Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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L’étude a été appuyée par le plan national de recherche et de développement (Grant no 2016YFD0500401) et la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (Grant No. 31302043).

L’utilisation de souris dans ce protocole a été approuvée par le Comité administratif sur le bien-être des animaux de l’Institut de médecine vétérinaire militaire, l’Académie des sciences médicales militaires, Chine (autorisation du Comité d’utilisation et de soins des animaux de laboratoire, permis numéro JSY-DW-2010-02). Toutes les directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.
1. extraction d’ARN</...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Actuellement, le RABV est un lyssavirus majeur responsable de la quasi-totalité de la rage humaine et animale en Chine, ainsi que dans d’autres pays. En outre, une variante de l’IRKV a été identifiée pour la première fois à partir d’une chauve-sourisurina leucogaster de Mdans la province de Jilin, dans le nord-est de la Chine, en 2012, et il a été rapporté que la mort d’un chien dans la province du Liaoning était de 201711. Plus récemmen...

La rage est une maladie zoonotique mondiale causée par des virus dans le genre lyssavirus1. Les lyssavirus (famille Rhabdoviridae) sont des virus à ARN monocaténaires avec un génome d’environ 12 kb qui encode cinq protéines: N, phosphoprotéine (P), protéine matricielle (M), glycoprotéine (G), et la grande protéine ou polymérase (L). À partir des séquences nucléotidiques du gène N, de la distance génétique et des schémas antigéniques, les lyssavirus ont été divisés en 16 espèces, comprenant le virus de la rage classique (RABV) et les virus liés à la rage (RRV): le virus de la chauve-souris de Lagos (LBV), le virus Duvenhage (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), virus de la chauve-souris du Caucase occidental (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), et Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Récemment, deux lyssavirus supplémentaires ont été identifiés: kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolé de la chauve-souris de Brandt (Myotis murin) en Finlande en 20173 et Taiwan bat lyssavirus (twblv) isolé d’un Pipistrelle japonais ( Pipistrellus abramus) à Taiwan, Chine en 2016 – 20174.
Tous les mammifères sont sensibles à la rage; Cependant, aucune lésion pathognomonique brute ou aucun signe clinique spécifique ne permet son identification, et le diagnostic ne peut être effectué que dans le laboratoire5. La méthode la plus couramment utilisée pour le diagnostic de la rage est la graisse, qui est considérée comme la norme de l’or par l’OMS et l’OIE5,6. Néanmoins, le FAT peut produire des résultats peu fiables sur des échantillons de tissus cérébraux dégradés/autolysés. En outre, il ne peut pas être utilisé pour le dosage des échantillons de fluides biologiques tels que le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et l’urine, ce qui exclut largement son emploi dans le diagnostic antemortem7. Les tests diagnostiques conventionnels alternatifs, tels que le test d’infection de la culture tissulaire de la rage (RTCIT) et le test d’inoculation de la souris (MIT), nécessitent plusieurs jours6, un inconvénient majeur lorsqu’un diagnostic rapide est essentiel.
Divers tests de diagnostic moléculaire (p. ex., la détection de l’ARN viral par RT-PCR, le test d’immunosorbant PCR – enzyme-linked [PCR-ELISA], l’hybridation in situ et la PCR en temps réel) sont utilisés comme techniques rapides et sensibles pour le diagnostic de la rage8. La RT-PCR est maintenant recommandée par l’OIE pour le diagnostic de routine de la rage, et une PCR heminested (HN) est décrite dans le manuel des tests diagnostiques et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE pour détecter tous les lyssavirus5. Ici, nous décrivons un pan-lyssavirus imbriqué RT-PCR, qui permet la détection spécifique et sensible de l’ensemble des 18 espèces de lyssavirus comparables ou supérieures à celle obtenue par la graisse. Le principe de la méthode est un RT de l’ARN cible (région conservée du gène du lyssavirus N) dans l’ADNc, suivi de l’amplification de l’ADNc par deux cycles de PCR. L’ADNc subit la PCR de première ronde avec des amorces externes pour amplifier un fragment de BP de 845; Ensuite, la PCR de deuxième cycle utilise le premier produit d’ACP comme modèle pour amplifier un fragment de BP 371 avec des amorces internes. Les deux cycles de PCR augmentent significativement la sensibilité du dosage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Pour détecter le virus de la rage et d’autres espèces membres du genre lyssavirus au sein de la famille des Rhabdoviridae, la réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-LYSSAVIRUS (RT-PCR imbriquée) a été développée pour détecter la région conservée du gène nucléoprotéique (N) des lyssavirus. La méthode applique la transcription inversée (RT) en utilisant l’ARN viral comme modèle et oligo (DT)15 et les hexamères aléatoires comme amorces pour synthétiser l’ADN complémentaire viral (CDNA). Ensuite, l’ADNc viral est utilisé comme un modèle pour amplifier un fragment de gène de BP N de 845 dans la PCR de première ronde utilisant des amorces externes, suivi par la PCR imbriquée de deuxième ronde pour amplifier le fragment final de BP de 371 utilisant des amorces internes. Cette méthode peut détecter différents clades génétiques des virus de la rage (RABV). La validation, en utilisant 9 624 échantillons de cerveau de huit espèces animales domestiques dans 10 ans de diagnostics cliniques de rage et de surveillance en Chine, a montré que la méthode a 100% de sensibilité et 99,97% de spécificité par rapport à la fluorescence directe test d’anticorps (FAT), la méthode étalon-or recommandée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE). En outre, la méthode pourrait également amplifier spécifiquement le fragment de gène N ciblé de 15 autres espèces de lyssavirus approuvées et deux nouvelles, dans le 10e rapport du Comité international sur la taxonomie des virus (ICTV), tel qu’évalué par une détection mimique de N plasmides génétiques de tous les lyssavirus. La méthode fournit une alternative pratique au FAT pour le diagnostic de la rage et a été approuvée en tant que norme nationale (GB/T36789) de la Chine.

