Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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O estudo foi apoiado pelo plano nacional de pesquisa e desenvolvimento (Grant no. 2016YFD0500401) e pela Fundação Nacional de ciência natural da China (Grant no. 31302043).

O uso de camundongos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Administrativo de bem-estar animal do Instituto de medicina veterinária militar, a Academia de ciências médicas militares, China (laboratório de cuidados com animais e autorização do Comitê de uso, permitir número JSY-DW-2010-02). Foram seguidas todas as diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. extração de RNA
<ol><li>Extraia o RNA da raiva-tecido de cérebro suspeitado, ...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Atualmente, RABV é um Major lyssavirus responsável por quase toda a raiva humana e animal na China, bem como em outros países. Além, uma variação de IRKV foi identificada primeiramente de um bastão deleucogaster de Murina na província de Jilin em China do nordeste em 201210, e foi relatado para causar a morte de um cão na província de Liaoning em 201711. Mais recentemente, um Lyssavirus novo, TWBLV, foi identificado igualmente de um bastão japon...

A raiva é uma doença zoonótica mundial causada por vírus dentro do gênero lyssavirus1. Os lissavírus (família Rhabdoviridae) são vírus de RNA de cadeia única negativa com um genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) e a grande proteína ou polimerase (L). Baseado em seqüências do nucleotide do gene de N, distância genética, e testes padrões antigénicos, os lyssavirus foram divididos em 16 espécies, compreendendo o vírus de raiva Classical (RABV) e os vírus raiva-relacionados (RRV): vírus do bastão de Lagos (LBV), vírus de Duvenhage (DUVV ), Mokola Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Mónica bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand Virus (KHUV), West Caucasian bat Virus (WCBV), Shimoni bat Virus (SHIBV), e Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Recentemente, foram identificados dois lissavírus adicionais: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolado do morcego de um Brandt (Myotis brandtii) na finlândia em 2017 e3 de Taiwan e lyssavirus morcego (twblv) isolados de um pipistrelle japonês ( Pipistrellus abramus) em Taiwan, China em 2016 – 20174.
Todos os mamíferos são suscetíveis à raiva; Entretanto, nenhuma lesão patognomônico bruta ou sinais clínicos específicos permitem sua identificação, e o diagnóstico só pode ser feito no laboratório5. O método mais utilizado para o diagnóstico da raiva é a gordura, considerada padrão-ouro tanto pela OMS quanto pela OIE5,6. Não obstante, o FAT pode produzir resultados não confiáveis em amostras degradadas/autolyzed do tecido de cérebro. Adicionalmente, não pode ser usado para ensaiar espécimes fluidos biológicos tais como o líquido cerebrospinal (CSF), a saliva, e a urina, desse modo na maior parte impedindo seu emprego no diagnóstico anterior à morte7. Os testes diagnósticos convencionais alternativos, tais como o teste da infecção da cultura do tecido da raiva (RTCIT) e o teste da inoculação do rato (MIT), exigem diversos dias6, uma desvantagem principal quando um diagnóstico rápido é essencial.
Os vários testes diagnósticos moleculars (por exemplo, a deteção do RNA viral pelo RT-PCR, o PCR-enzima-lig o ensaio da imunoabsorção [PCR-ELISA], a hibridação in situ, e o PCR tempo real) são usados como técnicas rápidas e sensíveis para o diagnóstico da raiva8. A RT-PCR é agora recomendada pela OIE para o diagnóstico rotineiro da raiva, e uma PCR heminested (HN) é descrita no manual de testes de diagnóstico e vacinas para animais terrestres da OIE para detectar todos os lissavírus5. Aqui nós descrevemos um RT-PCR aninhado do Pan-lyssavirus, que permita a deteção específica e sensível de todas as 18 espécies do lyssavirus comparáveis ou excedendo aquela obtida pelo FAT. O princípio do método é um RT do RNA alvo (região conservada do gene do lyssavirus N) no cDNA, seguido pela amplificação do cDNA por duas voltas do PCR. O cDNA sofre o PCR de primeira rodada com primers externos para amplificar um fragmento de 845 BP; Então, o segundo-redondo PCR usa o primeiro-redondo produto do PCR como um molde para amplificar um fragmento da BP 371 com primeiras demão internas. As duas rodadas de PCR aumentam significativamente a sensibilidade do ensaio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Para detectar o vírus da raiva e outras espécies-membro do gênero lyssavirus dentro da família Rhabdoviridae, a reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa do Pan-lyssavirus (nested RT-PCR) foi desenvolvida para detectar a região conservada do gene do nucleoproteína (N) dos lyssavirus. O método aplica a transcrição reversa (RT) usando o RNA viral como o molde e o oligo (descolamento)15 e os hexâmeros aleatórios como primers para sintetizar o ADN complementar viral (cDNA). Em seguida, o cDNA viral é usado como um modelo para amplificar um fragmento de gene N 845 BP no PCR de primeira rodada usando primers externos, seguido de PCR Nested segundo round para amplificar o fragmento final de 371 BP usando primers internos. Este método pode detectar diferentes clados genéticos de vírus da raiva (rabv). A validação, usando 9.624 espécimes cerebrais de oito espécies animais domésticos em 10 anos de diagnósticos clínicos de raiva e vigilância na China, mostrou que o método tem 100% de sensibilidade e 99,97% de especificidade em comparação com a fluorescente direta teste de anticorpos (FAT), o método padrão-ouro recomendado pela Organização Mundial da saúde (OMS) e pela Organização Mundial para a saúde animal (OIE). Além disso, o método também poderia ampliar especificamente o fragmento de gene N alvo de 15 outras espécies de lyssavirus aprovadas e duas novas no 10º relatório do Comitê Internacional de taxonomia de vírus (ICTV), avaliada por uma detecção mímica de sintetizados N plasmídeos do gene de todos os lyssavirus. O método fornece uma alternativa conveniente ao FAT para o diagnóstico da raiva e foi aprovado como um padrão nacional (GB/T36789-2018) de China.

