Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

De studie werd gesteund door het nationale belangrijkste onderzoek en ontwikkelings plan (toelage nr. 2016YFD0500401) en de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (toelage nr. 31302043).

Het gebruik van muizen in dit protocol werd goedgekeurd door het administratief Comite voor het welzijn van dieren van het Instituut voor militaire veterinaire geneeskunde, de Academie voor militaire medische wetenschappen, China (laboratorium Dierzorg en het gebruik Comite vergunning, vergunning aantal JSY-DW-2010-02). Alle institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd.
1. de extractie van RNA
<ol><li>Extract RNA van rabiës-vermoed...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Momenteel, is RABV een belangrijke Lyssavirus verantwoordelijk voor bijna al menselijke en dierlijke hondsdolheid in China, evenals in andere landen. Bovendien werd een IRKV variant eerst geïdentificeerde van a Murina leucogaster knuppel in de provincie Jilin in noordoostelijk China in 201210, en het is gemeld om de dood van een hond in de provincie Liaoning in 201711te veroorzaken. Onlangs, werd een roman Lyssavirus, TWBLV, ook geïdentificeerde van een ...

Rabiës is een wereldwijde zoönose die wordt veroorzaakt door virussen binnen het geslacht Lyssavirus1. Lyssaviruses (familie Rhabdoviridae) zijn enig-negatief-gestrande virussen van RNA met een ongeveer 12 KB genoom dat vijf proteïnen codeert: N, Phosphoprotein (P), matrijsproteïne (M), glycoproteïne (G), en het grote proteïne of de polymerase (L). Op basis van nucleotide sequenties van het N gen, genetische afstand, en antigene patronen, de lyssaviruses zijn onderverdeeld in 16 soorten, bestaande uit klassieke rabiësvirus (RABV) en de rabiës-gerelateerde virussen (RRV): Lagos bat virus (LBV), Duvenhage virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), Europese knuppel Lyssavirus 1 (EBLV-1), Europese knuppel Lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische knuppel Lyssavirus (ABLV), Aravan virus (Frédéric), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh knuppel Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa knuppel Lyssavirus (GBLV), Irkoet virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), het westen Kaukasische knuppel virus (WCBV), Shimoni het virus van de knuppel (SHIBV), en de knuppel Lyssavirus van Lleida (LLEBV)2. Onlangs zijn twee extra lyssaviruses geïdentificeerd: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) geïsoleerd van een brandt ' bat (Myotis brandtii) in Finland in 20173 en Taiwan bat Lyssavirus (TWBLV) geïsoleerd van een Japanse vleermuis ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China in 2016 – 20174.
Alle zoogdieren zijn vatbaar voor rabiës; echter, geen grove Pathognomonisch laesies of specifieke klinische symptomen mogelijk zijn identificatie, en de diagnose kan alleen worden gemaakt in het laboratorium5. De meest gebruikte methode voor hondsdolheid diagnose is het vet, dat wordt beschouwd als de gouden standaard door zowel de WHO en de OIE5,6. Niettemin, het vet kan produceren onbetrouwbare resultaten op gedegradeerde/autolyzed hersenweefsel monsters. Bovendien, het kan niet worden gebruikt om biologische vloeistoffen monsters zoals hersenvocht (CB), speeksel, en urine Assay, waardoor grotendeels uitschakeling zijn werkgelegenheid in antemortem diagnose7. Alternatieve conventionele diagnostische tests, zoals de hondsdolheid weefselkweek infectie test (RTCIT) en de muis inenting test (MIT), vereisen enkele dagen6, een groot nadeel wanneer een snelle diagnose van essentieel belang is.
Diverse moleculaire kenmerkende tests (b.v., de opsporing van viraal RNA door RT-PCR, PCR-enzym-verbonden immunosorbent assay [PCR-ELISA], in situ kruising, en PCR in real time) worden gebruikt als snelle en gevoelige technieken voor hondsdolheid diagnose8. RT-PCR wordt nu geadviseerd door OIE voor routine hondsdolheid diagnose, en een heminested (hn) PCR wordt beschreven in het OIE handboek van kenmerkende tests en vaccins voor aardse dieren om al lyssaviruses5te ontdekken. Hier beschrijven we een pan-Lyssavirus geneste RT-PCR, die het mogelijk maakt de specifieke en gevoelige detectie van alle 18 Lyssavirus soorten vergelijkbaar met of hoger dan die verkregen door het vet. Het principe van de methode is een RT van het doel RNA (geconserveerd gebied van het Lyssavirus N gen) in cDNA, gevolgd door de versterking van de cDNA door twee rondes van PCR. De cDNA ondergaat de eerste ronde PCR met buitenste primers om een 845 BP fragment te versterken; dan, gebruikt tweede-ronde PCR het eerste-ronde PCR product als malplaatje om een 371 BP fragment met binneninleidingen te versterken. De twee rondes van PCR verhogen beduidend de gevoeligheid van de analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Voor het opsporen van rabiësvirus en andere lid soorten van het geslacht Lyssavirus binnen de familie Rhabdoviridae, de pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reaction (geneste RT-PCR) werd ontwikkeld om de geconserveerde regio te detecteren van het nucleoproteïne (N) gen van lyssaviruses. De methode past omgekeerde transcriptie (RT) toe gebruikend Viral RNA als malplaatje en oligo (dT)15 en willekeurige hexamers als inleidingen om het virale bijkomende DNA (cDNA) te synthetiseren. Dan, wordt virale cDNA gebruikt als malplaatje om een fragment van het gen van 845 BP N in eerste ronde PCR te versterken gebruikend buiten inleidingen, die door tweede-ronde geneste PCR worden gevolgd om def. 371 te versterken BP fragment gebruikend binnenprimers. Deze methode kan detecteren verschillende genetische bekleed van rabiës virussen (RABV). De validatie, met behulp van 9.624 hersen specimens uit acht huisdier soorten in 10 jaar van klinische rabiës diagnoses en surveillance in China, bleek dat de methode 100% gevoeligheid en 99,97% specificiteit in vergelijking met de directe fluorescerende de test van het antilichaam (vet), de gouden standaardmethode die door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) en de Wereldorganisatie voor dierlijke gezondheid (OIE) wordt geadviseerd. Bovendien kan de methode ook specifiek versterken de beoogde N-gen fragment van 15 andere goedgekeurde en twee nieuwe Lyssavirus soorten in het 10e verslag van het Internationaal Comite voor de taxonomie van virussen (ICTV), zoals geëvalueerd door een na te bootsen detectie van gesynthetiseerde N de plasmiden van het gen van al lyssaviruses. De methode biedt een handig alternatief voor vet voor rabiës diagnose en is goedgekeurd als een nationale norm (GB/T36789-2018) van China.

