Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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Die Studie wurde durch den National Key Research and Development Plan (Grant Nr. 2016YFD0500401) und die National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 31302043) unterstützt.

Die Verwendung von Mäusen in diesem Protokoll wurde durch den Verwaltungsausschuss für Tierschutz des Instituts für Militärmedizin, Akademie der Militärmedizinischen Wissenschaften, China (Labortierpflege und Nutzung des Ausschusses Genehmigung, Genehmigung genehmigt Nummer JSY-DW-2010-02). Alle institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren wurden befolgt.
1. RNA-Extraktion
<ol><li>Extrahieren Sie RNA aus rabiaten Hirngewebe, Hautbiopsien, Sp...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Derzeit ist RABV ein großes Lyssavirus, das für fast alle Menschen-und TiertRAB-Tollwut in China sowie in anderen Ländern verantwortlich ist. Zudem wurde erstmals eine IRKV-Variante von einem Murina leucogaster Fledermaus in der Provinz Jilin im Nordosten Chinas im Jahr 201210identifiziert, und es wurde berichtet, dass es in der Provinz Liaoning 2017 11Uhrden Tod eines Hundes verursacht. Zuletzt war auch ein neuartiges Lyssavirus, TWBLV, von einer japan...

Tollwut ist eine weltweite Zoonos-Krankheit, die durch Viren innerhalb der Gattung Lyssavirus 1 verursachtwird. Lyssaviren (Familie Rhabdoviridae) sind einfallslose RNA-Viren mit einem etwa 12 kb-Genom, das fünf Proteine kodiert: N, Phosphoprotein (P), Matrix-Protein (M), Glykoprotein (G) und das große Protein oder Polymerase (L). Basierend auf Nukleotidsequenzen des N-Gens, der genetischen Distanz und der antigenen Muster wurden die Lyssaviren in 16 Arten unterteilt, die das klassische Tollwut-Virus (RABV) und die Tollwutviren (RRV) umfassen: Lagos-Batt-Virus (LBV), Duvenhage-Virus (DUVV) ), Mokola-Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australische Fledermaus lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand-Virus (KHUV), Westkaukasischer Fledermau-Virus (WCBV), Shimoni-Bmeldchen-Virus (SHIBV), und Lleida Fledermaus Lyssavirus (LLEBV)2. In jüngster Zeit wurden zwei zusätzliche Lyssaviren identifiziert: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) von einer Brandt-Fledermaus (Myotis brandtii)in Finnland im Jahr 2017 3 und Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) von einer japanischen Pipistrelle isoliert ( Pipistrellus abramus) in Taiwan, China 2016– 2017 4.
Alle Säugetiere sind anfällig für Tollwut; Allerdings erlauben keine groben pathognomonischen Läsionen oder spezifische klinische Anzeichen ihre Identifizierung, und die Diagnose kann nur im Labor5erfolgen. Die am weitesten verbreitete Methode zur Tollwutdiagnose ist die FAT, die sowohl von der WHO als auch von der OIE5,6 alsGoldstandardangesehenwird. Dennoch kann der FAT unzuverlässige Ergebnisse bei degradided/autolysierten Hirngewebsproben liefern. Darüber hinaus kann es nicht verwendet werden, um biologische Flüssigkeitsprobe wie Hirnspinalflüssigkeit (CSF), Speichel und Urin zu unterlassen, wodurch die Verwendung in der antemortem-Diagnose 7 weitgehendausgeschlossen wird. Alternative konventionelle diagnostische Tests, wie der Tollwut-Gewebekultur-Infektionstest (RTCIT) und der Maus-Impfung (MIT), erfordern mehrere Tage6, ein großer Nachteil, wenn eine schnelle Diagnose unerlässlich ist.
