Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

המחקר היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (גרנט no. 2016YFD0500401) ואת הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט no. 31302043).

השימוש בעכברים בפרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המנהלית לרווחת בעלי חיים של המכון לרפואה וטרינרית צבאית, האקדמיה למדעי הרפואה הצבאית, סין (טיפול בבעלי חיים מעבדה ושימוש באישור הוועדה, היתר מספר JSY-DW-2010-02). כל ההנחיות המוסדיים והמנחים הלאומיים לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים הופעלו.
<p cla...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

כיום, RABV הוא וירוס מרכזי האחראי על כמעט כל כלבת האדם והחיה בסין, כמו גם במדינות אחרות. בנוסף, משתנה IRKV זוהה לראשונה מ- Murina leucogaster במחוז ג'ילין בצפון מזרח סין ב 201210, והיא דווחה כדי לגרום למותו של כלב במחוז ליאונינג ב 201711. לאחרונה, הרומן lyssavirus, TWBLV, זוהה גם מתוך ?...

כלבת היא מחלה zoonotic עולמית הנגרמת על ידי וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus1. Lyssaviruses (משפחה תמסשליליות) הם חד שליליים וירוסי RNA עם הגנום כ 12 kb המקודד חמישה חלבונים: N, פוספופפרוטאין (P), חלבון מטריצה (M), גליקופרוטאין (G), וחלבון גדול או פולימראז (L). מבוסס על רצפי נוקלאוטיד של N הגן, המרחק הגנטי, ודפוסי אנטיגניים, lyssaviruses חולקו 16 מינים, המורכב וירוס כלבת הקלאסי (RABV) ואת הקשורים לכלבת וירוסים (RRV): לאגוס וירוס בת (LBV), וירוס Duvenhage (DUVV ), וירוס מוקדי (מוקדי), העטלף האירופי lyssavirus 1 (EBLV-1), העטלף האירופי lyssavirus 2 (EBLV-2), העטלף האוסטרלי lyssavirus (ABLV), וירוס (ARAV), וירוס Ikoma (IKOV), Bokeloh בת lyssavirus (BBLV), בובת ליסביו וירוס (GBLV), Irkut וירוס (IRKUT), קוג'וירוס (ח'ו), וירוס עטלף קווקזי מערבי (WCBV), וירוס שמעוני בת (שימב), וליידה בת ליסביסוירוס (לואלין)2. לאחרונה, שתי lyssaviruses נוספים זוהו: Kotalahti בת lyssaviruses (KBLV) בודד מן העטלף של ברנדט (Myotisברנטי) בפינלנד ב 20173 ו-lyssaviruses ירוס בת טייוואן (twblv) מבודד pipistrellllllllllllllll Pipistrellus abramus) בטייוואן, סין בשנת 2016 – 20174.
כל היונקים רגישים לכלבת; עם זאת, לא נגעים פתוגנוניים ברוטו או שלטים קליניים ספציפיים לאפשר זיהוי שלה, ואבחון יכול להתבצע רק במעבדה5. השיטה הנפוצה ביותר לאבחון כלבת היא השומן, שנחשב לסטנדרט הזהב של האדם והשני, שניהם5,6. אף על פי כן, השומן יכול לייצר תוצאות לא מהימנות על בדיקות רקמה במוח בירידה/אוטומטית. בנוסף, לא ניתן להשתמש בו כדי לאבחן דגימות נוזלים ביולוגיים כגון נוזל שדרתי (שדרתי), רוק ושתן, ובכך מנעה במידה רבה את התעסוקה שלו באבחון הנתיחה7. בדיקות האבחון הקונבנציונליות המקובלות, כגון בדיקת הזיהום בתרבות רקמת הכלבת (RTCIT) ובדיקת החיסון לעכבר (MIT), דורשות מספר ימים6, חיסרון גדול כאשר אבחון מהיר חיוני.
בדיקות אבחון מולקולריות שונות (לדוגמה, זיהוי רנ א ויראלי על-ידי RT-PCR, התפקוד החיסוני המקושר ל-pcr, בתוך היברידיזציה, ו-PCR בזמן אמת) משמשים כטכניקות מהירות ורגישות לאבחון כלבת8. RT-PCR מומלץ כיום על ידי OIE עבור אבחון כלבת שגרתית, ו המופילו (ח נ) PCR מתואר במדריך OIE של בדיקות אבחון וחיסונים עבור חיות יבשתי כדי לזהות את כל lyssaviruses5. כאן אנו מתארים הפאן-lyssavirus מקונן RT-PCR, אשר מאפשר זיהוי ספציפי ורגיש של כל 18 lyssavirus מינים להשוות או לחרוג שהושג על ידי השומן. העיקרון של השיטה הוא RT של RNA היעד (אזור שימור של גן lyssavirus N) לתוך cDNA, ואחריו הגברה של cDNA על ידי שני סיבובים של ה-PCR. CDNA עובר את ה-PCR העגול הראשון עם התחל החיצוני כדי להגביר רסיס bp 845; לאחר מכן, ה-PCR העגול השני משתמש במוצר ה-PCR העגול הראשון כתבנית כדי להגביר רסיס של 371 bp עם התחל הפנימי. שני סיבובים של ה-PCR מגבירים באופן משמעותי את רגישות הצורה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

