Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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这项研究得到了国家关键研究和发展计划 (2016号 YFD0500401 赠款) 和中国国家自然科学基金 (第31302043赠款) 的支持。

该议定书中对小鼠的使用得到了中国军事医学科学院动物福利管理委员会的批准 (实验动物护理和使用委员会授权, 许可证编号 jsy-dw-2010-02)。所有关于护理和使用实验动物的机构和国家准则都得到了遵守。
1. RNA 提取
<ol><li>使用鸟苷异硫氰酸酯-苯-氯仿提取方法或市售的病毒 rna 提取试剂盒, 从狂犬病疑似脑组织、皮肤活检、唾液或脑脊液或感染 rabv 的细胞培养中提取 RNA。立?...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

目前, RABIES 是一种主要的裂解病毒, 对中国以及其他国家几乎所有的人类和动物狂犬病负有责任。此外, 2012年10年, 在中国东北吉林省的murina 白球蝙蝠身上首次发现了 irkv 变种, 据报道, 该变种在2017年在辽宁省造成一只狗死亡11。最近, 2017年, 在中国台湾, 从日本的一种管状蝙蝠身上发现了一种新型的溶酶病毒 TWBLV。这些结果表明, 有效检测其他裂解?...

狂犬病是一种世界性的人畜共患疾病,由 Lyssavirus1属内的病毒引起。Lyssaviruses ( Rhabdoviridae家族) 是单基因链 rna 病毒, 基因组约为 12 kb, 编码五种蛋白质: n、磷蛋白 (p)、基质蛋白 (m)、糖蛋白 (g) 和大蛋白质或聚合酶 (l)。根据 N 基因的核苷酸序列、遗传距离和抗原模式, lyssaviruses 被划分为16个物种, 包括经典狂犬病病毒 (RABIES) 和狂犬病相关病毒 (RRV): 拉各斯蝙蝠病毒 (LBV)、Duvenhage 病毒 (DUVV))、Ikoma 病毒 (IKOMA)、欧洲蝙蝠裂解病毒 1 (EBLV-1)、欧洲蝙蝠裂解病毒 2 (EBLV-2)、澳大利亚蝙蝠裂解病毒 (ABLV)、Aravan 病毒 (ARAV)、Ikoma 病毒 (IKOV)、Bokeloh 蝙蝠 lyssavirus (BBLV)、Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV)、Ikoma 病毒 (IKOMA),Khujand 病毒 (KHUV)、西亚蝙蝠病毒 (WCBV)、Shimoni 蝙蝠病毒 (SHIBV) 和 Lleida 蝙蝠裂解病毒 (LYSSAVIRUS)2。最近又发现了两种溶酶病毒: 2017年在芬兰从勃兰特蝙蝠 (Myotis brandtii) 中分离出的 kotalahti 蝙蝠溶酶病毒 (kblv) 3 和从日本管状物中分离出的台湾蝙蝠溶酶病毒 (twblv) (2016年至2017年在中国台湾的 pipistrellus abramus) 4。
所有哺乳动物都容易患狂犬病;然而, 没有严重的病原学病变或特定的临床体征允许其识别, 诊断只能在实验室5。狂犬病诊断最广泛使用的方法是 fat, 世卫组织和国际兽疫局5、6、6都将其视为金本位。然而, FAT 可以产生不可靠的结果降解/自溶脑组织样本。此外, 它不能用于检测生物液体标本, 如脑脊液 (CSF), 唾液和尿液, 从而在很大程度上排除了它在前肿瘤诊断7。替代常规诊断测试, 如狂犬病组织培养感染测试 (RTCIT) 和小鼠接种测试 (MIT), 需要几天6, 一个主要的缺点, 当快速诊断是必不可少的。
各种分子诊断测试 (例如, 通过 RT-PCR 检测病毒 rna、PCR-酶联免疫吸附法 [PCR-ELISA]、原位杂交和实时 PCR) 被用作狂犬病诊断的快速和敏感技术8。RT-PCR 现在被国际兽疫局推荐用于常规狂犬病诊断, 并且在《兽生动物诊断测试和疫苗手册》中描述了一种半检测 (hn) PCR, 以检测所有的溶酶病毒 5。在这里, 我们描述了一个泛裂解病毒嵌套的 RT-PCR, 它允许特定和敏感地检测所有18种裂解病毒, 类似于或超过 FAT 获得的。该方法的原理是将目标 RNA (裂解病毒 N 基因的保守区域) rt 转化为 cDNA, 然后通过两轮 PCR 扩增 cdna。CDNA 通过第一轮 PCR 与外部引物, 以扩增 845 bp 片段;然后, 第二轮 PCR 使用第一轮 PCR 产物作为模板, 用内引物扩增 371 bp 片段。两轮 PCR 显著提高了检测的灵敏度。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