Verschiedene molekulare Diagnosetests (z.B. der Nachweis der viralen RNA durch RT-PCR, der PCR – Enzym-verknüpfte immunsorsorbierte Assay [PCR-ELISA], In-situ-Hybridisierung und Echtzeit-PCR) werden alsschnelle und sensible Techniken für die Tollwettung eingesetzt 8. RT-PCR wird jetzt von OIE für die routinemäßige Tollwutdiagnose empfohlen, und eine heminachente (hn) PCR wird im OIE-Handbuch für Diagnostiktests und Impfstoffe für terrestrische Tierebeschrieben, um alle Lyssaviren 5 zu erkennen. Hier beschreiben wir ein pan-Lyssavirus verschachtelten RT-PCR, das die spezifische und sensible Erkennung aller 18 Lyssavirus-Arten ermöglicht, die mit der FAT vergleichbar sind oder sie übertreffen. Das Prinzip der Methode ist ein RT der Ziel-RNA (konservierte Region des Lyssavirus N-Gens) in cDNA, gefolgt von der Verstärkung der cDNA um zwei Runden PCR. Die cDNA unterzieht sich der ersten Runde PCR mit äußeren Primern, um ein 845 bp-Fragment zu verstärken; Die Second-round-PRR verwendet dann das PCR-Produkt der ersten Runde als Vorlage, um ein 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Die beiden PCR-Runden erhöhen die Empfindlichkeit des Tests deutlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Um Tollwut-Virus und andere Mitgliedsarten der Gattung Lyssavirus in der Familie Rhabdoviridaezu erkennen, wurde das Pan-Lysavirus verschachtelte Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion (verschachteltes RT-PCR) entwickelt, um die konservierte Region zu erkennen Das Nucleoprotein (N) Gen der Lyssaviren. Die Methode wendet die umgekehrte Transkription (RT) an, wobei virale RNAals Schablone und Oligo (dT) 15 und zufällige Hexamer als Primer verwendet werden, um die virale Komplementär-DNA (cDNA) zu synthetisieren. Dann wird die virale cDNA als Vorlage verwendet, um ein 845 bp N-Gen-Fragment in der ersten Runde PCR mit äußeren Primern zu verstärken, gefolgt von Zweitrunden-verschachteltem PCR, um das endgültige 371 bp-Fragment mit inneren Primern zu verstärken. Diese Methode kann verschiedene genetische Ketten von Tollwut-Viren (RABV) erkennen. Die Validierung, mit 9.624 Hirnproben von acht heimischen Tierarten in 10 Jahren klinischer Tollwut-Diagnosen und Überwachung in China, zeigte, dass die Methode 100% Empfindlichkeit und 99,97% Spezifität im Vergleich zu den direkten Fluoreszenzerkrankungen hat Antikörpertest (FAT), die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) empfohlene Goldstandard-Methode. Darüber hinaus könnte die Methode auch das gezielte N-Gen-Fragment von 15 anderen zugelassenen und zwei neuartigen Lyssavirus-Arten im 10. Bericht des Internationalen Komitees für die Besteuerung von Viren (ICTV), wie durch eine mimische Erkennung von synthetisierten N Gen-Plasmide aller Lyssaviren. Das Verfahren bietet eine bequeme Alternative zu FAT für die Tollwutdiagnose und ist als National Standard (GB/T36789-2018) von China zugelassen.

Die Ergebnisse der verschachtelten RT-PCR zur Erkennung von 18 Lyssavirus-Arten werden in Abbildung1 gezeigt. Alle PCR-positiven Steuerungen zeigten die zu erwartenden 845 bp in der ersten und 371 bp in den Zweitrundenverstärkungen ohne Band in der Negativsteuerung. Alle 18 Lyssaviren produzierten die erwarteten 845 and/oder 371 bp-Bands, was darauf hindeutet, dass die verschachtelten RT-PCR alle 18 lyssaviren entdeckt haben. Sechzehn Lyssaviruses Plasmide hatten eine effiziente Verstärkun...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Ein Pan-Lysavirus verschachtete Umkehr-Transkription Polymerase-Kettenreaktion wurde entwickelt, um speziell alle bekannten Lyssaviren zu erkennen. Die Validierung mit Tollwut-Hörnproben verschiedener Tierarten ergab, dass diese Methode eine Empfindlichkeit und Spezifität hat, die dem Gold-Standard-Fluoreszenz-Antikörper-Test entspricht und für die routinemäßige Tollwutdiagnostik verwendet werden könnte.

