Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Исследование было поддержано национальным ключевым научно-исследовательским планом развития (Грант No. 2016ИД0500401) и национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 31302043).

Использование мышей в этом протоколе был одобрен Административным комитетом по охране животных института военной ветеринарной медицины, Академия военно-медицинских наук, Китай (Лаборатория по уходу за животными и Комитета использования разрешения, разрешение номер JSY-DW-2010-02). Были соб...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

В настоящее время, RABV является одним из основных лизсавирусов, ответственных за почти всех людей и животных, бешенства в Китае, а также в других странах. Кроме того, вариант ИРКВ был впервые идентифицирован с м.урина лойкогстер бат в провинции Цзилинь в северо-восточном Китае в ...

Бешенство-это Всемирная зоонозная болезнь, вызываная вирусами в роду Lyssavirus1. Лисавирусы (Family рхабдовиридае)-ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РНК-вирусы с приблизительно 12 КБ генома, который кодирует пять белков: N, Фосфоровирус (P), матричный белок (M), гликопротеин (G), и большой белок или полимеразы (L). На основе нуклеотидных последовательностей гена N, генетического расстояния и антигенных паттернов, лиссавирусами были разделены на 16 видов, включая классический вирус бешенства (rabv) и вирусы, связанные с бешенством (RRV): Лагос-летучая мышь (LBV), вирус duvenhage (дувв ), Вирус мокола (МОКВ), Европейская летучая мышь (EBLV-1), Европейская летучая мышь-лиссавирус 2 Австралийский летучая мышь (АБК), вирус Аравана (АРАВ), вирус Икама (иков), Бокело Бат-лиссавирус (BBLV), Ганнорува Бат лиссавирус (ГБЛВ), вирус Иркут (ИРКВ), Худжанский вирус (ХУВ), вирус Западно-кавказской летучей мыши (WCBV), вирус Симони bat (SHIBV) и Ллеида Бат-лиссарус (ллеб)2. Недавно были выявлены два дополнительных лисовируса: Kotalahti летучая мышь (KBLV), изолированная от летучей мыши Брандт (Myotis brandtii) в финляндии в 20173 и Тайваньская летучая мышь ЛИССАВИРУС (twblv), изолированный от японского пистрелле ( Пьпипиреллус абрамы) на Тайване, Китай в 2016 – 20174.
Все млекопитающие подвержены бешенству; Однако, никакие грубые патогномонические поражения или специфические клинические знаки не разрешают свою идентификацию, и диагноз можно только сделать в лаборатории5. Наиболее широко используемым методом диагностики бешенства является жир, который считается золотым стандартом как для ВОЗ, так и для МЭБ5,6. Тем не менее, жир может производить ненадежные результаты на деградированных/аутолzed образцов мозговой ткани. Кроме того, он не может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости (ЛИКВОРА), слюны и мочи, тем самым в значительной степени исключая его занятости в антеморной диагностики7. Альтернативные обычных диагностических тестов, таких, как бешенство ткани культуры инфекции тест (РЦКМЭ) и тест инокуляции мыши (MIT), требуют несколько дней6, основным недостатком, когда быстрый диагноз имеет важное значение.
Различные молекулярные диагностические тесты (например, обнаружение вирусной РНК с помощью RT-ЦР, терапия с иммуноферментной инфекцией (ЦР-ИФА), гибридизация на месте и в режиме реального времени (СР), используются в качестве быстрых и чувствительных методов диагностики бешенства8. В настоящее время "RT-ЦР" рекомендуется МЭБ для рутинного диагностирования бешенства, а в руководстве по диагностическим испытаниям и вакцинам для наземных животных МЭБ описано описание всех лисивирусов5. Здесь мы описываем "Пан-лиссавирус", вложенный в-ЦР, что позволяет специфическое и чувствительное обнаружение всех 18 видов лиссавирусов, сопоставимых или превышающих полученные жиром. Принцип метода является RT целевой РНК (сохраняется область лизисавируса N гена) в кДНК, а затем усиление кДНК двумя раундами ЦР. CDNA подвергается в первом раунде КЦР с внешними праймеров, чтобы усилить фрагмент 845 BP; Затем, второй раунд ЦР использует в первом раунде продукта ЦР в качестве шаблона для усиления 371 BP фрагмент с внутренним праймеров. Два раунда ЦР значительно увеличивают чувствительность анализа.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Для обнаружения вируса бешенства и других видов членов рода Лиссавируса в пределах семейства рхабдовиридае, Пан-лиссавирус вложенного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР) был разработан для обнаружения сохранялся регион нуклеопротеин (N) гена лисовивирусов. Метод применяет обратную транскрипцию (RT) с использованием вирусной РНК в качестве шаблона и олиго (dT)15 и случайных гексамеров в качестве праймеров для синтеза вирусной комплементарной ДНК (кДНК). Затем, вирусный cDNA используется в качестве шаблона для усиления 845 BP N фрагмент гена в первом раунде ЦР с использованием внешних праймеров, после второго раунда вложенного КЦР, чтобы усилить окончательный фрагмент 371 BP с использованием внутренней праймеров. Этот метод может обнаруживать различные генетические клады вирусов бешенства (RABV). Проверка, используя 9 624 образцов головного мозга от восьми видов домашних животных за 10 лет клинических диагнозов бешенства и эпиднадзора в Китае, показала, что метод имеет чувствительность 100% и специфичность 99,97% по сравнению с прямым флуоресцентным анализ на антитела (FAT), метод золотого стандарта, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (МЭБ). Кроме того, метод мог бы также специально усилить целевой N фрагмент гена 15 других утвержденных и двух новых видов лизсавирусов в 10-м докладе Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), как оценивается имитирующих обнаружение синтезированных N генных плазмид всех лизовивирусов. Метод обеспечивает удобную альтернативу FAT для диагностики бешенства и был одобрен как Национальный стандарт (GB/T36789-2018) Китая.