Os resultados do RT-PCR aninhado para detectar 18 espécies de lyssavirus são mostrados na Figura 1. Todos os controles positivos de PCR mostraram o esperado 845 BP no primeiro e 371 BP nas amplificações de segunda rodada sem banda no controle negativo. Todos os 18 lyssavirus produziram as 845 e/ou as faixas de 371 BP esperadas, indicando que o RT-PCR aninhado detectou todos os 18 lyssavirus. Dezesseis plasmídeos de lyssavirus tiveram a amplificação eficiente em duas voltas do PCR, mas...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Um Pan-lyssavirus Nested transcrição reversa da polimerase em cadeia foi desenvolvida para detectar especificamente todos os lissavírus conhecidos. A validação utilizando amostras cerebrais da raiva de diferentes espécies animais mostrou que este método tem sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste padrão-ouro de anticorpos fluorescentes e pode ser utilizado para o diagnóstico rotineiro da raiva.

Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

O RT-PCR aninhado foi desenvolvido para detectar todos os Lyssaviruses, incluindo todas as 16 ictv aprovadas e duas novas espécies de Lyssavirus. A validação deste método foi comprovada utilizando mais de 9.000 amostras cerebrais animais em 10 anos de diagnóstico e vigilância clínica da raiva na China. O RT-PCR aninhado não só pode produzir resultados críveis em amostras de tecido cerebral fresco, mas também em amostras degradadas.A inundação deste método pode ser usada para avaliar amostras de fluidos biológicos, como fluido cefalorraquidiano, saliva e urina, assim este método pode ser aplicado em diagnósticos de ultimato. Para minimizar a contaminação por transporte da PCR, é importante preparar controles negativos e positivos É muito importante tomar medidas. Por exemplo, para cada extração de RNA precisa de preparação, a configuração do PCR e a eletroforese de gel devem ser operadas em áreas fisicamente separadas.Também é recomendado o uso de fitas espiral na extração de RNA e transcrição reversa, a fim de evitar a contaminação da raiva na cadeia de peptídeos. O manuseio adequado, como preparar seus agentes no gelo, trocar luvas regularmente e usar materiais livres de ribonuclease, impedirá a introdução de ribonuclease e eliminará a degradação do RNA. Para iniciar este procedimento, extrair o RNA de tecido suspeito de raiva, biópsias de pele, saliva, fluido cefalorraquidiano ou cultura celular infectada pelo RABV, conforme descrito no protocolo de texto.Quando estiver pronto para prosseguir, remova os reagentes necessários do congelador e mantenha-os no gelo. Certifique-se de descongelar e vórtice cada reagente antes de usar. Para transcrição reversa do RNA viral para cDNA prepare 12 micro litros de mistura de reação para cada amostra no gelo e um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 1 do protocolo de texto em uma sala de limpeza.Para explicar as variações de pipetação, prepare um volume de mixagem mestre pelo menos um tamanho de reação maior do que o necessário e, em seguida, divida a mistura de reação em tubos PCR de 0,2 mililitro. Em uma estação de trabalho PCR em uma sala de modelo, adicione oito microliters da amostra ou um dos controles à mistura de reação. O controle positivo é extraído da cultura celular infectada com a cepa CVS11 de rabv fixo, enquanto o controle negativo contém água dupla destilada sem Rnase.Misture o conteúdo de cada tubo pelo primeiro vórtice e, em seguida, por centrifugação breve. Depois disso, carregue os tubos de reação em um termociclador. Configure e execute o programa de síntese cDNA conforme descrito no protocolo de texto.Primeiro, recupere os reagentes necessários e mantenha-os no gelo em uma sala de limpeza até estar pronto para usar. Quando estiver pronto, descongele e vórtice os reagentes. Em seguida, prepare 48 microliters de mix pcr de primeira rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 2 do protocolo de texto