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Die verschachtelte RT-PCR wurde entwickelt, um alle Lyssaviren zu erkennen, einschließlich aller 16 ICTV-zugelassenen und zwei neuartigen Lyssavirus-Arten. Die Validierung dieser Methode wurde durch die Verwendung von über 9000 Tierhirnproben in 10 Jahren klinischer Tollwutdiagnose und -überwachung in China nachgewiesen. Die verschachtelte RT-PCR kann nicht nur glaubwürdige Ergebnisse bei frischen Hirngewebeproben, sondern auch bei degradierten Proben liefern.Die Überflutung dieser Methode kann verwendet werden, um biologische Flüssigkeitsproben wie Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel und Urin zu assayen, wodurch diese Methode in Ultimatum-Diagnosen angewendet werden kann. Um PCR-Übertragung Kontamination zu minimieren, ist es wichtig, negative und positive Kontrollen vorzubereiten Es ist wirklich wichtig, Schritte zu ergreifen. Beispielsweise sollten für jede RNA-ExtraktionVorbereitung, PCR-Einrichtung und Gelelektrophorese in physikalisch getrennten Bereichen betrieben werden.Es wird auch empfohlen, Spiralbänder in der RNA-Extraktion und Reverse-Transkription zu verwenden, um eine Tollwutkontamination der Peptidkette zu verhindern. Die richtige Handhabung wie die Vorbereitung Ihrer Agenten auf Eis, das regelmäßige Wechseln der Handschuhe und die Verwendung von ribonuzleasefreien Materialien verhindern die Einführung von Ribonuklease und eliminiert den Abbau der RNA. Um dieses Verfahren zu beginnen, extrahieren Sie die RNA aus Tollwut vermutetgewebe, Hautbiopsien, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit oder RABV infizierte Zellkultur, wie im Textprotokoll beschrieben.Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, entfernen Sie die benötigten Reagenzien aus dem Gefrierschrank und halten Sie sie auf Eis. Achten Sie darauf, jedes Reagenz vor der Anwendung aufzutauen und zu wirbeln. Für die umgekehrte Transkription der viralen RNA zu cDNA bereiten 12 Mikroliter Reaktionsmischung für jede Probe auf Eis und eine 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls in einem Reinraum beschrieben.Um Pipettierschwankungen Rechnung zu tragen, bereiten Sie ein Volumen der Mastermischung mindestens eine Reaktionsgröße vor, die größer als erforderlich ist, und teilen Sie dann den Reaktionsmix in 0,2 Milliliter PCR-Röhren auf. Fügen Sie in einer PCR-Workstation in einem Vorlagenraum acht Mikroliter der Probe oder eines der Steuerelemente zum Reaktionsmix hinzu. Die positive Kontrolle ist RNA, die aus der Zellkultur extrahiert wird, die mit dem festen RABV-Stamm CVS11 infiziert ist, während die Negative Kontrolle Rnase-freies doppeldestilliertes Wasser enthält.Mischen Sie den Inhalt der einzelnen Rohre durch erste Wirbel und dann durch kurzzentrifugieren. Danach die Reaktionsrohre in einen Thermocycler laden. Richten Sie das cDNA-Syntheseprogramm wie im Textprotokoll beschrieben ein und führen Sie es aus.Holen Sie zunächst die notwendigen Reagenzien ab und halten Sie sie in einem Reinraum auf Eis, bis sie einsatzbereit sind. Wenn sie fertig sind, tauen und wirbeln Sie die Reagenzien aus. Als nächstes bereiten Sie 48 Mikroliter der ersten Runde PCR-Mischung für jede Probe in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben und teilen Sie den Reaktionsmix in 0,2 Milliliter PCR-Röhren.Fügen Sie in einer PCR-Workstation in einem Vorlagenraum eine Zwei-Mikroliter-Probe der cDNA in den ersten PCR-Mix ein. Fügen Sie zwei Mikroliter CVS11 cDNA als Positivkontrolle und zwei Mikroliter doppelt destilliertes Wasser als Negativkontrolle ein. Übertragen Sie dann die versiegelten Rohre in einen PCR-Thermocycler und fahren Sie mit den in