Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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이 연구는 국가 주요 연구 개발 계획 (보조금 번호 2016YFD0500401)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (보조금 31302043)에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 마우스의 사용은 군사 의학 연구소의 동물 복지에 대 한 관리 위원회에 의해 승인 되었다, 군사 의료 과학 아카데미, 중국 (실험실 동물 관리 및 사용 위원회 승인, 허가 2010-02). 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 모든 기관 및 국가 지침이 따랐습니다.
1. RNA 추출
<ol><li>광견병-의심 되는 뇌 조직, 피부 생 검, 타 액 또는 CSF 또는 RABV 감염 세포 배양 물 로부터 ...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

현재 RABV는 중국의 거의 모든 인간과 동물 광견병 뿐만 아니라 다른 나라에 대 한 책임을 맡고 있는 주요 리 사이 바이러스입니다. 또한, IRKV 변이체는 2012에서 중국 북동부에 있는 길 림 성의 Murina leucogaster 박쥐 로부터 먼저 확인 되었고, 201711에 있는 랴오닝 성에 서 개 사망을 야기 하는 것으로 보고 되었다. 가장 최근에는, 2017에서 대만, 중국의 일...

광견병은 인 리스 사코 바이러스1내에서 바이러스에의 한 전 세계적으로 발생 한 질병입니다. 리스 사 바이러스 (가족 Rhabdo비리대)는 5 개의 단백질을 인코딩하는 약 12kb 게놈을 갖는 단일 음성 가닥 RNA 바이러스: N, phosphoprotein, 매트릭스 단백질 (G), 당단백질 및 큰 단백질 또는 중 합 효소 (L). N 유전자, 유전 거리 및 항 원 성 패턴의 뉴클레오티드 서 열에 기초 하 여, 리 사이 바이러스는 고전적인 광견병 바이러스 (RABV) 및 광견병 관련 바이러스 (RRV)를 포함 하는 16 종으로 구분 되었다: 라고스 박쥐 바이러스 ), 모 코 롤라 바이러스 (MOKV), 유럽 박쥐 리스 사 바이러스 1 (EBLV-1), 브라질의 박쥐 리스 사 바이러스 2 (EBLV), 아 라 반 바이러스의 아 반 바이러스,이 코 코 (IKOV),이 르 쿠 바이러스 (GBLV), Irkut (IRKUT), (이로 브 루), Gannoruwa Khujand 바이러스 (쿠 브), 웨스트 코 카 서 스 박쥐 바이러스 (WCBV), 시 나 니 박쥐 바이러스 (L레프) 및 레이다 박쥐 리스 사 바이러스 최근 두 가지 추가 리 사이 바이러스가 확인 되었습니다: 일본 pipistrelle 에서 고립 된 2017 3 및 대만 박쥐 리스 사 바이러스 (Twblv)에서 브란트의 브랜드 박쥐 (myotis 브랜디 티) 로부터 고립 된 (kblv) Pipistrellus abramus), 중국 대만에서 2016 년-20174.
모든 포유류는 광견병에 취약 합니다. 그러나, 총 병리학 적 병 변 또는 특정 임상 징후는 그것의 식별을 허용 하지 않으며, 진단은 실험실 에서만 만들 수 있습니다5. 광견병 진단을 위한 가장 널리 사용 되는 방법은 지방, 누구와 oie5에 의해 금 표준으로 간주 됩니다.,6. 그럼에도 불구 하 고, 지방은 저하/자동 화 된 뇌 조직 샘플에 대 한 신뢰할 수 없는 결과를 생성 합니다. 추가적으로, 뇌 척 수액 (CSF), 타 액 및 소변과 같은 생물학적 유체 표본을 분석 하는 데 사용할 수 없으며,이로 인해 antemortem 진단7에서의 고용을 크게 배제 합니다. 광견병 조직 배양 감염 시험 (RTCIT) 및 마우스 접종 시험 (MIT)과 같은 대안적인 종래의 진단 시험은 신속한 진단이 필수적 일 때 주요한 단점이 있고, 며칠6을 필요로 한다.
다양 한 분자 진단 시험 (예를 들어, RT-PCR에의 한 바이러스 성 RNA의 검출, 효소-결합 면역 흡착 분석 법 [PCR ELISA], 현장 혼성 화 및 실시간 PCR)은 광견병 진단8에 대 한 신속 하 고 민감한 기술로 사용 된다. RT-PCR은 현재 일상적인 광견병 진단을 위해 OIE에 의해 권장 되 고 있으며, 각 리 사 바이러스5를 검출 하는 것은 지상 동물에 대 한 진단 검사 및 백신의 Oie 매뉴얼에 기재 되어 있다. 여기에서 우리는 지방에 의해 얻어진 것에 필적 하거나 초과 하는 모든 18 개의 리 사 바이러스 종의 특이 하 고 민감한 검출을 허용 하는 범 리 사 바이러스 중첩 RT-PCR을 설명 한다. 상기 방법의 원리는 표적 RNA (리즈 사 바이러스 N 유전자의 보존 부위)를 cDNA로 넣고, 2 차례의 PCR로 cDNA의 증폭을 따른다. 상기 cDNA는 845 bp 단편을 증폭 하기 위해 외부 프라이 머로 1 라운드 PCR을 겪는 다; 이어서, 상기 제 2 라운드 pcr은 371 bp 단편을 내부 프라이 머로 증폭 하기 위한 템플릿으로 서 1 라운드 PCR 산물을 사용 한다. PCR의 2 개의 라운드는 분석의 감도를 현저 하 게 증가 시킵니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

