Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Studien ble støttet av National Key forskning og utvikling plan (Grant no. 2016YFD0500401) og National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 31302043).

Bruken av mus i denne protokollen ble godkjent av administrative Committee on Animal velferd ved Institutt for militær veterinærmedisin, Academy of Military Medical Sciences, Kina (laboratorium Animal Care og use Committee Authorization, tillate nummer JSY-DW-2010-02). Alle institusjonelle og nasjonale retningslinjer for Stell og bruk av forsøksdyr ble fulgt.
1. RNA-ekstraksjon
<ol><li>Pakk RNA fra rabies-mistenkt hjernevev, hud biopsier, spytt eller CSF eller fra RABV-smittet cellekultur...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Aktuelle, RABV er en større lyssavirus ansvarlig for nær alle human og dyr Rabiat inne Porselen, likeledes idet inne annet land. Dessuten, en IRKV variant var for det første kjennemerke fra en Murina leucogaster bat inne det Jilin område inne nordøst porselen inne 201210, og den har blitt rapportere å anledning en hundene ' død inne det Liaoning område inne 201711. Sist, en roman lyssavirus, TWBLV, ble også identifisert fra en japansk pipistrelle ...

Rabiat er en Worldwide zoonotiske sykdommen forårsaket av viruser innen slekten Lyssavirus1. Lyssaviruses (familie Rhabdoviridae) er single-negative-strandet RNA virus med en ca 12 kb Genova som koder fem proteiner: N, Phosphoprotein (P), matrise protein (M), glykoprotein (G), og det store proteinet eller polymerase (L). Basert på nukleotid sekvenser av det N Gene, genetisk avstand, og antigen mønstre, lyssaviruses ha blitt delt i 16 arter, omfatter klassisk rabiat virus (RABV) og det rabiat-i slekt viruser (RRV): Lagos bat virus (LBV), Duvenhage virus (DUVV ), Mokola virus (MOKV), europeiske bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), australsk bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), Vest kaukasisk bat virus (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), og Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Nylig har to ekstra lyssaviruses blitt identifisert: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolert fra en Brandt ' s bat (Myotis brandtii) i Finland i 20173 og Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) isolert fra en japansk pipistrelle ( Pipistrellus abramus) i Taiwan i Kina i 2016 – 20174.
Alle pattedyr er mottakelige for rabies; men ingen brutto Patognomonisk lesjoner eller spesifikke kliniske tegn tillater sin identifisering, og diagnosen kan bare gjøres i laboratoriet5. Den mest brukte metoden for rabies diagnose er fettet, som regnes som gullstandarden av både WHO og OIE5,6. Likevel, FAT kan produsere upålitelige resultater på degradert/autolysert hjernevev prøver. I tillegg kan den ikke brukes til å analysen biologiske væskeprøver som spinalvæske (CSF), spytt og urin, og dermed i stor grad utelukker sitt arbeid i antemortem diagnose7. Alternativ konvensjonelle diagnostiske tester, for eksempel rabies vev kultur infeksjon test (RTCIT) og musen inoculation test (MIT), krever flere dager6, en stor ulempe når en rask diagnose er viktig.
Ulike molekylære diagnostiske tester (f. eks, påvisning av viral RNA av RT-PCR, den PCR-enzym-tilknyttede immunosorbentanalyse analysen [PCR-ELISA], in situ hybridisering, og sanntids PCR) brukes som raske og følsomme teknikker for rabies diagnose8. RT-PCR er nå anbefalt av OIE for rutinemessig rabies diagnose, og en heminested (HN) PCR er beskrevet i OIE manual for diagnostiske tester og vaksiner for terrestriske dyr å oppdage alle lyssaviruses5. Her beskriver vi en pan-lyssavirus nestet RT-PCR, som gjør at den spesifikke og følsomme deteksjon av alle 18 lyssavirus arter kan sammenlignes med eller overstiger som oppnås ved FAT. Prinsippet for metoden er en RT av målet RNA (bevarte regionen i det lyssavirus N-genet) til cDNA, etterfulgt av forsterkning av cDNA med to runder med PCR. CDNA gjennomgår den første-runde PCR med ytre primere for å forsterke en 845 BP fragment; deretter bruker den andre-runde PCR det første runde PCR-produktet som en mal for å forsterke et 371 BP-fragment med indre primere. De to runder med PCR øker følsomheten til analysen betraktelig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

