Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Undersøgelsen blev støttet af den nationale centrale forsknings-og udviklings plan (Grant No. 2016YFD0500401) og den nationale naturvidenskabelige fond i Kina (Grant No. 31302043).

Brugen af mus i denne protokol blev godkendt af den administrative Komité for dyrevelfærd for Institut for militær veterinærmedicin, Akademiet for militære medicinske videnskaber, Kina (laboratorium Animal Care og use Udvalget autorisation, tillade nummer JSY-DW-2010-02). Alle institutionelle og nationale retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr blev fulgt.
1. RNA-ekstraktion
<ol><li>Ekstrakt RNA fra rabies-mistænkt hjernevæv, hud biopsier, spyt, eller CSF eller fra RAB...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

I øjeblikket, RABV er en stor lyssavirus ansvarlig for næsten alle menneskers og dyrs rabies i Kina, samt i andre lande. Desuden blev en IRKV variant først identificeret fra en Murina leucogaster bat i Jilin provinsen i det nordøstlige Kina i 201210, og det er blevet rapporteret at forårsage en hunds død i Liaoning-provinsen i 201711. Senest blev en roman lyssavirus, TWBLV, også identificeret fra en japansk Pipistrelle bat i Taiwan, Kina i 2017. Dis...

Rabies er en verdensomspændende zoonotisk sygdom forårsaget af vira i slægten lyssavirus1. Lyssavira (familien Rhabdoviridae) er enkelt-negative-strandede RNA-vira med et ca. 12 kb genom, der koder fem proteiner: N, phosphoprotein (P), matrix protein (M), glykoprotein (G) og det store protein eller polymerase (L). Baseret på nukleotidsekvenser af N-genet, genetisk afstand og antigen mønstre er lyssavirusset inddelt i 16 arter, der omfatter klassisk rabiesvirus (RABV) og rabies relaterede vira (RRV): Lagos bat-virus (LBV), Duvenhage-virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), West kaukasisk bat-virus (WCBV), Shimoni bat-virus (SHIBV) og Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. For nylig er to yderligere Lyssavira blevet identificeret: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isoleret fra en Brandts bat (Myotis brandtii) i Finland i 20173 og Taiwan bat LYSSAVIRUS (twblv) isoleret fra en japansk Pipistrelle ( Pipistrellus abramus) i Taiwan, Kina i 2016 – 20174.
Alle pattedyr er modtagelige for rabies; dog er det ikke muligt at identificere grove patognomoniske læsioner eller specifikke kliniske tegn, og diagnosen kan kun fremstilles i laboratoriet5. Den mest udbredte metode til rabies diagnose er fedtet, der betragtes som guldstandarden af både WHO og OIE5,6. Ikke desto mindre kan FAT producere upålidelige resultater på forringede/autolyzed hjernevæv prøver. Desuden kan det ikke bruges til at måle biologiske væskeprøver såsom cerebrospinalvæsken (CSF), spyt og urin, hvilket i vid udstrækning udelukker dens beskæftigelse i antemortem diagnose7. Alternative konventionelle diagnostiske tests, såsom rabies vævskultur infektion test (RTCIT) og mus inokulering test (MIT), kræver flere dage6, en stor ulempe, når en hurtig diagnose er afgørende.
Forskellige molekylære diagnostiske tests (f. eks. påvisning af viral RNA ved RT-PCR, PCR-enzym-linked immunosorbent assay [PCR-ELISA], in situ-hybridisering og real-time PCR) anvendes som hurtige og følsomme teknikker til rabies diagnose8. RT-PCR anbefales nu af OIE til rutinemæssig rabies diagnose, og en heminested (HN) PCR er beskrevet i OIE'S manual for diagnostiske tests og vacciner til landdyr for at detektere alle Lyssavira5. Her beskriver vi en pan-lyssavirus indlejret RT-PCR, som giver mulighed for specifik og følsom påvisning af alle 18 lyssavirus arter, der kan sammenlignes med eller overstiger det, der opnås ved FAT. Princippet i metoden er en RT af målet RNA (bevaret region af lyssavirus N genet) i cDNA, efterfulgt af amplifikation af cDNA ved to runder af PCR. CDNA gennemgår den første runde PCR med ydre primere for at forstærke et 845 BP-fragment; derefter bruger den anden runde PCR det første runde PCR-produkt som en skabelon til at forstærke et 371 BP-fragment med indvendige grundere. De to PCR-runder øger analysens følsomhed betydeligt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Til påvisning af rabiesvirus og andre medlems arter af slægten lyssavirus i familien Rhabdoviridaeblev den pan-lyssavirus indlejrede reverse transkription polymerasekæde reaktion (indlejret RT-PCR) udviklet til at detektere det konserverede område nukleoprotein (N)-genet af Lyssavira. Metoden anvender omvendt transkription (RT) ved hjælp af viral RNA som skabelon og oligo (DT)15 og tilfældige hexamerer som primere til at syntetisere den virale komplementære DNA (cDNA). Derefter bruges den virale cDNA som en skabelon til at forstærke et 845 BP N-genfragment i første runde PCR ved hjælp af ydre grundere, efterfulgt af anden runde indlejret PCR for at forstærke det endelige 371 BP-fragment ved hjælp af indvendige grundere. Denne metode kan detektere forskellige genetiske clader af rabiesvirus (RABV). Valideringen, ved hjælp af 9.624 hjerne prøver fra otte husdyrarter i 10 års kliniske rabies diagnoser og overvågning i Kina, viste, at metoden har 100% følsomhed og 99,97% specificitet i forhold til den direkte fluorescerende antistof test (FAT), den guld standardmetode, der anbefales af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) og Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE). Desuden kunne metoden også specifikt forstærke det målrettede N-genfragment af 15 andre godkendte og to nye lyssavirus arter i den tiende rapport fra den internationale komité for taksonomi for vira (ICTV), vurderet ved en efterligner påvisning af syntetiserede N gen plasmider af alle Lyssavira. Metoden giver et praktisk alternativ til FAT for rabies diagnose og er blevet godkendt som en national standard (GB/T36789-2018) i Kina.