가정 내에서 리 조 바이러스 의 광견병 바이러스 및 기타 종 종을 검출 하는 것은 Rhabdo비리대에 있어서, 상기 팬 리스 사 바이러스 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응 (중첩 된 rt-pcr)은 보존 된 영역을 검출 하기 위하여 개발 된 광견병 (N) 유전자의. 이 방법은 바이러스 RNA (cDNA)를 합성 하기 위한 프라이 머로 서의 템플릿 및 올리고 (dT)15 와 랜덤 hexamers로 서 바이러스가 있는 DNA를 사용 하 여 역 전사 (RT)를 적용 한다. 이어서, 바이러스 성 cDNA는 외부 프라이 머를 사용 하 여 1 라운드 PCR에서 845 bp N 유전자 단편을 증폭 하는 템플릿으로 사용 되 고, 이어서 제 2 라운드 형 PCR에 의해 내부 프라이 머를 이용 하 여 최종 371 bp 단편을 증폭 한다. 이 방법은 광견병 바이러스 (RABV)의 상이한 유전 적 clades를 검출할 수 있다. 중국에서의 10 년의 임상 광견병 진단 및 감시에서 8 개의 국내 동물 종에서 9624 두뇌 표본을 사용 하 여 유효성 검사는, 방법이 직접 형광에 비교 하 여 100% 감도 및 99.97% 특이성을가지고 있음을 보여주었습니다 항 체 시험 (지방), 세계 보건 기구 (WHO)와 동물 건강을 위한 세계 조직 (OIE)에 의해 권장 되는 금 표준 방법. 또한, 상기 방법은 또한 합성의 모방 검출에 의해 평가 된 바와 같이, 바이러스의 분류에 관한 국제 위원회의 제 10 회 보고서에서의 타겟 된 N 유전자 단편을 다른 승인 및 2 개의 신규 리 사이 바이러스 종들에 게 증폭 시킬 수 있다 모든 리즈 사 바이러스의 N 유전자 플라스 미드. 이 방법은 광견병 진단에 대 한 지방에 대 한 편리한 대안을 제공 하 고 중국의 국가 표준 (T36789)로 승인 되었습니다.