e divida a mistura de reação em tubos PCR de 0,2 mililitro.Em uma estação de trabalho PCR em uma sala de modelo, adicione uma amostra de dois microliter do cDNA no mix PCR da primeira rodada. Inclua dois microliters de CVS11 cDNA como um controle positivo, e dois microliters de água dupla destilada como um controle negativo. Em seguida, transfira os tubos selados para um termociclador PCR e pedale usando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto.Para começar, prepare 48 microliters de mix pcr de segunda rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 4 do protocolo de texto e divida a mistura de reação em tubos PCR de 0,2 mililitro. Adicione dois microliters do produto PCR da primeira rodada no mix PCR da segunda rodada. Inclua água dupla destilada como um controle negativo para esta rodada de PCR.Em seguida, execute o termociclismo PCR utilizando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto. Primeiro, adicione 1,5 gramas de agarose a 100 mililitros de Tris-acetato EDTATE e aqueça-o em um forno de micro-ondas para dissolvê-lo completamente. Em seguida, adicione brometo de etídio a uma concentração final de 0,01% Despeje o gel no molde e deixe-o solidificar à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.Prepare as amostras de carregamento misturando cinco microliters de cada produto PCR com um microliter de 6x tampão de carga. Carregue separadamente as amostras e o marcador de DNA adequado nos poços e execute o gel por aproximadamente 30 a 45 minutos a 120 volts até que a linha de corante esteja aproximadamente 75 a 80% abaixo do gel. Quando a corrida estiver concluída, desligue a energia e desconecte os eletrodos da fonte de energia.Em seguida, remova cuidadosamente o gel da caixa de gel. Use um dispositivo de documentação de gel UV para visualizar e fotografar os fragmentos de DNA. Caracterize o PCR de transcrição reversa aninhado conforme descrito no protocolo de texto.Os resultados de um RT-PCR aninhado representativo para detectar 18 espécies de Lyssavirus são mostrados aqui. Os controles positivos do PCR mostram a banda esperada em 845 pares de base na primeira rodada e em 371 pares de base para a segunda. Nenhuma banda é vista para os controles negativos.Todos os 18 Lyssaviruses são vistos produzindo as mesmas duas bandas que o controle positivo, indicando que o RT-PCR aninhado detectou todos os 18 Lyssaviruses. Enquanto 16 dos plasmídeos têm amplificação eficiente em duas rodadas de PCR, dois deles, o vírus Aravan e o vírus Ikoma, são amplificados apenas na primeira ou segunda rodada, respectivamente. A sensibilidade do método varia na detecção de diferentes plasmídeos lyssavírus, de valores que variam de 2,24 a 2.240 moléculas por microliter.Essas diferenças podem ser atribuídas aos desencontros entre os primers e os modelos devido à diversidade de sequências virais. Uma comparação de 9.624 tecidos cerebrais de amostras clínicas que são testadas por PCR aninhado versus aqueles testados com FAT mostra que o RT-PCR aninhado como sensibilidade de 100% e uma especificidade de 99,97%A concordância entre os dois métodos é de 99,07%Dez outros laboratórios de raiva foram convidados a realizar o teste para validar ainda mais o RTD-PCR. Todos os dez laboratórios obtiveram resultados aninhados de RT-PCR que estão 100% de acordo com o FAT, sem falsos negativos ou falsos positivos, indicando que o RT-PCR aninhado tem alta especificidade e reprodutibilidade.O RT-PCR agora é recomendado pela OIE para o uso de tecnologias de raiva. E nosso RT-PCR aninhado foi provado como o padrão nacional de tecnologias antirrábicas na China em 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

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Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

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CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

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