Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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Lo studio è stato sostenuto dal piano nazionale di ricerca e sviluppo chiave (Grant No. 2016YFD0500401) e dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant n. 31302043).

L'uso di topi in questo protocollo è stato approvato dal comitato amministrativo per il benessere degli animali dell'Istituto di medicina veterinaria militare, l'Accademia delle scienze mediche militari, Cina (laboratorio di cura degli animali e l'autorizzazione del Comitato di uso, permesso numero JSY-DW-2010-02). Sono state seguite tutte le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. estrazione dell'RNA
<ol><li>Estratto di RNA dalla rabbia-so...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Attualmente, RABV è un importante Lyssavirus responsabile di quasi tutte le rabbia umana e animale in Cina, così come in altri paesi. Inoltre, una variante IRKV è stata identificata per la prima volta da un pipistrello Murina leucogaster nella provincia di Jilin nella cina nordorientale nel 201210, ed è stato segnalato per causare la morte di un cane nella provincia di Liaoning nel 201711. Più recentemente, un romanzo Lyssavirus, TWBLV, è stato anche...

La rabbia è una malattia zoonotica a livello mondiale causata da virus all'interno del genere Lyssavirus1. I Lyssaviruses (famiglia Rhabdoviridae) sono virus RNA a singolo-negativo-filamento con un genoma di circa 12 KB che codifica cinque proteine: N, fosfoproteina (P), proteina di matrice (M), glicoproteina (G), e la grande proteina o polimerasi (L). Sulla base delle sequenze nucleotidiche del gene N, della distanza genetica e dei modelli antigenici, i Lyssavirus sono stati suddivisi in 16 specie, comprendenti il virus della rabbia classica (RABV) e i virus correlati alla rabbia (RRV): virus bat di Lagos (LBV), Virus Duvenhage (DUVV ), Il Virus Mokola (MOKV), il bat europeo Lyssavirus 1 (EBLV-1), l'European bat Lyssavirus 2 (EBLV-2), bat lyssavirus australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), Bokeloh bat Lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat Lyssavirus (GBLV), virus Irkut (IRKV), Virus Khujand (KHUV), virus della bat caucasica occidentale (WCBV), virus bat Shimoni (SHIBV) e Lleida bat Lyssavirus (LLEBV)2. Recentemente, sono stati identificati altri due Lyssavirus: Kotalahti bat Lyssavirus (KBLV) isolato da una mazza di Brandt (Myotis Brandtii) in Finlandia nel 20173 e Taiwan bat Lyssavirus (twblv) isolato da un pipistrello giapponese ( Pipistrellus Abramus) a Taiwan, Cina nel 2016 – 20174.
Tutti i mammiferi sono suscettibili alla rabbia; Tuttavia, nessuna lesione patognomonica lorda o segni clinici specifici ne consentono l'identificazione, e la diagnosi può essere fatta solo nel laboratorio5. Il metodo più diffuso per la diagnosi della rabbia è il grasso, che è considerato come il gold standard sia dall'OMS che dall'OIE5,6. Tuttavia, il FAT può produrre risultati inaffidabili su campioni di tessuto cerebrale degradato/autolizzato. Inoltre, non può essere utilizzato per il dosaggio di campioni di fluidi biologici come il liquido cerebrospinale (CSF), la saliva e l'urina, precludendo in gran parte il suo impiego nella diagnosi prima della morte7. Test diagnostici convenzionali alternativi, come il test di infezione della coltura del tessuto della rabbia (RTCIT) e il test di inoculo del topo (MIT), richiedono diversi giorni6, un grave inconveniente quando è essenziale una diagnosi rapida.
Vari test diagnostici molecolari (ad esempio, la rilevazione di RNA virale da RT-PCR, il saggio immunosorbente PCR-Linked [PCR-ELISA], l'ibridazione in situ e la PCR in tempo reale) sono utilizzati come tecniche rapide e sensibili per la diagnosi della rabbia8. La RT-PCR è ora raccomandata dall'OIE per la diagnosi della rabbia di routine e una PCR heminested (HN) è descritta nel manuale dell'OIE di test diagnostici e vaccini per animali terrestri per rilevare tutti i Lyssavirus5. Qui descriviamo un pan-Lyssavirus annidato RT-PCR, che consente il rilevamento specifico e sensibile di tutte le 18 specie di Lyssavirus paragonabile o superiore a quella ottenuta dal FAT. Il principio del metodo è una RT dell'RNA bersaglio (regione conservata del gene Lyssavirus N) in cDNA, seguita dall'amplificazione del cDNA da due cicli di PCR. Il cDNA subisce la PCR del primo round con primer esterni per amplificare un frammento di 845 BP; quindi, la PCR di secondo ciclo utilizza il prodotto PCR al primo round come modello per amplificare un frammento di 371 BP con primer interni. I due cicli di PCR aumentano significativamente la sensibilità del saggio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Per rilevare il virus della rabbia e altre specie membro del genere Lyssavirus all'interno della famiglia Rhabdoviridae, la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa di Pan-Lyssavirus (RT-PCR nidificata) è stata sviluppata per rilevare la regione conservata del gene nucleoproteico (N) di Lyssaviruses. Il metodo applica la trascrizione inversa (RT) utilizzando RNA virale come modello e oligo (dT)15 e esameri casuali come primer per sintetizzare il DNA complementare virale (cDNA). Quindi, il cDNA virale viene utilizzato come modello per amplificare un frammento di gene 845 BP N nella PCR del primo round utilizzando primer esterni, seguiti da PCR nidificata del secondo round per amplificare il frammento finale 371 BP utilizzando primer interni. Questo metodo può rilevare diverse cladi genetiche di virus della rabbia (RABV). La validazione, utilizzando 9.624 campioni cerebrali di otto specie animali domestiche in 10 anni di diagnosi di rabbia clinica e di sorveglianza in Cina, ha mostrato che il metodo ha 100% di sensibilità e 99,97% di specificità rispetto alla fluorescenza diretta test anticorpale (FAT), il metodo standard Gold raccomandato dall'organizzazione mondiale della sanità (OMS) e dall'organizzazione mondiale per la salute animale (OIE). Inoltre, il metodo potrebbe anche amplificare in modo specifico il frammento di gene N mirato di 15 altre specie di Lyssavirus approvate e due nuove nel 10 ° rapporto del Comitato internazionale sulla tassonomia dei virus (ICTV) come valutato da un rilevamento mimico di sintetizzato N plasmidi genici di tutti i Lyssaviruses. Il metodo fornisce una comoda alternativa al FAT per la diagnosi della rabbia ed è stato approvato come standard nazionale (GB/T36789-2018) della Cina.