18 개의 리 사 바이러스 종을 검출 하는 중첩 된 RT-PCR의 결과는 도 1에 나타나 있다. 모든 PCR 양성 대조 군에서는 1 차 및 371 bp에서 845 bp에 예상 되는 것을 나타내 었으 며, 네거티브 컨트롤에는 밴드가 없는 2 라운드 증폭. 총 18 개 리즈 사 바이러스는 예상 845 및/또는 371 bp 대역을 생산 하 여, 중첩 된 RT-PCR이 모든 리즈 사 바이러스를 검출 했음을 나타낸다. 16 개의 리 사 바이러...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

중첩 된 RT-PCR은 승인 된 모든 16 ICTV 및 두 개의 새로운 Lysavirus 종을 포함하여 모든 Lysaviruses를 감지하기 위해 개발되었습니다. 이 방법의 검증은 중국에서 임상 광견병 진단 및 감시의 10 년에서 9000 개 이상의 동물 뇌 표본을 사용하여 입증되었습니다. 중첩 된 RT-PCR은 신선한 뇌 조직 샘플뿐만 아니라 저하 된 샘플에서도 신뢰할 수있는 결과를 생성 할 수 있습니다.침수 방법은 뇌척수액, 타액 및 소변과 같은 생물학적 유체 표본을 분석하는 데 사용될 수 있으며, 이에 따라 이 방법은 최후통첩 진단에 적용될 수 있다. PCR 이월 오염을 최소화하기 위해서는 음수 및 양성 제어를 준비하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 각 RNA 추출에 대한 준비, PCR 설정 및 겔 전기전도는 물리적으로 분리된 영역에서 작동되어야 합니다.또한 펩티드 사슬에 대한 광견병 오염을 방지하기 위해 RNA 추출 및 역전사에 나선형 테이프를 사용하는 것이 좋습니다. 얼음에 에이전트를 준비, 정기적으로 장갑을 변경, 리보누브리스 무료 재료의 사용과 같은 적절한 취급은 ribonuclease의 도입을 방지하고 RNA의 저하를 제거합니다. 이 절차를 시작하려면, 광견병 의심 조직에서 RNA를 추출, 피부 생검, 타액, 뇌척수액 또는 RABV 감염 된 세포 배양 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로.진행 준비를 마쳤을 때, 필요한 시약을 냉동고에서 제거하고 얼음 위에 보관했습니다. 사용하기 전에 각 시약을 해동하고 소용돌이치십시오. cDNA에 바이러스 RNA의 역전사를 위해 클린룸내 텍스트 프로토콜의 표 1에 설명된 바와 같이 얼음에 대한 각 샘플에 대한 12 마이크로 리터의 반응 혼합과 1.5 밀리리터 원심분리관을 준비한다.파이펫팅 변형을 고려하여 필요한 것보다 적어도 하나의 반응 크기인 마스터 믹스의 볼륨을 준비한 다음 반응 혼합물을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다. 템플릿 룸의 PCR 워크스테이션에서 샘플 또는 제어 중 하나의 8마이크로리터를 반응 믹스에 추가합니다. 양성 조절은 고정 RABV 균주 CVS11에 감염된 세포 배양에서 추출된 RNA이며, 음의 대조군은 Rnase 가 없는 이중 증류수를 함유하고 있다.각 튜브의 내용을 먼저 소용돌이로 혼합한 다음 잠시 원심 분리하여 혼합합니다. 그 후 반응 튜브를 열순환기로 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 cDNA 합성 프로그램을 설정하고 실행합니다.먼저 필요한 시약을 검색하고 사용할 준비가 될 때까지 클린룸에서 얼음을 보관하십시오. 준비가 되면 시약을 해동하고 소용돌이시합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 샘플에 대해 48개의 마이크로리터를 준비하고 반응 혼합을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다.템플릿 룸의 PCR 워크스테이션에서 첫 번째 라운드 PCR 믹스에 cDNA의 마이크로리터 샘플 2개를 추가합니다. CVS11 cDNA의 마이크로리터 2개와 양수 조절으로 이중 증류수 2개의 마이크로리터를 음수 대조군으로 포함시게 한다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개 변수를 사용하여 밀봉 된 튜브를 PCR 열순환기 및 사이클로 전송합니다.