כדי לזהות וירוס כלבת ומינים אחרים של הסוג Lyssavirus בתוך המשפחה התמס שריר, הפאן-lyssavirus מקונן הפוך תגובת שרשרת פולימראז (מקונן RT-PCR) פותחה כדי לזהות את האזור שימור של הגנים הנואופלפרוטאין (N) של ליסביזירוסים. השיטה מחילה הפוכה שעתוק (RT) באמצעות RNA ויראלי כמו תבנית ו oligo (dT)15 ו הבוחנים אקראיים כמו התחל לסנתז את ה-DNA המשלים ויראלי (cdna). לאחר מכן, cDNA ויראלי משמש תבנית כדי להגביר 845 bp N מקטע גנים בסיבוב הראשון של ה-PCR באמצעות התחל החיצוני, ואחריו ה-PCR מקונן השני להגביר את הסופי 371 bp קטע באמצעות התחל הפנימי. שיטה זו יכולה לזהות שיטות גנטיות שונות של וירוסי כלבת (RABV). האימות, שימוש 9,624 דגימות מוח של שמונה מינים בעלי חיים ביתיים ב 10 שנים של אבחון כלבת קלינית ומעקב בסין, הראו כי השיטה יש 100% רגישות ו 99.97% ספציפיות בהשוואה עם פלורסנט ישירה מבחן נוגדן (FAT), השיטה הסטנדרטית זהב המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמי (מי) והארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE). בנוסף, השיטה יכולה במיוחד להגביר את המוקד המיועד N גן של 15 מאושרים אחרים ושני מינים lyssavirus הרומן בדוח 10 של הוועד הבינלאומי על טקסונומיה של וירוסים (ICTV) כפי שוערך על ידי זיהוי חיקוי של מסונתז . גן הפלזמה של כל הנגיפים השיטה מספקת חלופה נוחה ל-FAT עבור אבחון כלבת ואושרה כסטנדרט לאומי (GB/T36789-2018) של סין.