I risultati della RT-PCR nidificata per rilevare 18 specie di Lyssavirus sono mostrati nella Figura 1. Tutti i controlli positivi della PCR hanno mostrato l'atteso 845 BP nel primo-e 371 BP nelle amplificazioni del secondo round senza banda nel controllo negativo. Tutti i 18 Lyssavirus hanno prodotto le bande attese 845 e/o 371 BP, indicando che la RT-PCR nidificata ha rilevato tutti i 18 Lyssavirus. Sedici Lyssavirus plasmidi avevano un'amplificazione efficiente in due cicli di PCR, ma due,...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

È stata sviluppata una reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa nidificata di Pan-Lyssavirus per rilevare in modo specifico tutti i Lyssaviruses conosciuti. La validazione utilizzando campioni di cervello di rabbia di diverse specie animali ha mostrato che questo metodo ha una sensibilità e una specificità equivalenti al test anticorpale fluorescente standard oro e potrebbe essere utilizzato per la diagnosi di rabbia di routine.

Valutazione di una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

L'RT-PCR annidato è stato sviluppato per rilevare tutti i lyssavirus, inclusi tutti i 16 TICV approvati e due nuove specie di Lyssavirus. La convalida di questo metodo è stata dimostrata utilizzando oltre 9000 campioni di cervello animale in 10 anni di diagnosi clinica della rabbia e sorveglianza in Cina. L'RT-PCR annidato non solo può produrre risultati credibili su campioni di tessuto cerebrale fresco, ma anche su campioni degradati.L'inondazione questo metodo può essere utilizzato per saggiare campioni di liquidi biologici come liquido cerebrospinale, saliva e urina, quindi questo metodo può essere applicato nelle diagnosi di ultimatum. Al fine di ridurre al minimo la contaminazione da riporto PCR, è importante preparare controlli negativi e positivi È davvero importante adottare misure. Ad esempio, per ogni estrazione dell'RNA è necessaria la preparazione, l'configurazione della PCR e l'elettroforesi del gel devono essere azionate in aree fisicamente separate.Si consiglia inoltre di utilizzare nastri a spirale nell'estrazione dell'RNA e nella trascrizione inversa al fine di prevenire la contaminazione da rabbia alla catena peptidica. Una corretta manipolazione come preparare i tuoi agenti sul ghiaccio, cambiare regolarmente i guanti e l'uso di materiali senza ribonucleasi impedirà l'introduzione di ribonucleasi ed eliminerà la degradazione dell'RNA. Per iniziare questa procedura, estrarre l'RNA dal tessuto sospetto della rabbia, dalle biopsie cutanee, dalla saliva, dal liquido cerebrospinale o dalla coltura cellulare infetta rabv come delineato nel protocollo di testo.Quando è pronto per procedere, rimuovere i reagenti necessari dal congelatore e tenerli sul ghiaccio. Assicurarsi di scongelare e vortice ogni reagente prima dell'uso. Per la trascrizione inversa dell'RNA virale al cDNA preparare 12 micro litri di miscela di reazione per ogni campione su ghiaccio e un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri come descritto nella tabella 1 del protocollo di testo in una camera bianca.Per tenere conto delle variazioni di pipettazione, preparare un volume di miscela principale di almeno una dimensione di reazione superiore al necessario, quindi dividere la miscela di reazione in tubi PCR da 0,2 millilitri. In una workstation PCR in una stanza dei modelli aggiungere otto microlitri del campione o uno dei controlli alla combinazione di reazioni. Il controllo positivo è l'RNA estratto dalla coltura cellulare infettata dal ceppo DI RABV fisso CVS11, mentre il controllo negativo contiene acqua distillata doppia priva di Rnase.Mescolare il contenuto di ogni tubo prima vortexing e poi centrifugando brevemente. Successivamente, caricare i tubi di reazione in un termociclo. Impostare ed eseguire il programma di sintesi cDNA come descritto nel protocollo di testo.In primo luogo, recuperare i reagenti necessari e tenerli sul ghiaccio in una camera bianca fino a quando non sono pronti per l'uso. Quando è pronto, scongelare e vortice i reagenti. Successivamente, preparare 48 microlitri del primo mix PCR rotondo per ciascun campione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, come