Tabelle 3 des Textprotokolls aufgeführten Parametern.Zunächst 48 Mikroliter der zweiten Runde PCR-Mischung für jede Probe in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, wie in Tabelle 4 des Textprotokolls beschrieben vorbereitet und teilen Sie den Reaktionsmix in 0,2 Milliliter PCR-Röhren auf. Fügen Sie zwei Mikroliter des ersten Runden-PCR-Produkts in den zweiten PCR-Mix ein. Doppeldestilliertes Wasser als Negativkontrolle für diese PCR-Runde einbeziehen.Führen Sie dann PCR-Thermocycling mit den in Tabelle 3 des Textprotokolls aufgeführten Parametern durch. Zuerst 1,5 Gramm Agarose zu 100 Milliliter Nissacetat EDTA hinzufügen und in einer Mikrowelle erhitzen, um es gründlich aufzulösen. Als nächstes fügen Sie Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,01%Gießen Sie das Gel in die Form und lassen Sie es bei Umgebungstemperatur für mindestens 30 Minuten erstarren.Bereiten Sie die Ladeproben vor, indem Sie fünf Mikroliter jedes PCR-Produkts mit einem Mikroliter 6x Ladepuffer mischen. Die Proben und den geeigneten DNA-Marker separat in die Brunnen laden und das Gel ca. 30 bis 45 Minuten bei 120 Volt laufen lassen, bis die Färbelinie etwa 75 bis 80 % des Gels beträgt. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und trennen Sie die Elektroden von der Stromquelle.Dann entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Gelbox. Verwenden Sie ein UV-Gel-Dokumentationsgerät, um die DNA-Fragmente zu visualisieren und zu fotografieren. Charakterisieren Sie die verschachtelte Reverse-Transkriptions-PCR, wie im Textprotokoll beschrieben.Die Ergebnisse einer repräsentativen verschachtelten RT-PCR zum Nachweis von 18 Lyssavirus-Arten werden hier gezeigt. Die PCR-Positivsteuerungen zeigen das erwartete Band bei 845 Basenpaaren in der ersten Runde und bei 371 Basenpaaren für die zweite. Für die Negativkontrollen wird kein Band gesehen.Alle 18 Lyssaviren produzieren die gleichen zwei Bänder wie die Positivkontrolle, was darauf hindeutet, dass die verschachtelte RT-PCR alle 18 Lyssaviren nachgewiesen hat. Während 16 der Plasmide eine effiziente Amplifikation in zwei Runden PCR haben, werden zwei von ihnen, das Aravan-Virus und das Ikoma-Virus, nur in der ersten bzw. zweiten Runde verstärkt. Die Empfindlichkeit der Methode variiert beim Nachweis verschiedener Lyssavirus-Plasmide, von Werten von 2,24 bis 2, 240 Moleküle pro Mikroliter.Diese Unterschiede lassen sich auf die Diskrepanzen zwischen den Primern und Vorlagen aufgrund der Viralsequenzvielfalt zurückführen. Ein Vergleich von 9, 624 Hirngeweben aus klinischen Proben, die mit verschachtelter PCR getestet werden, mit denen, die mit FAT getestet wurden, zeigt, dass verschachtelte RT-PCR als Empfindlichkeit von 100% und eine Spezifität von 99,97% Die Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden ist 99,07%Zehn andere Tollwutlaboratorien wurden eingeladen, den Test durchzuführen, um die verschachtelte RT-PCR weiter zu validieren. Alle zehn Laboratorien erhielten verschachtelte RT-PCR-Ergebnisse, die 100% in Übereinstimmung mit der FAT sind, ohne falsche Negative oder falsche Positivwerte, was darauf hindeutet, dass die verschachtelte RT-PCR eine hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit hat.RT-PCR wird jetzt von OIE für den Einsatz von Tollwuttechnologien empfohlen. Und unsere verschachtelte RT-PCR hat sich 2018 in China als nationaler Standard für Tollwuttechnologien bewährt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transkription-Loop-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) Assay für Zika-Virus und Housekeeping-Gene in Urin, Serum und Moskito-Proben

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...