תוצאות של RT-PCR מקונן כדי לזהות 18 lyssavirus מינים מוצגים באיור 1. כל הפקדים החיוביים של ה-PCR הראו את התוצאה הצפויה 845 bp ב-1-ו-371 bp בהגברה השנייה של הסיבוב, ללא להקה בשליטה השלילית. כל 18 lyssaviruses הפיק 845 ו/או 371 להקות bp, המציין כי RT-PCR מקונן זיהה את כל 18 lyssaviruses. הגברה יעילה של שישה כדורים בשני ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

RT-PCR מקונן פותחה כדי לזהות את כל Lyssaviruses, כולל כל 16 ICTV שאושרו ושני מינים Lyssavirus הרומן. האימות של שיטה זו הוכח באמצעות מעל 9000 דגימות מוח בעלי חיים ב 10 שנים של אבחון כלבת קלינית ומעקב בסין. RT-PCR המקונן לא רק יכול לייצר תוצאה אמינה על דגימות רקמת המוח טרי, אלא גם על דגימות מושפלות.ה ההצפה שיטה זו יכולה לשמש כדי להתבגר דגימות נוזל ביולוגי כגון נוזל השדרתי, רוק, שתן, ובכך שיטה זו יכולה להיות מיושמת לתוך אבחנות אולטימטום. על מנת למזער את זיהום נשיאת PCR, חשוב להכין פקדים שליליים וחיוביים חשוב מאוד לנקוט צעדים. לדוגמה, עבור כל מיצוי RNA צריך הכנה, PCR להגדיר, אלקטרופורזה ג'ל צריך להיות מופעל באזורים נפרדים פיזית.מומלץ גם להשתמש בקלטות ספירלה בחילוץ RNA ותמלול הפוך על מנת למנוע זיהום כלבת לשרשרת הפפטיד. טיפול נכון כגון הכנת הסוכנים שלך על קרח, החלפת כפפות באופן קבוע, ושימוש בחומרים חופשיים ribonuclease ימנע את כניסתה של ריבונוקלאז ולמנוע השפלה של RNA. כדי להתחיל בהליך זה, לחלץ את RNA מכלבת חשד רקמה, ביופסיות העור, רוק, נוזל השדרתי או תרבות תאים נגועים RABV כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כאשר מוכן להמשיך, הסיר את reagents הדרושים מהמקפיא ולשמור אותם על קרח. הקפד להפשיר ולמערבולת כל רהגנט לפני השימוש. עבור שעתוק הפוך של RNA ויראלי cDNA להכין 12 מיקרו ליטרים של תערובת תגובה עבור כל מדגם על קרח צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה 1 של פרוטוקול הטקסט בחדר נקי.כדי להסביר וריאציות pipetting, להכין נפח של תמהיל הורים לפחות גודל תגובה אחד גדול מהנדרשה, ולאחר מכן לחלק את תערובת התגובה לתוך צינורות PCR 0.2 מיליליטר. בתחנת עבודה של PCR בחדר תבניות, הוסף שמונה מיקרוליטרים של המדגם או אחד הפקדים לתערובת התגובות. השליטה החיובית היא RNA המופק מתרבות התאים הנגועים בזן קבוע-RABV CVS11, בעוד שהבקרה השלילית מכילה מים מזוקקים כפולים ללא Rnase.מערבבים את התוכן של כל צינור על ידי מערבולת תחילה ולאחר מכן על ידי צנטריפוגה בקצרה. לאחר מכן, לטעון את צינורות התגובה לתוך תרמוסיקלר. הגדר והפעל את תוכנית הסינתזה cDNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.ראשית, לאחזר את reagents הדרושים ולשמור אותם על קרח בחדר נקי עד מוכן לשימוש. כאשר מוכן, להפשיר ומערבולת את reagents. לאחר מכן, הכן 48 מיקרוליטרים של תערובת PCR בסיבוב הראשון עבור כל מדגם בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט ולחלק את תערובת התגובה לצינורות PCR 0.2 מיליליטר.