Les résultats de la RT-PCR imbriquée pour détecter 18 espèces de lyssavirus sont présentés dans la figure 1. Tous les contrôles positifs de PCR ont montré les 845 BP attendus dans le premier et le 371 BP dans les amplifications de deuxième cycle sans bande dans le contrôle négatif. Tous les 18 lyssavirus ont produit les bandes de 845 et/ou de 371 BP attendues, ce qui indique que la RT-PCR imbriquée a détecté tous les 18 lyssavirus. Seize plasmides de lyssavirus avaient une ampl...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-lyssavirus a été développée pour détecter spécifiquement tous les lyssavirus connus. La validation à l’aide d’échantillons de cerveau de la rage de différentes espèces animales a montré que cette méthode a une sensibilité et une spécificité équivalentes au test d’anticorps fluorescent étalon-or et pourrait être utilisée pour le diagnostic systématique de la rage.

Évaluation d’une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée universelle pour la détection des lyssavirus

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Le RT-PCR imbriqué a été développé pour détecter tous les lyssavirus, y compris les 16 espèces approuvées par l’ICTV et deux nouvelles espèces de Lyssavirus. La validation de cette méthode a été prouvée en utilisant plus de 9000 spécimens de cerveau animal en 10 ans de diagnostic clinique de rage et de surveillance en Chine. Le RT-PCR imbriqué peut non seulement produire des résultats crédibles sur des échantillons de tissus cérébraux frais, mais aussi sur des échantillons dégradés.L’inondation de cette méthode peut être utilisée pour assayer des spécimens de liquide biologique tels que le liquide céphalo-rachidien, la salive et l’urine, de sorte que cette méthode peut être appliquée dans les diagnostics ultimatum. Afin de minimiser la contamination par le report du PCR, il est important de préparer des contrôles négatifs et positifs Il est vraiment important de prendre des mesures. Par exemple, pour chaque extraction d’ARN a besoin de préparation, PCR mis en place, et l’électrophoresis gel doit être exploité dans des zones physiquement séparées.Il est également recommandé d’utiliser des bandes spirales dans l’extraction de l’ARN et la transcription inverse afin de prévenir la contamination par la rage à la chaîne peptidique. Une manipulation adéquate, comme la préparation de vos agents sur la glace, le changement régulier de gants et l’utilisation de matériaux exempts de ribonuclease, empêchera l’introduction de la ribonucléase et éliminera la dégradation de l’ARN. Pour commencer cette procédure, extraire l’ARN du tissu suspecté de rage, biopsies de peau, salive, fluide céphalo-rachidien ou culture cellulaire infectée par RABV comme décrit dans le protocole de texte.Lorsqu’ils sont prêts à aller de l’avant, retirer les réacoleurs nécessaires du congélateur et les garder sur la glace. Assurez-vous de décongeler et vortex chaque reagent avant utilisation. Pour la transcription inversée de l’ARN viral à l’ADNC, préparez 12 micro litres de mélange de réaction pour chaque échantillon sur glace et un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le tableau 1 du protocole de texte dans une salle blanche.Pour tenir compte des variations de pipetage, préparez un volume de mélange principal d’au moins une taille de réaction supérieure aux besoins, puis divisez le mélange de réaction en tubes PCR de 0,2 millilitre. Dans un poste de travail PCR dans une salle de modèle, ajouter huit microlitres de l’échantillon ou l’un des contrôles au mélange de réaction. Le contrôle positif est l’ARN extrait de la culture cellulaire infectée par la souche CVS11 à RABV fixe, tandis que le contrôle négatif contient de l’eau distillée double sans arnse.Mélanger le contenu de chaque tube en vortexant d’abord, puis en centrifugant brièvement. Après cela, charger les tubes de réaction dans un thermocycler. Configurer et exécuter le programme de synthèse de l’ADND tel qu’il est décrit dans le protocole texte.Tout d’abord, récupérez les reagents nécessaires et gardez-les sur la glace dans une salle blanche jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Une fois prêts, décongeler et vortex les reagents. Ensuite, préparez 48 microlitres de mélange PCR de premier tour pour chaque échantillon dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le tableau 2 du protocole de texte et divisez le mélange de réaction en tubes PCR de 0,2 millilitre.Dans un poste de travail PCR dans une salle de modèle, ajouter un échantillon de deux