为了检测狂犬病毒和其他品种的独状病毒在Rhabdoviridae家族中, 开发了泛裂解病毒嵌套逆转录聚合酶链反应 (嵌套 rt-pcr) 来检测保守区域裂解病毒的核蛋白 (N) 基因。该方法应用逆转录酶 (RT) 作为模板, 寡核苷酸 (dT) 15 和随机六分体为引物, 合成病毒互补 DT (cdna)。然后, 病毒 cDNA 被用作模板, 在第一轮 PCR 中使用外部引物扩增 845 bpn 基因片段, 然后采用第二轮嵌套 PCR, 使用内引物扩增最终 371 bp 片段。这种方法可以检测狂犬病病毒 (RABIES) 的不同遗传障碍。该方法在中国10年的临床狂犬病诊断和监测中, 使用了8种家畜的 9, 624个大脑标本, 结果表明, 与直接荧光相比, 该方法具有100% 的敏感性和99.97 的特异性。抗体检测 (FAT), 这是世界卫生组织 (世卫组织) 和世界动物卫生组织 (OIE) 推荐的金标准方法。此外, 该方法还可以具体放大国际病毒分类委员会 (ICTV) 第十次报告中其他15个已批准的和两个新的裂解病毒物种的靶向 n 基因片段, 并通过对合成的模拟检测进行评估。所有裂解病毒的 n 基因质粒。该方法为 FAT 狂犬病诊断提供了一种方便的替代方法, 并已被批准为中国国家标准 (GB/T36789-2018)。

嵌套 RT-PCR 检测18种裂解病毒的结果如图 1所示。所有 PCR 阳性对照显示, 在第二轮扩增中, 第一和 371 bp 的预期 845 bp, 在负对照中没有带带。所有18种裂解病毒产生了预期的845和/或 371 bp 波段, 这表明嵌套的 RT-PCR 检测到了所有18种 lyssaviruses。16种裂解病毒质粒在两轮 PCR 中具有有效扩增作用, 但在第一轮或第二轮 PCR 中, 有两种裂解病毒质粒具有扩增作用。该方法在检测不同的裂?...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

一种泛裂解病毒嵌套逆转录聚合酶链反应已开发出来, 专门检测所有已知的溶酶病毒。利用不同动物物种的狂犬病脑样本进行验证, 表明该方法具有与金标准荧光抗体检测相当的敏感性和特异性, 可用于常规狂犬病诊断。