Resultater af indlejret RT-PCR til påvisning af 18 lyssavirus arter er vist i figur 1. Alle PCR-positive kontroller viste det forventede 845 BP i første-og 371 BP i den anden runde-forstærkning uden et bånd i den negative kontrol. Alle 18 Lyssavira producerede de forventede 845 og/eller 371 BP-bånd, hvilket indikerer, at den indlejrede RT-PCR detekterede alle 18 Lyssavira. Seksten Lyssavira plasmider havde effektiv forstærkning i to runder af PCR, men to, nemlig arav og ikov, havde for...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

En pan-lyssavirus indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion er blevet udviklet til at påvise specifikt alle kendte Lyssavira. Validering ved hjælp af rabies hjernen prøver af forskellige dyrearter viste, at denne metode har en følsomhed og specificitet svarende til den gyldne standard fluorescerende antistof test og kunne anvendes til rutinemæssig rabies diagnose.

Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Den indlejrede RT-PCR er udviklet til at detektere alle lyssavirus, herunder alle 16 ICTV-godkendte og to nye lyssavirusarter. Valideringen af denne metode er blevet bevist ved hjælp af over 9000 dyrehjernprøver i 10 års klinisk rabiesdiagnose og -overvågning i Kina. Den indlejrede RT-PCR ikke kun kan producere troværdige resultat på friske hjernevæv prøver, men også på nedbrudte prøver.Oversvømmelsen denne metode kan bruges til at analysere biologiske væske prøver såsom cerebrospinalvæske, spyt, og urin, derved denne metode kan anvendes i ultimatum diagnoser. For at minimere PCR fremførskontaminering, er det vigtigt at forberede negative og positive kontroller Det er virkelig vigtigt at tage skridt. For eksempel, for hver RNA ekstraktion behov forberedelse, PCR oprettet, og gel elektroforese bør anvendes i fysisk separate områder.Det anbefales også at bruge spiralbånd i RNA-ekstraktion og omvendt transskription for at forhindre rabiesforurening til peptidkæden. Korrekt håndtering såsom at forberede dine agenter på is, skifte handsker regelmæssigt, og brug af ribonuclease frie materialer vil forhindre indførelsen af ribonuclease og fjerne nedbrydning af RNA. For at begynde denne procedure, udtrække RNA fra rabies mistanke væv, hud biopsier, spyt, cerebrospinalvæske eller RABV inficeret cellekultur som skitseret i tekstprotokollen.Når du er klar til at fortsætte, fjernet de nødvendige reagenser fra fryseren og holde dem på is. Sørg for at tø op og vortex hvert reagens før brug. For omvendt transskription af den virale RNA til cDNA forberede 12 mikro liter reaktion mix for hver prøve på is og en 1,5 milliliter centrifuge rør som skitseret i tabel 1 i tekstprotokollen i et renrum.For at tage højde for pipetteringsvariationer skal du forberede et volumen af masterblandingen, der er mindst én reaktionsstørrelse større end påkrævet, og derefter opdele reaktionsblandingen i 0,2 milliliter PCR-rør. I en PCR-arbejdsstation i et skabelonrum skal du tilføje otte mikroliter af enten prøven eller en af kontrollerne til reaktionsblandingen. Den positive kontrol er RNA udvundet af cellekulturen inficeret med fast RABV stamme CVS11, mens den negative kontrol indeholder Rnase-fri dobbeltdestilleret vand.Bland indholdet af hvert rør ved først vortexing og derefter ved kort centrifugering. Derefter skal reaktionsrørene vejes i en termoncyr. Konfigurer og kør cDNA-synteseprogrammet som beskrevet i tekstprotokollen.Først skal du hente de nødvendige reagenser og holde dem på is i et renrum, indtil de er klar til brug. Når du er klar, tø og vortex reagenserne. Dernæst forberedes 48 mikroliter af første runde PCR-mix for hver prøve i et 1,5 milliliter centrifugerør som beskrevet i tabel 2 i tekstprotokollen, og reaktionsblandingen opdeles i 0,2 milliliter PCR-rør.I en PCR-arbejdsstation i et skabelonrum skal du tilføje en to mikroliterprøve af cDNA i første runde PCR-mix. Medtag to mikroliter CVS11 cDNA som en positiv