Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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इस अध्ययन को राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास योजना (ग्रांट नंबर 2016YFD0500401) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान प्रतिष्ठान (ग्रांट नंबर ३१३०२०४३) द्वारा समर्थित किया गया था ।

इस प्रोटोकॉल में चूहों का उपयोग सैन्य पशु चिकित्सा संस्थान के पशु कल्याण पर प्रशासनिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, सैन्य चिकित्सा विज्ञान अकादमी, चीन (प्रयोगशाला पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रा?...

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	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

वर्तमान में, RABV एक प्रमुख lyssavirus लगभग सभी मानव और चीन में पशु रेबीज के लिए जिंमेदार है, साथ ही साथ अंय देशों में है । इसके अलावा, एक irkv संस्करण पहले २०१२10में पूर्वोत्तर चीन में जिलीन प्रांत में एक एम...

रेबीज एक दुनिया भर में जूनोटिक जीनस lyssavirus1के भीतर वायरस की वजह से रोग है । Lyssaवायरस (परिवार रैब्डोविरिडी) एक लगभग 12 केबी जीनोम के साथ एक नकारात्मक-फंसे आरएनए वायरस हैं जो पाँच प्रोटीनों को एनकोड करते हैं: एन, फ़ॉफाफोप्रोटीन (पी), मैट्रिक्स प्रोटीन (एम), ग्लाइकोप्रोटीन (जी), और बड़े प्रोटीन या पॉलीमेरेज (एल) । N जीन, आनुवंशिक दूरी, और प्रतिजनी पैटर्न के न्यूकोटाइड दृश्यों के आधार पर, lyssaवायरसों को 16 प्रजातियों में बांटा गया है, जिनमें क्लासिकल रेबीज वायरस (RABV) और रेबीज से संबंधित वायरस (RRV): लागोस बैट वायरस (LBV), ड्यूवेर्हाज वायरस (DUVV) ), मोकोला वायरस (MOKV), यूरोपीय चमगादड़ lyssavirus 1 (EBLV-1), यूरोपीय चमगादड़ lyssavirus 2 (EBLV-2), ऑस्ट्रेलियाई चमगादड़ lyssavirus (ABLV), Aravan वायरस (ARAVAN), Ikoma वायरस (IKOV), बोकेलोह चमगादड़ lyssavirus (BBLV), गंनोरुवा चमगादड़ lyssavirus (GBLV), Irkut वायरस (IRKUT), खुजव वायरस (खुव), वेस्ट केशियन बैट वायरस (डब्ल्यूसीबीवी), शिरोनी बैट वायरस (शिबीवी), और ललीदा बैट लायसवायरस (एलईवीबीवी)2। हाल ही में, दो अतिरिक्त lyssaवायरसों की पहचान की गई है: Kotalahti चमगादड़ lyssaviruses (KBLV) फिनलैंड में एक Brandt चमगादड़ से अलग (Myotis brandt) २०१७ में3 और ताइवान चमगादड़ LYSSAVIRUSES (Twblv) एक जापानी pipistrelle से अलग ( (2) 2016-20174में ताइवान, चीन में ।
सभी स्तनधारियों को रेबीज होने की संभावना होती है; हालांकि, कोई सकल रोगविज्ञान घावों या विशिष्ट नैदानिक संकेत इसकी पहचान की अनुमति है, और निदान केवल प्रयोगशाला5में किया जा सकता है । रेबीज निदान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि वसा, जो दोनों और oie5,6द्वारा सोने के मानक के रूप में माना जाता है है । फिर भी, वसा अवक्रमित पर अविश्वसनीय परिणाम पैदा कर सकते है/ इसके अतिरिक्त, यह इस तरह के मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), लार, और मूत्र, जिससे काफी हद तक antemortem निदान7में अपने रोजगार precluding के रूप में जैविक द्रव नमूनों परख करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । वैकल्पिक पारंपरिक नैदानिक परीक्षणों, जैसे रेबीज टिश्यू कल्चर इंफेक्शन टेस्ट (RTCIT) और माउस टीका परीक्षण (एमआईटी), के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है6, एक बड़ी खामी है जब एक तेजी से निदान आवश्यक है ।
विभिन्न आणविक नैदानिक परीक्षणों (उदाहरण के लिए, आरटी-पीसीआर द्वारा वायरल आरएनए का पता लगाना, पीसीआर-एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोतुला परख [पीसीआर-एलिसा], स्वस्थानी संकरण में, और रीयल-टाइम पीसीआर) रेबीज निदान8के लिए तेजी से और संवेदनशील तकनीकों के रूप में उपयोग किया जाता है । आरटी-पीसीआर अब नियमित रेबीज निदान के लिए OIE द्वारा सिफारिश की है, और एक heminested (hn) पीसीआर नैदानिक परीक्षणों और स्थलीय जानवरों के लिए टीकों के OIE मैनुअल में वर्णित सभी lyssaवायरसों5का पता लगाने के लिए है । यहां हम एक पैन-lyssavirus नेस्टेड RT-पीसीआर, जो सभी 18 lyssavirus के लिए तुलनीय या अधिक है कि वसा द्वारा प्राप्त प्रजातियों में से विशिष्ट और संवेदनशील का पता लगाने की अनुमति देता है का वर्णन । विधि का सिद्धांत लक्ष्य आरएनए (लाइसैवायरस एन जीन का संरक्षित क्षेत्र) सीडीएनए में एक आरटी है, जिसके बाद सीडीएनए को पीसीआर के दो राउंड द्वारा प्रवर्धन किया जाता है । एक ८४५ bp टुकड़ा बढ़ाना करने के लिए बाहरी प्राइमरों के साथ पहले दौर पीसीआर के साथ cdna गुजरता है; फिर, दूसरे दौर की पीसीआर आंतरिक प्राइमर्स के साथ ३७१ bp टुकड़ा बढ़ाना के लिए एक टेम्पलेट के रूप में पहले दौर के पीसीआर उत्पाद का उपयोग करती है । पीसीआर के दो राउंड में परख की संवेदनशीलता काफी बढ़ जाती है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