一种通用嵌套逆转录酶链反应检测裂解病毒的评价

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

嵌套RT-PCR已开发检测所有莱萨病毒，包括所有16个ICTV批准和两个新的莱萨病毒物种。在中国10年的临床狂犬病诊断和监测中，利用9000多个动物脑标本验证了这种方法。嵌套的RT-PCR不仅能对新鲜的脑组织样本产生可靠的结果，还可以在降解的样品上产生可靠的结果。这种方法可用于检测生尿液标本，如脑脊液、唾液和尿液，因此该方法可应用于最后通令诊断。为了最大限度地减少 PCR 结带污染，准备消极和积极的控制措施非常重要，采取措施非常重要。例如，对于每种RNA提取需求制备，PCR设置和凝胶电泳应在物理上独立的区域操作。还建议在RNA提取和逆转录中使用螺旋胶带，以防止狂犬病污染肽链。正确处理，如在冰上准备您的制剂，定期更换手套，以及使用无核糖核酸酶材料，将防止核糖酶的引入，并消除RNA的降解。为了开始这个程序，从狂犬病疑似组织、皮肤活检、唾液、脑脊液或RABV感染细胞培养中提取RNA，如文本协议中所述。准备好继续操作时，从冰柜中取出所需的试剂，并放在冰上。使用前，请确保解冻并旋转每个试剂。对于病毒RNA到cDNA的逆转录，为冰上每个样品和1.5毫升离心管制备12微升的反应混合物，如洁净室文本协议表1中所述。要考虑移液变化，请准备至少一个比所需大小大的主混合物，然后将反应混合物分成 0.2 毫升 PCR 管。在模板室的 PCR 工作站中，将样品的八个微升或其中一个控件添加到反应组合中。阳性对照是从感染固定RABV菌株CVS11的细胞培养物中提取的RNA，而负对照含有无Rnase双蒸馏水。首先涡旋，然后短暂离心，混合每个管的内容。在此之后，将反应管加载到热循环器中。设置并运行文本协议中概述的 cDNA 合成程序。首先，取回必要的试剂，并把它们放在洁净室的冰上，直到准备好使用。准备就绪后，解冻并旋涡试剂。接下来，根据文本协议表2中概述的1.5毫升离心管中每个样品准备48微升第一轮PCR混合物，将反应混合物分成0.2毫升PCR管。在模板室的 PCR 工作站中，将 cDNA 的两微升样本添加到第一轮 PCR 混合中。包括两个CVS11 cDNA的微升作为正对，两个微升的双蒸馏水作为负对。然后，将密封管转移到 PCR 热循环器中，并使用文本协议表 3 中列出的参数循环。首先，根据文本协议表4中概述的1.5毫升离心管中每个样品准备48微升第二轮PCR混合物，将反应混合物分成0.2毫升PCR管。将第一轮 PCR 产品的两个微升添加到第二轮 PCR 组合中。包括双蒸馏水作为本轮PCR的负对。然后，使用文本协议表 3 中列出的参数执行 PCR 热循环。首先，在100毫升三醋酸EDTA中加入1.5克的气糖，并在微波炉中加热，将其彻底溶解。接下来，以0.01%的最终浓度加入溴化乙酰胺，将凝胶倒入模具中，并在环境温度下凝固至少30分钟。通过将每个 PCR 产品的五微升与一个 6 倍加载缓冲器的微升混合来准备加载样品。将样品和合适的DNA标记物单独加载到井中，在120伏特下运行凝胶约30至45分钟，直到染料线在凝胶下约75至80%。运行完成后，关闭电源并断开电极与电源的连接。然后，小心地从凝胶盒中取出凝胶。使用紫外凝胶记录设备可视化和拍摄DNA片段。如文本协议中所述，对嵌套的反向转录 PCR 进行描述。此处显示了一个代表性嵌套的 RT-PCR 检测 18 个 Lyssa 病毒物种的结果。PCR 正对显示第一轮放大时 845 个碱基对的预期波段，第二轮放大的 371 个基对的预期波段。对于负控件，未看到带。所有 18 个 Lyssa 病毒都被认为产生与阳性对照相同的两个波段，表明嵌套的 RT-PCR 检测到所有 18 个 Lyssa 病毒。虽然16个质粒在两轮PCR中有效扩增，其中两个质粒，即阿拉万病毒和Ikoma病毒，只在第一轮或第二轮被放大。该方法的灵敏度在检测不同的莱莎病毒质粒时各不相同，从每微升2.24到2，240分子不等。这些差异可归因于由于病毒序列多样性导致的底像和模板之间的不匹配。对通过嵌套 PCR 测试的临床标本中的 9，624 个脑组织与 FAT 测试的脑组织进行比较后发现，嵌套RT-PCR的灵敏度为100%，特异性为99.97%。所有 10 个实验室获得的嵌套 RT-PCR 结果都符合 FAT 的 100%，无假阴性或误报，表明嵌套的 RT-PCR 具有高特异性和可重复性。RT-PCR 现在被国际动物技术研究公司推荐用于狂犬病技术。我们的嵌套RT-PCR已被证明是2018年中国狂犬病技术国家标准。

Research

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