Результаты вложенного РТ-СР для обнаружения 18 видов лиссавирусов показаны на рисунке 1. Все положительные элементы контроля показали ожидаемый 845 BP в первом-и 371 BP во втором раунде амплификации без группы в отрицательном контроле. Все 18 лизовивирусы производили Ожидаемы...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Пан-лиссавирус вложенной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции была разработана для обнаружения конкретно все известные лисовивирусы. Проверка с использованием образцов мозга бешенства различных видов животных показали, что этот метод имеет чувствительность и специфичность эквивалентно золотой стандарт флуоресцентного теста на антитела и может быть использован для рутинной диагностики бешенства.

Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Вложенный RT-PCR был разработан для обнаружения всех лиссавирусов, включая все 16 одобренных ICTV и два новых вида лиссавирусов. Проверка этого метода была доказана с помощью более 9000 образцов мозга животных в 10 лет клинической диагностики бешенства и эпиднадзора в Китае. Вложенный RT-PCR может дать достоверный результат не только на свежих образцах тканей мозга, но и на деградированных образцах.Затопление этот метод может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости, слюны и мочи, таким образом, этот метод может быть применен в ультиматум диагнозов. Для того, чтобы свести к минимуму заражение переносом ПЦР, важно подготовить отрицательный и положительный контроль Очень важно принять меры. Например, для каждого извлечения РНК требуется подготовка, ПЦР создан, и гель электрофорез должен работать в физически отдельных областях.Рекомендуется также использовать спиральные ленты при извлечении РНК и обратной транскрипции, чтобы предотвратить заражение бешенством пептидной цепи. Правильное обращение, такие как подготовка агентов на льду, регулярное изменение перчаток, а также использование свободных от рибонуклеазы материалов предотвратит введение рибонуклеазы и устранит деградацию РНК. Чтобы начать эту процедуру, извлечь РНК из бешенства подозреваемых тканей, биопсии кожи, слюны, спинномозговой жидкости или RABV инфицированных клеточной культуры, как указано в текстовом протоколе.Когда готовы приступить, удалить необходимые реагенты из морозильной камеры и держать их на льду. Убедитесь в том, чтобы оттепель и вихрь каждого реагента перед использованием. Для обратной транскрипции вирусной РНК к cDNA подготовить 12 микролитров реакционной смеси для каждого образца на льду и 1,5 миллилитровую центрифугу трубки, как указано в таблице 1 текстового протокола в чистой комнате.Для учета вариаций труб, подготовить объем мастер-микс по крайней мере один размер реакции больше, чем требуется, а затем разделить смесь реакции на 0,2 миллилитров ПЦР труб. В рабочей станции PCR в комнате шаблонов добавьте восемь микролитров либо образца, либо одного из элементов управления в смесь реакции. Положительным элементом контроля является РНК, извлеченная из клеточной культуры, зараженной штаммом CVS11 с фиксированным RABV, в то время как отрицательный контроль содержит двойную дистиллированную воду без Rnase.Смешайте содержимое каждой трубки сначала вихрем, а затем кратко центрифугой. После этого загрузите реакционной трубки в термоциклер. Настройка и запуск программы синтеза cDNA, изложенной в текстовом протоколе.Во-первых, получить необходимые реагенты и держать их на льду в чистой комнате до готовности к использованию. Когда готовы, оттепель и вихрь реагентов. Далее подготовьте 48 микролитров смеси ПЦР первого раунда для каждого образца в 1,5 миллилитрной центрифуге трубки, изложенной в таблице 2 текстового протокола, и разделите смесь реакции на 0,2 миллилитровые трубки ПЦР.