रैब्डोविरिडीपरिवार के भीतर रेबीज वायरस और जीनस लाइसैवायरस के अन्य सदस्य प्रजातियों का पता लगाने के लिए, संरक्षित क्षेत्र का पता लगाने के लिए पैन-लाइसावायरस नेस्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (नेस्टेड आरटी-पीसीआर) विकसित किया गया था । लाइसावायरसों के न्यूकोप्रोटीन (ढ) जीन का । यह विधि वायरल पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषी बनाने के लिए विषाणु आरएनए को टेम्पलेट और ओलिगो (डीटी)15 और यादृच्छिक हैडेक्सर के रूप में प्रयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) लागू करती है । इसके बाद, वायरल सीडीएनए का उपयोग बाहरी प्राइमर्स का उपयोग करते ३७१ हुए पहले दौर की पीसीआर में ८४५ बीपी एन जीन अंश को बढ़ाना है । इस विधि से रेबीज वायरस (RABV) के विभिन्न आनुवंशिक clades का पता लगा सकते हैं । सत्यापन, नैदानिक रेबीज निदान और चीन में निगरानी के 10 वर्षों में आठ घरेलू पशु प्रजातियों से ९,६२४ मस्तिष्क नमूनों का उपयोग कर पता चला है कि विधि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट के साथ तुलना में १००% संवेदनशीलता और ९९.९७% विशिष्टता है एंटीबॉडी टेस्ट (वसा), सोने के मानक विधि विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) और विश्व संगठन के लिए पशु स्वास्थ्य (OIE) द्वारा अनुशंसित । इसके अलावा, विधि भी विशेष रूप से वायरस की वर्गीकरण पर अंतरराष्ट्रीय समिति की 10 वीं रिपोर्ट में 15 अंय अनुमोदित और दो उपंयास lyssavirus प्रजातियों के लक्षित N जीन टुकड़ा बढ़ाना सकता है (ICTV) के रूप में एक संश्लेषित की नकल का पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन द जीन सभी लाइसावायरसों का प्लाज्मिड्स । यह विधि रेबीज निदान के लिए वसा के लिए एक सुविधाजनक विकल्प प्रदान करती है और इसे चीन के राष्ट्रीय मानक (GB/T36789-2018) के रूप में अनुमोदित किया गया है ।