microlitres de l’ADND dans le mélange PCR premier tour. Inclure deux microlitres de CVS11 cDNA comme un contrôle positif, et deux microlitres d’eau distillée double comme un contrôle négatif. Ensuite, transférez les tubes scellés dans un thermocycleur PCR et cycle en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 3 du protocole de texte.Pour commencer, préparez 48 microlitres de mélange PCR de deuxième tour pour chaque échantillon dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le tableau 4 du protocole de texte et divisez le mélange de réaction en tubes PCR de 0,2 millilitre. Ajoutez deux microlitres du produit PCR de premier tour dans le mélange PCR de deuxième tour. Inclure l’eau distillée double comme un contrôle négatif pour ce tour de PCR.Effectuez ensuite le thermocyclisme PCR à l’aide des paramètres énumérés dans le tableau 3 du protocole texte. Tout d’abord, ajouter 1,5 grammes d’agarose à 100 millilitres de Tris-acétate EDTA et le chauffer dans un four à micro-ondes pour le dissoudre complètement. Ensuite, ajouter le bromure d’éthidium à une concentration finale de 0,01%Verser le gel dans le moule et le laisser solidifier à température ambiante pendant au moins 30 minutes.Préparer les échantillons de chargement en mélangeant cinq microlitres de chaque produit PCR avec un microlitre de tampon de chargement 6x. Chargez séparément les échantillons et le marqueur d’ADN approprié dans les puits et exécutez le gel pendant environ 30 à 45 minutes à 120 volts jusqu’à ce que la ligne de colorant soit approximativement 75 à 80% vers le bas du gel. Lorsque la course est terminée, éteignez l’alimentation et déconnectez les électrodes de la source d’énergie.Ensuite, retirez soigneusement le gel de la boîte de gel. Utilisez un dispositif de documentation de gel UV pour visualiser et photographier les fragments d’ADN. Caractérisez le PCR à transcription inversée imbriqué tel qu’il est décrit dans le protocole de texte.Les résultats d’un représentant imbriqué RT-PCR pour détecter 18 espèces de Lyssavirus est montré ici. Les contrôles positifs PCR montrent la bande attendue à 845 paires de base dans l’amplification du premier tour et à 371 paires de base pour le second. Aucune bande n’est vue pour les contrôles négatifs.Les 18 lyssavirus produisent les deux mêmes bandes que le contrôle positif, ce qui indique que le RT-PCR imbriqué a détecté les 18 Lyssavirus. Alors que 16 des plasmides ont une amplification efficace en deux tours de PCR, deux d’entre eux, le virus Aravan et le virus Ikoma, ne sont amplifiés que dans le premier ou le deuxième tour, respectivement. La sensibilité de la méthode varie dans la détection de différents plasmides lyssavirus, des valeurs allant de 2,24 à 2, 240 molécules par microlitre.Ces différences peuvent être attribuées aux inadéquations entre les amorces et les modèles en raison de la diversité des séquences virales. Une comparaison de 9 624 tissus cérébraux provenant de spécimens cliniques testés par PCR imbriqué par rapport à ceux testés avec fat montre que rt-PCR imbriqué comme une sensibilité de 100% et une spécificité de 99,97%La conformité entre les deux méthodes est de 99,07%Dix autres laboratoires de rage ont été invités à effectuer le test pour valider davantage le RT-PCR imbriqué. Les dix laboratoires ont obtenu des résultats rt-PCR imbriqués qui sont 100% conformes à la FAT, sans faux négatifs ou faux positifs, ce qui indique que le RT-PCR imbriqué a une grande spécificité et reproductibilité.Rt-PCR est maintenant recommandé par l’OIE pour l’utilisation des technologies de la rage. Et notre RT-PCR imbriqué a été prouvé comme la norme nationale des technologies de rage en Chine en 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

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An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Recherche

Génétique

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Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Détection semi-quantitative de l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante de protéine de Transcriptase inverse de la télomérase humaine

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR induite par la réorganisation de la Structure de la chromatine boucle

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Essais de Transcription-boucle-négociée l’Amplification isotherme (RT-lampe) pour Virus Zika et gènes domestiques dans l’Urine, sérum et des échantillons de moustiques réverse

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...