בתחנת עבודה PCR בחדר תבנית, להוסיף מדגם שני microliter של cDNA לתערובת PCR הסיבוב הראשון. כלול שני מיקרוליטרים של CVS11 cDNA כבקרה חיובית, ושני מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים כבקרה שלילית. לאחר מכן, העבר את הצינורות האטומים לתוך תרמוסיקלר PCR ומחזור באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3 של פרוטוקול הטקסט.כדי להתחיל, להכין 48 microliters של תערובת PCR בסיבוב השני עבור כל מדגם בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה 4 של פרוטוקול הטקסט ולחלק את תערובת התגובה לתוך צינורות PCR 0.2 מיליליטר. הוסף שני מיקרוליטרים של מוצר PCR בסיבוב הראשון לתערובת PCR בסיבוב השני. כלול מים מזוקקים כפולים כפקד שלילי עבור סבב PCR זה.לאחר מכן, בצע תרמוציליות PCR באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3 של פרוטוקול הטקסט. ראשית, מוסיפים 1.5 גרם של אגרוז ל -100 מיליליטר של טריס אצטט EDTA ומחממים אותו במיקרוגל כדי להמיס אותו ביסודיות. לאחר מכן, מוסיפים אתידיום ברומיד בריכוז סופי של 0.01% יוצקים את הג'ל לתבנית ומשאירים אותו להתגבש בטמפרטורת הסביבה לפחות 30 דקות.הכן את דגימות הטעינה על-ידי ערבוב חמישה מיקרוליטרים של כל מוצר PCR עם מיקרוליטר אחד של מאגר טעינה של 6x. בנפרד לטעון את הדגימות ואת סמן DNA מתאים לתוך הבאר ולהפעיל את הג'ל במשך כ 30 עד 45 דקות ב 120 וולט עד קו הצבע הוא כ 75 עד 80% במורד הג'ל. לאחר השלמת הריצה, כבה את החשמל ונתק את האלקטרודות ממקור הכוח.לאחר מכן, להסיר בזהירות את הג'ל מתיבת הג'ל. השתמשו במכשיר תיעוד של ג'ל UV כדי לדמיין ולצלם את שברי הדנ"א. איפיין את PCR התמלול ההפוך המקונן כמפורט בפרוטוקול הטקסט.התוצאות של RT-PCR מקונן נציג כדי לזהות 18 מינים Lyssavirus מוצג כאן. הפקדים החיוביים של PCR מציגים את הרצועה הצפויה ב-845 זוגות בסיסים בהגברה בסיבוב הראשון וב-371 זוגות בסיסים לסיבוב השני. אף להקה לא נראית עבור הפקדים השליליים.כל 18 Lyssaviruses נראים לייצר את אותן שתי להקות כמו השליטה החיובית, המציין כי RT-PCR מקונן זיהה את כל 18 Lyssaviruses. בעוד 16 של plasmids יש הגברה יעילה בשני סיבובים של PCR, שניים מהם, וירוס Aravan ווירוס Ikoma, מוגברים רק בסיבוב הראשון או השני, בהתאמה. הרגישות של השיטה משתנה בזיהוי פלסמידים שונים של Lyssavirus, החל ערכים הנעים בין 2.24 ל 2, 240 מולקולות לכל microliter.הבדלים אלה ניתן לייחס את אי התאמות בין פריימרים ותבניות בשל מגוון רצף ויראלי. השוואה של 9, 624 רקמות המוח של דגימות קליניות שנבדקו על ידי PCR מקונן לעומת אלה שנבדקו עם FAT מראה כי RT-PCR מקונן כרגישות של 100%ו ספציפיות של 99.97%בהתאם בין שתי השיטות הוא 99.07%10 מעבדות כלבת אחרות הוזמנו לבצע את הבדיקה כדי לאמת עוד יותר את RT-PCR המקונן. כל עשר המעבדות השיגו תוצאות RT-PCR מקוננות כי הם 100% בהתאם FAT, ללא תשלילים כוזבים או תוצאות חיוביות שגויות, המציין כי RT-PCR מקונן יש ספציפיות גבוהה רבייה.RT-PCR מומלץ כעת על ידי OIE לשימוש בטכנולוגיות כלבת. ו- RT-PCR המקונן שלנו הוכח כסטנדרט הלאומי של טכנולוגיות כלבת בסין בשנת 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...