В рабочей станции PCR в комнате шаблонов добавьте два микролитровых образца cDNA в смесь PCR первого раунда. Включите два микролитера CVS11 cDNA в качестве положительного контроля, и два микролитера двойной дистиллированной воды в качестве отрицательного контроля. Затем перенесите запечатанные трубки в термоциклер PCR и цикл, используя параметры, перечисленные в таблице 3 текстового протокола.Для начала подготовьте 48 микролитров смеси ПЦР второго раунда для каждого образца в 1,5 миллилитрной центрифуге трубки, изложенной в таблице 4 текстового протокола, и разделите смесь реакции на 0,2 миллилитровые трубки ПЦР. Добавьте два микролитров первого раунда PCR продукта во второй раунд PCR смеси. Включите двойную дистиллированную воду в качестве отрицательного контроля для этого раунда ПЦР.Затем выполните ПЦР-термоциклинг, используя параметры, перечисленные в таблице 3 текстового протокола. Во-первых, добавить 1,5 грамма агарозы до 100 миллилитров Трис-ацетат ЭДТА и нагреть его в микроволновой печи, чтобы растворить его тщательно. Затем добавьте бромид этидия при конечной концентрации 0,01%Налейте гель в форму и оставьте его затвердевать при температуре окружающей среды, по крайней мере 30 минут.Подготовьте образцы загрузки, смешивая пять микролитров каждого продукта ПЦР с одним микролитром буфера загрузки 6x. Отдельно загрузите образцы и подходящий маркер ДНК в скважины и запустите гель в течение примерно 30-45 минут при 120 вольтах, пока линия красителя не составит примерно 75-80%вниз по гелю. Когда пробег будет завершен, выключите питание и отключите электроды от источника питания.Затем аккуратно удалите гель из гелеобразной коробки. Используйте УФ-гель документирования устройства для визуализации и фотографии фрагментов ДНК. Характеризуем вложенный ПЦР обратной транскрипции, изложенный в текстовом протоколе.Здесь показаны результаты репрезентативного вложенного РТ-ПЦР для обнаружения 18 видов лиссавирусов. Положительные элементы управления PCR показывают ожидаемую полосу на 845 базовых парах в первом раунде усиления и на 371 базовых парах для второго. Ни одна полоса не рассматривается для отрицательного контроля.Все 18 лиссавирусов, как видно, производят те же две полосы, что и положительный контроль, что указывает на то, что вложенный RT-PCR обнаружил все 18 лиссавирусов. В то время как 16 плазмидов имеют эффективное усиление в двух раундах ПЦР, два из них, вирус Араван и вирус Икома, усиливаются только в первом или втором раунде, соответственно. Чувствительность метода варьируется при обнаружении различных плазмидов лиссавируса, от значений от 2,24 до 2 240 молекул на микролитер.Эти различия можно отнести к несоответствиям между грунтовки и шаблоны из-за вирусного разнообразия последовательности. Сравнение 9, 624 тканей мозга из клинических образцов, которые проверяются вложенных ПЦР по сравнению с теми, которые протестированы с FAT показывает, что вложенные RT-PCR как чувствительность 100%и специфичность 99,97%В соответствии с двумя методами 99,07%Десять других лабораторий бешенства было предложено провести тест для дальнейшей проверки вложенных RT-PCR. Все десять лабораторий получили вложенные результаты RT-PCR, которые на 100% соответствуют FAT, без ложных негативов или ложных срабатываний, что указывает на то, что вложенный RT-PCR имеет высокую специфичность и воспроизводимость.RT-PCR теперь рекомендуется МВЕ для использования технологий бешенства. И наш вложенный RT-PCR был доказан в качестве национального стандарта технологий бешенства в Китае в 2018 году.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Улучшенная полимеразная цепная реакция-рестрикционного фрагмента полиморфизма длины генотипирование Toxic Pufferfish методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Обратный Assay транскрипции петля опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) для Зика вирус и уборки генов в моче, сыворотки и пробы москитная

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...