For å oppdage rabies virus og andre medlems arter i slekten Lyssavirus i familien Rhabdoviridae, den pan-Lyssavirus nestede omvendt transkripsjon polymerase KJEDERE reaksjon (nestede RT-PCR) ble utviklet for å oppdage den bevarte regionen av nucleoprotein (N) gen av lyssaviruses. Metoden gjelder omvendt transkripsjon (RT) ved hjelp av viral RNA som mal og oligo (dT)15 og tilfeldige hexamers som primere for å syntetisere viral komplementær DNA (cDNA). Deretter blir viral cDNA brukt som en mal for å forsterke en 845 BP N gen fragment i første runde PCR ved hjelp av ytre primere, etterfulgt av andre-runde nestede PCR å forsterke den endelige 371 BP fragment ved hjelp av indre primere. Denne metoden kanne merker annerledes genetisk klader av rabiat viruser (RABV). Det godkjenningen, benytter 9 624 hjerne prøver fra åtte hjemmemarked dyr Art inne 10 år av klinisk rabiat diagnoser og overvåking inne Porselen, viste det metoden har 100% følsomheten og 99,97% spesifisitet inne sammenligningen med det direkte fluorescerende antistoff test (FAT), gull standardmetoden anbefalt av verdenshelseorganisasjon (WHO) og World Organization for Animal Health (OIE). I tillegg kan metoden også spesielt forsterke den målrettede N gen fragment av 15 andre godkjente og to romanen lyssavirus arter i 10nde rapporten fra den internasjonale komiteen på taksonomi av virus (ICTV) som evalueres av en etterligne påvisning av syntetisert N gen plasmider av alle lyssaviruses. Metoden skaffer en bekvem alternativ å Basin for rabiat diagnosis og er blitt anerkjent som nasjonal målestokk (GB/T36789-2018) av Porselen.

Resultater av nestede RT-PCR for å oppdage 18 lyssavirus arter er vist i figur 1. Alle PCR-positive kontroller viste den forventede 845 BP i første-og 371 BP i andre runde presiseringer uten band i negativ kontroll. Alle 18 lyssaviruses produserte de forventede 845 og/eller 371 BP band, noe som indikerer at den nestede RT-PCR oppdaget alle 18 lyssaviruses. Seksten lyssaviruses plasmider hadde effektiv forsterkning i to runder av PCR, men to, nemlig ARAV og IKOV, hadde forsterkning i enten ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

En pan-lyssavirus nestede omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon er utviklet for å oppdage spesielt alle kjente lyssaviruses. Godkjenningen benytter rabiat hjerne eksemplar av annerledes dyr Art viste det denne metoden har en følsomheten og spesifisitet ekvivalent å gullet målestokk fluorescerende antistoff test og det kan brukes for praksis rabiat diagnosis.