18 lyssavirus प्रजातियों का पता लगाने के लिए नेस्टेड आरटी-पीसीआर के परिणाम चित्र 1में दिखाए जाते हैं । सभी पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण पहले-और ३७१ बीपी में अपेक्षित ८४५ बीपी दिखाया नकारात्मक नियंत्र...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

एक पैन-lyssavirus नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विशेष रूप से सभी ज्ञात lyssaवायरस का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है । मांयता रेबीज का उपयोग कर विभिंन पशु प्रजातियों के मस्तिष्क के नमूनों से पता चला है कि इस विधि एक संवेदनशीलता और सोने के मानक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण के समकक्ष विशिष्टता है और नियमित रेबीज निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Lyssaवायरसों का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन Polymerase चेन रिएक्शन का मूल्यांकन

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

नेस्टेड आरटी-पीसीआर को सभी 16 ICTV अनुमोदित और दो उपन्यास Lyssavirus प्रजातियों सहित सभी Lyssaviruses का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है । इस विधि का सत्यापन चीन में नैदानिक रेबीज निदान और निगरानी के 10 वर्षों में ९० से अधिक पशु मस्तिष्क नमूनों का उपयोग करके साबित किया गया है । नेस्टेड आरटी-पीसीआर न केवल ताजा मस्तिष्क ऊतक नमूनों पर विश्वसनीय परिणाम पैदा कर सकती है, बल्कि अवक्रमित नमूनों पर भी ।जलभराव इस विधि का उपयोग जैविक तरल पदार्थ के नमूनों जैसे सेरेब्रोस्पाइनल द्रव, लार और मूत्र परखने के लिए किया जा सकता है, जिससे इस विधि को अल्टीमेटम निदान में लागू किया जा सकता है। आदेश में पीसीआर कैरी-ओवर संदूषण को कम करने के लिए, यह नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है यह वास्तव में कदम उठाने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, प्रत्येक आरएनए निष्कर्षण के लिए तैयारी की आवश्यकता होती है, पीसीआर सेट अप, और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस शारीरिक रूप से अलग क्षेत्रों में संचालित किया जाना चाहिए।पेप्टाइड श्रृंखला के लिए रेबीज संदूषण को रोकने के लिए आरएनए निष्कर्षण और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में सर्पिल टेप का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है। बर्फ पर अपने एजेंटों को तैयार करने, नियमित रूप से दस्ताने बदलने और राइबोन्यूकेज मुक्त सामग्री के उपयोग जैसे उचित हैंडलिंग से राइबोन्यूलेज की शुरूआत को रोका जा सकेगा और आरएनए के क्षरण को खत्म किया जा सकेगा। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, रेबीज संदिग्ध ऊतक, त्वचा बायोप्सी, लार, सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ या राबव संक्रमित सेल संस्कृति से आरएनए निकालें जैसा कि पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित है।जब आगे बढ़ने के लिए तैयार है, फ्रीजर से आवश्यक अभिकर्द को हटा दिया और उन्हें बर्फ पर रखने के लिए। उपयोग से पहले प्रत्येक अभिवाक्षक को गल और भंवर करना सुनिश्चित करें। सीडीएनए के लिए वायरल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए बर्फ पर प्रत्येक नमूने के लिए 12 माइक्रो लीटर रिएक्शन मिक्स और एक क्लीनरूम में टेक्स्ट प्रोटोकॉल के टेबल 1 में उल्लिखित 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब तैयार करें।