kontrol, og to mikroliter af dobbelt destilleret vand som en negativ kontrol. Derefter overføres de forseglede rør til en PCR-termocykator, og cyklussen ved hjælp af de parametre, der er anført i tabel 3 i tekstprotokollen.Til at begynde forberede 48 mikroliter af anden runde PCR mix for hver prøve i en 1,5 milliliter centrifuge rør som skitseret i tabel 4 i tekstprotokollen og opdele reaktion mix i 0,2 milliliter PCR rør. Tilføj to mikroliter af den første runde PCR produkt i anden runde PCR mix. Medtag dobbelt destilleret vand som en negativ kontrol for denne runde af PCR.Udfør derefter PCR-termocykling ved hjælp af de parametre, der er angivet i tabel 3 i tekstprotokollen. Først tilsættes 1,5 gram agarose til 100 milliliter Tris-acetat EDTA og varme det i en mikrobølgeovn for at opløse det grundigt. Dernæst tilsættes ethidium bromid ved en endelig koncentration på 0,01%Hæld gelen i formen og lad den størkne ved omgivelsestemperatur i mindst 30 minutter.Forbered belastningsprøverne ved at blande fem mikroliter af hvert PCR-produkt med en mikroliter 6x læssebuffer. Hver for sig indlæses prøverne og den passende DNA-markør i brøndene, og gelen køres i ca. 30 til 45 minutter ved 120 volt, indtil farvestoffet er ca. 75 til 80% nede i gelen. Når kørslen er færdig, skal du slukke for strømmen og koble elektroderne fra strømkilden.Fjern derefter forsigtigt gelen fra gelboksen. Brug en UV-gel, der dokumenterer enheden, til at visualisere og fotografere DNA-fragmenterne. Karakterisere den indlejrede pcr med omvendt transskription som beskrevet i tekstprotokollen.Resultaterne af en repræsentativ indlejret RT-PCR til at opdage 18 Lyssavirus arter er vist her. PCR positive kontroller viser det forventede bånd på 845 base par i første runde forstærkning og på 371 base par for den anden. Der ses ingen bånd til de negative kontroller.Alle 18 lyssavirus ses at producere de samme to bånd som den positive kontrol, hvilket indikerer, at den indlejrede RT-PCR opdaget alle 18 Lyssavirus. Mens 16 af plasmiderne har effektiv forstærkning i to runder PCR, forstærkes to af dem, Aravan virus og Ikoma-virus, kun i enten første eller anden runde. Metodens følsomhed varierer i påvisningen af forskellige Lyssavirus plasmider, fra værdier fra 2,24 til 2, 240 molekyler pr mikroliter.Disse forskelle kan tilskrives misforholdet mellem primere og skabeloner på grund af viral sekvens mangfoldighed. En sammenligning på 9, 624 hjernevæv fra kliniske prøver, der testes af indlejrede PCR versus dem, der er testet med FAT, viser, at indlejrede RT-PCR som en følsomhed på 100% og en specificitet på 99,97%Overensstemmelsen mellem de to metoder er 99,07%Ti andre rabieslaboratorier blev opfordret til at gennemføre testen for yderligere at validere den indlejrede RT-PCR. Alle ti laboratorier opnåede indlejrede RT-PCR-resultater, der er 100% i overensstemmelse med FAT, uden falske negativer eller falske positiver, hvilket indikerer, at den indlejrede RT-PCR har en høj specificitet og reproducerbarhed.RT-PCR anbefales nu af OIE til brug af rabiesteknologier. Og vores indlejrede RT-PCR er blevet bevist som den nationale standard for rabiesteknologier i Kina i 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme Genotypebestemmelse af toksiske Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kvantitative opdagelse af RNA-afhængige RNA Polymerase aktivitet af menneskelige Telomerase Reverse transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metoder til nøjagtig detektering af mitokondrie-DNA methylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Enkelt dråbe Digital Polymerase Chain Reaction for omfattende og samtidige påvisning af mutationer i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse transkription-Loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) Assay for Zika Virus og husholdning gener i urin, Serum og myg prøver

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...