام، واستخدام المواد الحرة ريبونوكريلي منع إدخال ريبونوكريلاز والقضاء على تدهور الجيش الملكي النيبالي. لبدء هذا الإجراء، استخراج RNA من الأنسجة المشتبه في داء الكلب، خزعات الجلد، اللعاب، السائل النخاعي أو ثقافة الخلايا المصابة RABV كما هو مبين في بروتوكول النص.عندما تكون جاهزة للمضي قدما، وإزالة الكواشف اللازمة من الثلاجة والاحتفاظ بها على الجليد. تأكد من ذوبان و دوامة كل كاشف قبل الاستخدام. للنسخ العكسي للرنا الفيروسي إلى cDNA إعداد 12 لتراً من مزيج التفاعلات الدقيقة لكل عينة على الجليد وأنبوب 1.5 ملليلتر للطرد المركزي كما هو مبين في الجدول 1 من بروتوكول النص في غرفة نظيفة.لحساب الاختلافات الأنابيب، وإعداد حجم من مزيج رئيسي على الأقل حجم رد فعل واحد أكبر من المطلوب، ومن ثم تقسيم مزيج التفاعل إلى أنابيب PCR 0.2 ملليلتر. في محطة عمل PCR في غرفة قالب، إضافة ثمانية ميكرولترات إما عينة أو واحدة من عناصر التحكم لمزيج رد فعل. السيطرة الإيجابية هي الحمض النووي الريبي المستخرجة من خلية الثقافة المصابة سلالة ثابتة-RABV CVS11، في حين أن السيطرة السلبية تحتوي على المياه المقطرة مزدوجة خالية من رناز.خلط محتويات كل أنبوب عن طريق دوامة الأولى ثم عن طريق الطرد المركزي لفترة وجيزة. بعد ذلك، قم بتحميل أنابيب التفاعل في دراجة حرارة. إعداد وتشغيل برنامج تجميع cDNA كما هو موضح في بروتوكول النص.أولا، استرداد الكواشف اللازمة والاحتفاظ بها على الجليد في غرفة نظيفة حتى جاهزة للاستخدام. عندما تكون جاهزة، ذوبان ودوامة الكواشف. بعد ذلك، قم بإعداد 48 ميكرولترات من المزيج الأولي من البوليسترولينات الأولية لكل عينة في أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر على النحو المبين في الجدول 2 من بروتوكول النص وتقسيم مزيج التفاعل إلى أنابيب PCR 0.2 ملليلتر.في محطة عمل PCR في غرفة قالب، إضافة نموذجين microliter من cDNA في أول جولة PCR المزيج. وتشمل اثنين من microliters من CVS11 cDNA كتحكم إيجابي، واثنين من ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة كتحكم سلبي. ثم، نقل أنابيب مختومة في ثيرسيكلولر PCR ودورة باستخدام المعلمات المذكورة في الجدول 3 من بروتوكول النص.للبدء، إعداد 48 ميكرولترات من المزيج PCR الجولة الثانية لكل عينة في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر على النحو المبين في الجدول 4 من بروتوكول النص وتقسيم مزيج التفاعل إلى أنابيب PCR 0.2 ملليلتر. إضافة اثنين microliters من المنتج PCR الجولة الأولى في المزيج PCR الجولة الثانية. وتشمل المياه المقطرة مزدوجة كتحكم سلبي لهذه الجولة من PCR.ثم تنفيذ الدراجات الحرارية PCR باستخدام المعلمات المذكورة في الجدول 3 من بروتوكول النص. أولاً، أضف 1.5 جرام من الأاروز إلى 100 ملليلتر من تريس-أسيتات EDTA واسخنيها في فرن ميكروويف لإذابتها تمامًا. بعد ذلك، إضافة بروميد الإثيديوم في تركيز نهائي من 0.01٪ صب الجل في القالب وترك الأمر لترسيخ في درجة الحرارة المحيطة لمدة 30 دقيقة على الأقل.إعداد عينات التحميل عن طريق خلط خمسة ميكرولترات من كل منتج PCR مع ميكرولتر واحد من 6x تحميل العازلة. تحميل عينات بشكل منفصل وعلامة الحمض النووي مناسبة في الآبار وتشغيل هلام لمدة 30 إلى 45 دقيقة تقريبا في 120 فولت حتى خط الصبغة هو ما يقرب من 75 إلى 80٪ أسفل هلام. عند اكتمال الركض، قم بإيقاف تشغيل الطاقة وفصل الأقطاب الكهربائية عن مصدر الطاقة.ثم، إزالة بعناية هلام من مربع هلام. استخدام جهاز توثيق هلام الأشعة فوق البنفسجية لتصور وتصوير شظايا الحمض النووي. يميّز ال متداخلة النسخ العكسي PCR كما هو موضح في بروتوكول النص.تظهر هنا نتائج تمثيل متداخلة RT-PCR للكشف عن 18 نوعًا من أنواع فيروسات ليسا. ال [بكرّرّسبسّس]. لا ينظر إلى الفرقة للضوابط السلبية.وينظر إلى جميع الفيروسات Lyssaes 18 لإنتاج نفس النطاقين كما السيطرة الإيجابية، مما يشير إلى أن المتداخلة RT-PCR الكشف عن جميع الفيروسات Lyssa 18. في حين أن 16 من البلازميدات لديها تضخيم فعال في جولتين من PCR ، يتم تضخيم اثنين منهم ، فيروس Aravan وفيروس إيكوما ، فقط في الجولة الأولى أو الثانية ، على التوالي. وتختلف حساسية الأسلوب في الكشف عن بلازميدات الفيروسات ليسا مختلفة، من قيم تتراوح بين 2.24 إلى 2، 240 جزيئات لكل ميكرولتر.ويمكن أن تعزى هذه الاختلافات إلى عدم التطابق بين القوالب التمهيدية والقوالب بسبب تنوع التسلسل الفيروسي. مقارنة بين 9, 624 أنسجة الدماغ من العينات السريرية التي يتم اختبارها من قبل PCR متداخلة مقابل تلك التي تم اختبارها مع FAT يظهر أن تتداخل RT-PCR كحساسية 100٪ وخصوصية 99.97٪ وقد دعي الاتّق بين الطريقتين 99.07٪ عشرة مختبرات أخرى لداء الكلب لإجراء الاختبار للتحقق من صحة الـ RT-PCR المتداخلة. جميع المختبرات العشرة التي حصلت على نتائج RT-PCR المتداخلة التي هي 100٪ وفقا لل FAT، مع عدم وجود سلبيات كاذبة أو ايجابيات كاذبة، مما يشير إلى أن RT-PCR المتداخلة لديها خصوصية عالية وتكرار.ويوصى الآن RT-PCR من قبل OIE لاستخدام تقنيات داء الكلب. وقد ثبت أن لدينا متداخل RT-PCR كمعيار وطني لتقنيات داء الكلب في الصين في عام 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

عكس التحليل التضخيم متحاور حلقة تتوسط النسخ (RT-مصباح) للفيروس Zika والجينات التدبير المنزلي في البول والمصل، وعينات البعوض

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...