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Den nestede RT-PCR er utviklet for å oppdage alle Lyssavirus, inkludert alle 16 ICTV-godkjente og to romaner lysesavirusarter. Valideringen av denne metoden har blitt bevist ved å bruke over 9000 dyrehjerneprøver i 10 år med klinisk rabies diagnose og overvåking i Kina. Den nestede RT-PCR kan ikke bare gi troverdig resultat på friske hjernevevsprøver, men også på forringet prøver.Oversvømmelsen denne metoden kan brukes til å analysere biologiske væskeprøver som cerebrospinalvæske, spytt og urin, og dermed kan denne metoden brukes i ultimatumdiagnoser. For å minimere PCR-overføringskontaminering er det viktig å forberede negative og positive kontroller Det er veldig viktig å ta skritt. For hver RNA ekstraksjon trenger forberedelse, PCR satt opp, og gel elektroforese bør opereres i fysisk separate områder.Det anbefales også å bruke spiralbånd i RNA-ekstraksjon og omvendt transkripsjon for å forhindre rabiesforurensning til peptidkjeden. Riktig håndtering som å forberede agentene dine på is, bytte hansker regelmessig, og bruk av ribonuclease frie materialer vil forhindre innføring av ribonuclease og eliminere nedbrytning av RNA. For å begynne denne prosedyren, trekke ut RNA fra rabies mistenktvev, hudbiopsier, spytt, cerebrospinalvæske eller RABV infisert cellekultur som beskrevet i tekstprotokollen.Når du er klar til å fortsette, ta de nødvendige reagensene fra fryseren og hold dem på is. Pass på å tine og vortex hver reagens før bruk. For omvendt transkripsjon av viral RNA til cDNA forberede 12 mikro liter reaksjonsblanding for hver prøve på is og en 1,5 milliliter sentrifuge rør som beskrevet i tabell 1 av tekstprotokollen i et renrom.For å ta høyde for pipetteringsvariasjoner, klargjør et volum av master mix minst en reaksjonsstørrelse større enn nødvendig, og deretter dele reaksjonsblandingen i 0,2 milliliter PCR-rør. Legg til åtte mikroliter av prøven eller en av kontrollene i reaksjonsmiksen i en PCR-arbeidsstasjon i et malrom. Den positive kontrollen er RNA hentet fra cellekulturen infisert med fast-RABV stamme CVS11, mens den negative kontrollen inneholder Rnase-fri dobbeltdestillert vann.Bland innholdet i hvert rør ved første vortexing og deretter ved kort sentrifuging. Etter dette legger du reaksjonsrørene inn i en termocycler. Konfigurer og kjør cDNA-synteseprogrammet som beskrevet i tekstprotokollen.Først må du hente de nødvendige reagensene og holde dem på is i et renrom til de er klare til bruk. Når du er klar, tin og vortex reagensene. Deretter klargjør du 48 mikroliter av første runde PCR-blanding for hver prøve i et 1,5 milliliter sentrifugerør som beskrevet i tabell 2 i tekstprotokollen og deler reaksjonsblandingen i 0,2 milliliter PCR-rør.I en PCR-arbeidsstasjon i et malrom legger du til en to mikrolitersprøve av cDNA i den første runde PCR-blandingen. Inkluder to mikroliter med CVS11 cDNA som en positiv kontroll, og to mikroliter dobbelt destillert vann som en negativ kontroll. Deretter overfører du de forseglede rørene til en PCR termocycler og sykler ved hjelp av parametrene som er oppført i tabell 3 i tekstprotokollen.Til å begynne med klargjør du 48 mikroliter av andre runde PCR-blanding for hver prøve i et 1,5 milliliter sentrifugerør som beskrevet i tabell 4 i tekstprotokollen og deler reaksjonsblandingen i 0,2 milliliter PCR-rør. Legg til to mikroliter av det første runde PCR-produktet i den andre runde PCR-blandingen. Inkluder dobbelt destillert vann som en negativ kontroll for denne runden med PCR.Deretter utfører du PCR-termocycling ved hjelp av parameterne som er oppført i tabell 3 i tekstprotokollen. Først tilsetter du 1,5 gram agarose til 100 milliliter Tris-aceta EDTA og varme den opp i en mikrobølgeovn for å oppløse den grundig. Deretter legger ethidiumbromid ved en endelig konsentrasjon på 0,01%Hell gelen i formen og la den stivne ved omgivelsestemperatur i minst 30 minutter.Forbered lasteprøvene ved å blande fem mikroliter av hvert PCR-produkt med en mikroliter på 6x lastbuffer. Last prøvene separat og egnet DNA-markør inn i brønnene og kjør gelen i ca. 30 til 45 minutter ved 120 volt til fargelinjen er ca. 75 til 80 % ned i gelen. Når løpet er fullført, slår du av strømmen og kobler elektrodene fra strømkilden.Fjern deretter gelen forsiktig fra gelboksen. Bruk en UV gel dokumentere enhet for å visualisere og fotografere DNA fragmenter. Karakterisere den nestede omvendte transkripsjons-PCR-en som beskrevet i tekstprotokollen.Resultatene av en representativ nestet RT-PCR for å oppdage 18 Lyssavirus arter er vist her. PCR-positive kontroller viser det forventede båndet på 845 basispar i første runde forsterkning og på 371 basispar for den andre. Ingen bånd er sett for de negative kontrollene.Alle 18 Lyssavirus er sett på å produsere de samme to båndene som den positive kontrollen, noe som indikerer at den nestede RT-PCR oppdaget alle 18 Lyssavirus. Mens 16 av plasmidene har effektiv forsterkning i to runder med PCR, forsterkes to av dem, Aravan-virus og Ikoma-virus, bare i henholdsvis første eller andre runde. Følsomheten til metoden varierer ved påvisning av forskjellige Lyssavirus plasmider, fra verdier fra 2,24 til 2 240 molekyler per mikroliter.Disse forskjellene kan tilskrives uoverensstemmelsene mellom primere og maler på grunn av viral sekvens mangfold. En sammenligning av 9, 624 hjernevev fra kliniske prøver som testes av nestet PCR versus de som testes med FAT viser at nestet RT-PCR som en følsomhet på 100%og en spesifisitet på 99,97%Samsvaret mellom de to metodene er 99,07% Ti andre rabieslaboratorier ble invitert til å gjennomføre testen for å validere den nestede RT-PCR ytterligere. Alle ti laboratorier oppnådde nestede RT-PCR-resultater som er 100% i samsvar med FAT, uten falske negativer eller falske positiver, noe som indikerer at den nestede RT-PCR har høy spesifisitet og reproduserbarhet.RT-PCR er nå anbefalt av OIE for bruk av rabies teknologier. Og vår nestede RT-PCR har blitt bevist som den nasjonale standarden for rabiesteknologier i Kina i 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret Polymerase Chain Reaction-rflp Genotyping av Toxic Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universell protokoll for store gRNA biblioteket produksjon fra en DNA-kilde

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodikk for nøyaktig påvisning av Mitokondrielt DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Eneste dråpe digitale polymerasekjedereaksjons omfattende og samtidige deteksjon av mutasjoner i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Omvendt transkripsjon-Loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) analysen for Zika Virus og Housekeeping gener i urin, Serum og mygg prøver

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...