पाइपिंग विविधताओं के लिए खाते में, आवश्यकता से कम से कम एक प्रतिक्रिया आकार कम से कम एक प्रतिक्रिया आकार की मात्रा तैयार करें, और फिर प्रतिक्रिया मिश्रण को 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों में विभाजित करें। एक टेम्पलेट कमरे में एक पीसीआर वर्कस्टेशन में, या तो नमूना या प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए नियंत्रण में से एक के आठ माइक्रोलीटर जोड़ें । सकारात्मक नियंत्रण फिक्स्ड-आरएबीवी स्ट्रेन सीवीएस 11 से संक्रमित सेल संस्कृति से निकाला गया आरएनए है, जबकि नकारात्मक नियंत्रण में आरएनएस-मुक्त डबल आसुत पानी होता है।प्रत्येक ट्यूब की सामग्री को पहले भंवर से मिलाएं और फिर संक्षेप में अपकेंद्रित्र करके। इसके बाद, रिएक्शन ट्यूब्स को थर्मोसाइकिलर में लोड करें। पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित सीडीएनए संश्लेषण कार्यक्रम को सेट करें और चलाएं।सबसे पहले, आवश्यक अभिकर्णों को पुनः प्राप्त करें और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक उन्हें एक क्लीनरूम में बर्फ पर रखें। तैयार होने पर गल करते हैं और अभिवात करते हैं। इसके बाद, टेक्स्ट प्रोटोकॉल की तालिका 2 में उल्लिखित 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में प्रत्येक नमूने के लिए पहले दौर पीसीआर मिश्रण के 48 माइक्रोलीटर तैयार करें और प्रतिक्रिया मिश्रण को 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में विभाजित करें।एक टेम्पलेट कमरे में एक पीसीआर वर्कस्टेशन में, पहले दौर पीसीआर मिश्रण में सीडीएनए के एक दो माइक्रोलीटर नमूना जोड़ें। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में CVS11 सीडीएनए के दो माइक्रोलीटर, और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में डबल आसुत पानी के दो माइक्रोलीटर शामिल करें। फिर, पाठ प्रोटोकॉल के तालिका 3 में सूचीबद्ध मापदंडों का उपयोग करके सीलबंद ट्यूबों को पीसीआर थर्मोसाइकिलर और चक्र में स्थानांतरित करें।शुरू करने के लिए, टेक्स्ट प्रोटोकॉल की तालिका 4 में उल्लिखित 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में प्रत्येक नमूने के लिए दूसरे दौर पीसीआर मिश्रण के 48 माइक्रोलीटर तैयार करें और प्रतिक्रिया मिश्रण को 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में विभाजित करें। दूसरे राउंड पीसीआर मिक्स में पहले राउंड पीसीआर प्रोडक्ट के दो माइक्रोलीटर डालें। पीसीआर के इस दौर के लिए डबल डिस्टिल्ड वाटर को निगेटिव कंट्रोल के तौर पर शामिल करें।फिर, टेक्स्ट प्रोटोकॉल के तालिका 3 में सूचीबद्ध मापदंडों का उपयोग करके पीसीआर थर्मोसाइक्लिंग करें। सबसे पहले, 100 मिलीलीटर ट्रिस-एसीटेट ईडीएटीए में 1.5 ग्राम एग्राड डालें और इसे अच्छी तरह से भंग करने के लिए माइक्रोवेव ओवन में गर्म करें। इसके बाद, 0.01% की अंतिम एकाग्रता पर एथिडियम ब्रोमाइड जोड़ें, जेल को मोल्ड में डालें और इसे कम से कम 30 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर जमना छोड़ दें।प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के पांच माइक्रोलीटर को 6x लोडिंग बफर के एक माइक्रोलीटर के साथ मिलाकर लोडिंग नमूने तैयार करें। अलग से नमूनों और उपयुक्त डीएनए मार्कर को कुओं में लोड करें और 120 वोल्ट पर लगभग 30 से 45 मिनट तक जेल चलाएं जब तक कि डाई लाइन जेल से लगभग 75 से 80% नीचे न हो जाए। जब रन पूरा हो जाए, तो पावर बंद कर दें और इलेक्ट्रोड को पावर सोर्स से डिस्कनेक्ट कर दें ।फिर, जेल बॉक्स से जेल को ध्यान से हटा दें। डीएनए के टुकड़ों की कल्पना और तस्वीर के लिए यूवी जेल दस्तावेजीकरण डिवाइस का उपयोग करें। पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित नेस्टेड रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर की विशेषता है।