Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
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El estudio fue apoyado por el plan nacional clave de investigación y desarrollo (Grant Nº 2016YFD0500401) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant Nº 31302043).

El uso de ratones en este protocolo fue aprobado por el Comité Administrativo de bienestar animal del Instituto de medicina veterinaria militar, la Academia de ciencias médicas militares, China (autorización del Comité de cuidado de animales de laboratorio y uso, permitir número JSY-DW-2010-02). Se siguieron todas las directrices institucionales y nacionales para el cuidado y el uso de animales de laboratorio.
1. extracción de ARN
<ol><li>Extracto de ARN de la rabia-sospecha de tejido ...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Actualmente, RABV es un lissavirus importante responsable de casi toda la rabia humana y animal en China, así como en otros países. Además, una variante de IRKV fue identificada por primera vez a partir de un murciélago Murina leucogaster en la provincia de Jilin en el noreste de China en 201210, y se ha reportado que causó la muerte de un perro en la provincia de Liaoning en 201711. Más recientemente, un nuevo lyssavirus, TWBLV, también fue identif...

La rabia es una enfermedad zoonótica mundial causada por virus en el género lyssavirus1. Los lyssavirus (familia rhabdoviridae) son virus de ARN de cadena única negativa con un genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) y la proteína grande o polimerasa (L). Basándose en secuencias de nucleótidos del gen N, la distancia genética y los patrones antigénicos, los lissavirus se han dividido en 16 especies, que comprenden el virus de la rabia clásica (RABV) y los virus relacionados con la rabia (RRV): virus del murciélago de lagos (LBV), virus de Duvenhage (DUVV ), Virus Mokola (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), lyssavirus murciélago australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), lyssavirus de murciélago Bokeloh (BBLV), lyssavirus Gannoruwa bat (GBLV), virus Irkut (IRKV), Khujand virus (KHUV), el virus del murciélago del Cáucaso occidental (WCBV), el virus del murciélago Shimoni (SHIBV), y el lyssavirus del murciélago de Lleida (LLEBV)2. Recientemente, se han identificado dos lyssavirus adicionales: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) aislado de un murciélago de Brandt (Myotis Brandtii) en finlandia en 20173 y lyssavirus murciélago Taiwán (twblv) aislado de un Pipistrelle japonés ( Pipistrellus abramus) en Taiwán, China en 2016 – 20174.
Todos los mamíferos son susceptibles a la rabia; sin embargo, ninguna lesión patognomónica bruta o signos clínicos específicos permiten su identificación, y el diagnóstico sólo se puede hacer en el laboratorio5. El método más ampliamente utilizado para el diagnóstico de la rabia es la grasa, que se considera como el estándar de oro por la OMS y la OIE5,6. Sin embargo, la FAT puede producir resultados poco fiables en muestras de tejido cerebral degradadas/autolizadas. Además, no se puede utilizar para el ensayo de muestras de fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva y la orina, lo que excluye en gran medida su empleo en el diagnóstico de antemortem7. Las pruebas diagnósticas convencionales alternativas, tales como la prueba de infección del cultivo del tejido de la rabia (RTCIT) y la prueba de inoculación del ratón (MIT), requieren varios días6, un inconveniente importante cuando un diagnóstico rápido es esencial.
Varias pruebas de diagnóstico molecular (p. ej., la detección de ARN viral por RT-PCR, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas PCR [PCR-ELISA], hibridación in situ y PCR en tiempo real) se utilizan como técnicas rápidas y sensibles para el diagnóstico de rabia8. La OIE recomienda ahora la RT-PCR para el diagnóstico rutinario de la rabia, y se describe una PCR heminested (HN) en el manual de pruebas diagnósticas y vacunas para animales terrestres de la OIE para detectar todos los lyssavirus5. Aquí describimos un pan-lyssavirus anidado RT-PCR, que permite la detección específica y sensible de las 18 especies de lyssavirus comparables o superiores a las obtenidas por la grasa. El principio del método es un RT del ARN Diana (región conservada del gen del lyssavirus N) en la cDNA, seguida de la amplificación de la cDNA por dos rondas de PCR. El cDNA sufre el PCR de primera ronda con imprimadores externos para amplificar un fragmento de 845 BP; a continuación, el PCR de segunda ronda utiliza el producto PCR de primera ronda como plantilla para amplificar un fragmento de 371 BP con imprimaciones internas. Las dos rondas de PCR aumentan significativamente la sensibilidad del ensayo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Para detectar el virus de la rabia y otras especies miembro del género lyssavirus dentro de la familia rhabdoviridae, se desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada de pan-lyssavirus (RT-PCR anidada) para detectar la región conservada del gen de la nucleoproteína (N) de los lissavirus. El método aplica la transcripción inversa (RT) utilizando ARN viral como plantilla y oligo (DT)15 y hexámeros tal aleatorios como imprimadores para sintetizar el ADN complementario viral (cDNA). Luego, el cDNA viral se utiliza como una plantilla para amplificar un fragmento de gen 845 BP N en PCR de primera ronda usando imprimadores externos, seguidos por PCR anidada de segunda ronda para amplificar el fragmento final de 371 BP usando imprimadores internos. Este método puede detectar diferentes clados genéticas de virus de la rabia (RABV). La validación, utilizando 9.624 especímenes de cerebro de ocho especies de animales domésticos en 10 años de diagnósticos clínicos de rabia y vigilancia en China, demostró que el método tiene 100% de sensibilidad y 99,97% de especificidad en comparación con la fluorescente directa prueba de anticuerpos (FAT), el método estándar de oro recomendado por la Organización Mundial de la salud (OMS) y la Organización Mundial de sanidad animal (OIE). Además, el método también podría amplificar específicamente el fragmento genético N objetivo de otras 15 especies aprobadas y dos novelas de lyssavirus en el 10º informe del Comité Internacional sobre taxonomía de virus (ICTV), evaluado por una detección mímica de N plásmidos génicos de todos los lyssaviruses. El método proporciona una alternativa conveniente a FAT para el diagnóstico de la rabia y ha sido aprobado como una norma nacional (GB/T36789-2018) de China.