시작하려면, 텍스트 프로토콜의 표 4에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 샘플에 대해 각 샘플에 대해 48마이크로리터를 준비하고 반응 혼합을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다. 두 번째 라운드 PCR 믹스에 첫 번째 라운드 PCR 제품의 마이크로 리터 2개를 추가합니다. 이 PCR 라운드에 대한 음의 제어로 이중 증류수를 포함하십시오.그런 다음 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개 변수를 사용하여 PCR 써모사이클링을 수행합니다. 먼저 1.5그램의 아가로즈를 트리스 아세테이트 EDTA 100밀리리터에 넣고 전자레인지에 가열하여 철저히 녹입니다. 다음으로, 최종 농도0.01%의 최종 농도에서 에티듐 브로마이드를 추가하여 젤을 금형에 붓고 30분 이상 주변 온도에서 고화하게 둡니다.각 PCR 제품의 5마이크로리터를 6배 로딩 버퍼 1개에 혼합하여 적재 샘플을 준비합니다. 별도로 샘플과 적합한 DNA 마커를 우물에 적재하고 염료 라인이 젤 아래로 약 75 ~ 80 %가 될 때까지 120 볼트에서 약 30 ~ 45 분 동안 젤을 실행합니다. 실행이 완료되면 전원을 끄고 전원에서 전극을 분리합니다.그런 다음 젤 상자에서 젤을 조심스럽게 제거합니다. UV 젤 문서화 장치를 사용하여 DNA 조각을 시각화하고 촬영합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중첩된 역전사 PCR을 특성화합니다.18개의 리사바이러스 종을 검출하기 위해 대표적인 중첩 된 RT-PCR의 결과가 여기에 나와 있다. PCR 포지티브 컨트롤은 1라운드 증폭에서 845개의 베이스 페어와 2라운드 371개의 베이스 페어로 예상 대역을 보여줍니다. 음수 컨트롤에 대해 어떤 밴드도 볼 수 없습니다.모든 18 Lyssaviruses는 중첩 된 RT-PCR모든 18 Lysaviruses를 검출했음을 나타내는 긍정적 인 제어와 동일한 두 개의 밴드를 생산하는 것으로 보입니다. 플라스미드 중 16개는 PCR 2라운드에서 효율적인 증폭을 가하지만, 그 중 2개, 아라반 바이러스및 이코마 바이러스는 각각 1라운드 또는 2라운드에서만 증폭된다. 이 방법의 감도는 마이크로리터 당 2.24에서 2, 240 분자에 이르는 값에서 다른 Lyssavirus 플라스미드의 검출에 따라 다릅니다.이러한 차이는 바이러스 성 시퀀스 다양성으로 인해 프라이머와 템플릿 간의 불일치에 기인 할 수 있습니다. 중첩 PCR에 의해 테스트되는 임상 표본의 9, 624 뇌 조직을 비교한 결과, RT-PCR을 100%의 감도로 중첩하고 99.97%의 특이성으로 중첩된 것으로 나타났으며, 두 방법 사이의 특성은 99.07%의 다른 광견병 실험실이 99.07%의 다른 광견병 실험실을 통해 중첩된 RT-PCR의 유효성을 검사하도록 초대되었다. 모든 10개의 실험실은 중첩된 RT-PCR 결과, 가중된 RT-PCR이 높은 특이성과 재현성을 가지고 있음을 나타내는 거짓 네거티브 또는 거짓 긍정없이 FAT에 따라 100%인 중첩 된 RT-PCR 결과를 얻었다.RT-PCR은 이제 광견병 기술을 사용하기 위해 OIE에서 권장합니다. 그리고 우리의 중첩 RT-PCR은 2018 년 중국에서 광견병 기술의 국가 표준으로 입증되었습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

반대로 Zika 바이러스 및 내부 관리 유전자 소변, 혈 청, 그리고 모기 샘플에 대 한 분석 결과 전사 루프 중재 하는 등온 증폭 (RT-램프)

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...