De resultaten van genestelde RT-PCR om 18 Lyssavirus soorten te ontdekken worden getoond in Figuur 1. Alle PCR positieve controles toonden verwachte 845 BP in eerste-en 371 BP in de tweede-ronde versterking met geen band in de negatieve controle. Alle 18 lyssaviruses produceerde de verwachte 845 en/of 371 BP bands, wat aangeeft dat de geneste RT-PCR alle 18 lyssaviruses gedetecteerd. Zestien lyssaviruses plasmiden hadden efficiënte versterking in twee rondes van PCR, maar twee, namelijk Fr?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Een pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie is ontwikkeld om specifiek te detecteren alle bekende lyssaviruses. Validatie met behulp van rabiës hersenen monsters van verschillende diersoorten bleek dat deze methode een gevoeligheid en specificiteit gelijkwaardig is aan de gouden standaard fluorescerende antilichaam test en kan worden gebruikt voor routine hondsdolheid diagnose heeft.

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

De geneste RT-PCR is ontwikkeld om alle Lyssavirussen te detecteren, inclusief alle 16 ictv-goedgekeurde en twee nieuwe Lyssavirussoorten. De validatie van deze methode is bewezen door het gebruik van meer dan 9000 dierlijke hersenen specimens in 10 jaar van klinische rabiës diagnose en surveillance in China. De geneste RT-PCR kan niet alleen geloofwaardig resultaat opleveren op verse hersenweefselmonsters, maar ook op gedegradeerde monsters.De overstroming deze methode kan worden gebruikt om biologische vloeistof monsters zoals hersenvocht, speeksel en urine te testen, waardoor deze methode kan worden toegepast in ultimatum diagnoses. Om pcr-overdrachtsbesmetting te minimaliseren, is het belangrijk om negatieve en positieve controles voor te bereiden Het is echt belangrijk om stappen te zetten. Voor elke RNA-extractie moet bijvoorbeeld worden voorbereid, moeten PCR-opstelling en gelelektroforese in fysiek gescheiden gebieden worden gebruikt.Het wordt ook aanbevolen om spiraaltapes te gebruiken in RNA-extractie en omgekeerde transcriptie om besmetting met hondsdolheid aan de peptideketen te voorkomen. Een goede behandeling, zoals het voorbereiden van uw agenten op ijs, het regelmatig verwisselen van handschoenen en het gebruik van ribonucleasevrije materialen, zullen de introductie van ribonuclease voorkomen en afbraak van RNA elimineren. Om te beginnen met deze procedure, extract van de RNA uit hondsdolheid verdacht weefsel, huidbiopsieën, speeksel, hersenvocht of RABV geïnfecteerde celcultuur zoals beschreven in het tekstprotocol.Wanneer klaar om verder te gaan, verwijderde de benodigde reagentia uit de vriezer en houd ze op ijs. Zorg ervoor dat ontdooien en vortex elk reagens voor gebruik. Voor omgekeerde transcriptie van het virale RNA naar cDNA bereiden 12 micro liter reactiemix voor elk monster op ijs en een 1,5 milliliter centrifuge buis zoals beschreven in tabel 1 van het tekstprotocol in een cleanroom.Om rekening te houden met pipetting variaties, bereiden een volume van master mix ten minste een reactie grootte groter dan nodig, en vervolgens verdelen de reactie mix in 0,2 milliliter PCR buizen. Voeg in een PCR-werkstation in een sjabloonruimte acht microliters van het monster of een van de besturingselementen toe aan de reactiemix. De positieve controle is RNA gewonnen uit de celcultuur besmet met vaste RABV stam CVS11, terwijl de negatieve controle bevat Rnase-vrije dubbele gedestilleerd water.Meng de inhoud van elke buis door eerst vortexing en vervolgens door kort centrifugeren. Laad hierna de reactiebuizen in een thermocycler. Stel het cDNA-syntheseprogramma in en voer het uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Haal eerst de nodige reagentia op en houd ze op ijs in een cleanroom tot ze klaar zijn voor gebruik. Als je klaar bent, ontdooi en draaikolken de reagentia. Bereid vervolgens 