18 Lyssavirus प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक प्रतिनिधि नेस्टेड आरटी-पीसीआर के परिणाम यहां दिखाए गए हैं । पीसीआर पॉजिटिव कंट्रोल्स पहले राउंड के प्रवर्धन में ८४५ बेस जोड़े पर और दूसरे के लिए ३७१ बेस पेयर्स पर अपेक्षित बैंड दिखाते हैं । नकारात्मक नियंत्रण के लिए कोई बैंड नहीं देखा जाता है।सभी 18 Lyssaviruses सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही दो बैंड का उत्पादन करने के लिए देखा जाता है, यह दर्शाता है कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर सभी 18 Lyssaviruses का पता चला । जबकि प्लाज्मिड के 16 पीसीआर के दो दौर में कुशल प्रवर्धन है, उनमें से दो, Aravan वायरस और Ikoma वायरस, केवल या तो पहले या दूसरे दौर में परिलक्षित होते हैं, क्रमशः । विधि की संवेदनशीलता विभिन्न Lyssavirus प्लाज्मिड का पता लगाने में भिन्न होती है, 2.24 से 2, 240 अणु प्रति माइक्रोलीटर से लेकर मूल्यों से।इन मतभेदों को वायरल अनुक्रम विविधता के कारण प्राइमर और टेम्पलेट्स के बीच बेमेल के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। नैदानिक नमूनों से 9, 624 मस्तिष्क ऊतकों की तुलना जो नेस्टेड पीसीआर द्वारा परीक्षण किए जाते हैं बनाम वसा के साथ परीक्षण किए गए लोगों से पता चलता है कि 100% की संवेदनशीलता के रूप में आरटी-पीसीआर को नेस्टेड किया गया है और 99.97% की विशिष्टता दोनों विधियों के बीच 99.07% दस अन्य रेबीज प्रयोगशालाओं को नेस्टेड आरटी-पीसीआर को और अधिक मान्य करने के लिए परीक्षण करने के लिए आमंत्रित किया गया था। सभी दस प्रयोगशालाओं नेस्टेड आरटी-पीसीआर परिणाम प्राप्त किए जो वसा के अनुसार 100% हैं, जिसमें कोई झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मकता नहीं है, यह दर्शाता है कि नेस्टेड आरटी-पीसीआर में उच्च विशिष्टता और प्रजनन क्षमता है।रेबीज प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने के लिए अब ओआईई द्वारा आरटी-पीसीआर की सिफारिश की जाती है। और हमारे नेस्टेड आरटी-पीसीआर को २०१८ में चीन में रेबीज प्रौद्योगिकियों के राष्ट्रीय मानक के रूप में साबित किया गया है ।

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विषाक्त पुफेरफिश की बेहतर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन-प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता जीनोटाइपिंग

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

किसी भी डीएनए स्रोत से बड़े पैमाने पर gRNA पुस्तकालय उत्पादन के लिए एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

वास्तविक समय प्रतिलेखन कारक बंधन, प्रतिलेखन, अनुवाद, और कारोबार सेलुलर सक्रियण के दौरान वैश्विक घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

मानव टेलोमिरेज रिवर्स Transcriptase प्रोटीन की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-क्रोमेटिन लूप संरचना की मध्यस्थता पुनर्गठन

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitochondrial डीएनए मिथाइल का सटीक पता लगाने के लिए क्रियाविधि

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

हॉटस्पॉट क्षेत्रों में उत्परिवर्तनों का व्यापक और एक साथ पता लगाने के लिए एकल छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

रिवर्स प्रतिलेखन-पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (आरटी-दीपक) Zika वायरस और मूत्र, सीरम में गृह व्यवस्था जीन के लिए परख, और मच्छर के नमूने

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

माउस भ्रूण में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं की पहचान स्टेम दक्षिणी सोख्ता और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग कोशिकाओं

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...