indicato nella tabella 2 del protocollo di testo, e dividere la miscela di reazione in tubi PCR da 0,2 millilitri.In una workstation PCR in una stanza dei modelli aggiungere un campione di due microliter del cDNA nel mix PCR del primo round. Includere due microlitri di CVS11 cDNA come controllo positivo e due microlitri di acqua distillata doppia come controllo negativo. Quindi, trasferire i tubi sigillati in un termociclometro PCR e ciclo utilizzando i parametri elencati nella tabella 3 del protocollo di testo.Per iniziare, preparare 48 microlitri della miscela PCR del secondo ciclo per ciascun campione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, come indicato nella tabella 4 del protocollo di testo, e dividere la miscela di reazione in tubi PCR da 0,2 millilitri. Aggiungere due microlitri del prodotto PCR del primo round nel mix PCR del secondo round. Includere l'acqua distillata doppia come controllo negativo per questo ciclo di PCR.Quindi, eseguire il termociclismo PCR utilizzando i parametri elencati nella tabella 3 del protocollo di testo. In primo luogo, aggiungere 1,5 grammi di agarosio a 100 millilitri di EDTA tris-acetato e scaldarlo in un forno a microonde per scioglierlo completamente. Quindi, aggiungere il bromuro di etidio a una concentrazione finale dello 0,01%Versare il gel nello stampo e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.Preparare i campioni di carico mescolando cinque microlitri di ciascun prodotto PCR con un microlitro di tampone di carico 6x. Caricare separatamente i campioni e l'adatto marcatore di DNA nei pozzi ed eseguire il gel per circa 30-45 minuti a 120 volt fino a quando la linea di tintura è approssimativamente dal 75 all'80% lungo il gel. Al termine della corsa, spegnere l'alimentazione e scollegare gli elettrodi dalla fonte di alimentazione.Quindi, rimuovere con cura il gel dalla scatola di gel. Utilizzare un dispositivo di documentazione in gel UV per visualizzare e fotografare i frammenti di DNA. Caratterizzare la PCR nidificata a trascrizione inversa come delineato nel protocollo di testo.I risultati di un RT-PCR annidato rappresentativo per rilevare 18 specie di Lyssavirus sono mostrati qui. I controlli positivi PCR mostrano la banda prevista a 845 coppie di basi nella prima amplificazione rotonda e a 371 coppie di basi per il secondo. Non viene vista alcuna banda per i controlli negativi.Tutti i 18 Lyssavirus sono visti produrre le stesse due bande del controllo positivo, indicando che l'RT-PCR annidato ha rilevato tutti i 18 Lyssavirus. Mentre 16 dei plasmidi hanno un'amplificazione efficiente in due cicli di PCR, due di essi, il virus Aravan e il virus Ikoma, sono amplificati solo nel primo o nel secondo round, rispettivamente. La sensibilità del metodo varia nel rilevamento di diversi plasmidi del Lyssavirus, da valori che vanno da 2,24 a 2.240 molecole per microlitro.Queste differenze possono essere attribuite ai disallineamenti tra i primer e i modelli a causa della diversità della sequenza virale. Un confronto di 9.624 tessuti cerebrali provenienti da campioni clinici testati da PCR nidificati rispetto a quelli testati con FAT mostra che rt-PCR annidato come sensibilità del 100% e una specificità del 99,97%La conformità tra i due metodi è del 99,07%Altri dieci laboratori di rabbia sono stati invitati a condurre il test per convalidare ulteriormente l'RT-PCR annidato. Tutti e dieci i laboratori hanno ottenuto risultati RT-PCR annidati che sono al 100% in conformità con il FAT, senza falsi negativi o falsi positivi, indicando che l'RT-PCR annidato ha un'elevata specificità e riproducibilità.RT-PCR è ora raccomandato da OIE per l'utilizzo di tecnologie di rabbia. E il nostro RT-PCR annidato è stato dimostrato come lo standard nazionale delle tecnologie della rabbia in Cina nel 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Ricerca

Genetica

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CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Invertire l'amplificazione isotermica mediata da Loop-trascrizione (RT-LAMP) analisi per Virus di Zika e geni Housekeeping in urina, siero ed esempi di zanzara

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...