48 microliter van de eerste ronde PCR-mix voor elk monster in een 1,5 milliliter centrifugebuis zoals beschreven in tabel 2 van het tekstprotocol en verdeel het reactiemengsel in 0,2 milliliter PCR-buizen.Voeg in een PCR-werkstation in een sjabloonruimte een twee microlitervoorbeeld van de cDNA toe aan de eerste ronde PCR-mix. Inclusief twee microliter van CVS11 cDNA als een positieve controle, en twee microliters van dubbel gedestilleerd water als een negatieve controle. Breng de verzegelde buizen vervolgens over naar een PCR-thermocycler en cyclus met behulp van de parameters in tabel 3 van het tekstprotocol.Om te beginnen, bereid 48 microliter van tweede ronde PCR-mix voor elk monster in een 1,5 milliliter centrifuge buis zoals beschreven in tabel 4 van het tekstprotocol en verdeel de reactie mix in 0,2 milliliter PCR buizen. Voeg twee microliters van de eerste ronde PCR product in de tweede ronde PCR mix. Neem dubbel gedestilleerd water op als negatieve controle voor deze ronde van PCR.Voer vervolgens PCR-thermocycling uit met behulp van de parameters in tabel 3 van het tekstprotocol. Voeg eerst 1,5 gram agarose toe aan 100 milliliter Tris-acetaat EDTA en verwarm het in een magnetron om het grondig op te lossen. Voeg vervolgens ethidiumbromide toe bij een uiteindelijke concentratie van 0,01%Giet de gel in de mal en laat deze minstens 30 minuten stollen bij omgevingstemperatuur.Bereid de laadmonsters voor door vijf microliter van elk PCR-product te mengen met één microliter 6x laadbuffer. Laad de monsters en geschikte DNA-marker afzonderlijk in de putten en voer de gel ongeveer 30 tot 45 minuten op 120 volt totdat de kleurstoflijn is ongeveer 75 tot 80% van de gel. Wanneer de run is voltooid, schakelt u de stroom uit en koppelt u de elektroden los van de krachtbron.Verwijder vervolgens voorzichtig de gel uit de geldoos. Gebruik een UV-gel documenteerapparaat om de DNA-fragmenten te visualiseren en te fotograferen. Karakteriseer de geneste reverse-transcriptie PCR zoals beschreven in het tekstprotocol.De resultaten van een representatieve geneste RT-PCR om 18 Lyssavirus soorten te detecteren worden hier getoond. De PCR positieve controles tonen de verwachte band op 845 basisparen in de eerste ronde versterking en op 371 basisparen voor de tweede. Geen band wordt gezien voor de negatieve controles.Alle 18 Lyssavirussen worden gezien om dezelfde twee banden als de positieve controle te produceren, wat aangeeft dat de geneste RT-PCR alle 18 Lyssavirussen heeft gedetecteerd. Terwijl 16 van de plasmiden hebben efficiënte versterking in twee rondes van PCR, twee van hen, Aravan virus en Ikoma virus, worden alleen versterkt in de eerste of tweede ronde, respectievelijk. De gevoeligheid van de methode varieert in de detectie van verschillende Lyssavirus plasmiden, van waarden variërend van 2,24 tot 2, 240 moleculen per microliter.Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan de mismatches tussen de primers en sjablonen als gevolg van virale sequentie diversiteit. Een vergelijking van 9, 624 hersenweefsels van klinische monsters die worden getest door geneste PCR versus die getest met FAT blijkt dat geneste RT-PCR als een gevoeligheid van 100%en een specificiteit van 99,97%De overeenstemming tussen de twee methoden is 99,07%Tien andere rabiës laboratoria werden uitgenodigd om de test uit te voeren om verder te valideren van de geneste RT-PCR. Alle tien laboratoria verkregen geneste RT-PCR resultaten die 100% in overeenstemming met de FAT, zonder valse negatieven of false positives, wat aangeeft dat de geneste RT-PCR heeft een hoge specificiteit en reproduceerbaarheid.RT-PCR wordt nu aanbevolen door OIE voor het gebruik van rabiës technologieën. En onze geneste RT-PCR is bewezen als de nationale standaard van rabiëstechnologieën in China in 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...