Los resultados de la RT-PCR anidada para detectar 18 especies de lyssavirus se muestran en la figura 1. Todos los controles positivos de PCR mostraron el 845 BP esperado en la primera-y 371 BP en las amplificaciones de la segunda ronda sin banda en el control negativo. Los 18 lyssavirus produjeron las bandas 845 y/o 371 BP esperadas, indicando que el RT-PCR anidado detectó los 18 lyssavirus. Dieciséis plásmidos de los lissavirus tuvieron una amplificación eficiente en ambas rondas de PCR...

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Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Se ha desarrollado una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa de pan-lyssavirus para detectar específicamente todos los lyssavirus conocidos. La validación utilizando muestras cerebrales de rabia de diferentes especies animales demostró que este método tiene una sensibilidad y especificidad equivalente a la prueba de anticuerpos fluorescentes estándar de oro y podría ser utilizado para el diagnóstico de la rabia de rutina.

Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

El RT-PCR anidado ha sido desarrollado para detectar todos los Lyssavirus, incluyendo las 16 especies de Lyssavirus aprobadas por el ICTV y dos nuevas. La validación de este método se ha demostrado mediante el uso de más de 9000 muestras cerebrales animales en 10 años de diagnóstico clínico de la rabia y vigilancia en China. El RT-PCR anidado no sólo puede producir un resultado creíble en muestras de tejido cerebral fresco, sino también en muestras degradadas.La inundación de este método se puede utilizar para ensayar muestras de fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo, la saliva y la orina, por lo que este método se puede aplicar en diagnósticos de ultimátum. Con el fin de minimizar la contaminación por arrastre de PCR, es importante preparar controles negativos y positivos Es muy importante tomar medidas. Por ejemplo, para cada preparación de la extracción de ARN, la configuración de PCR y la electroforesis de gel deben funcionar en áreas físicamente separadas.También se recomienda utilizar cintas espirales en la extracción de ARN y transcripción inversa con el fin de prevenir la contaminación por rabia en la cadena de péptidos. Un manejo adecuado, como preparar a sus agentes sobre hielo, cambiar los guantes regularmente y usar materiales libres de ribonucleasa, evitará la introducción de ribonucleasa y eliminará la degradación del ARN. Para comenzar este procedimiento, extraiga el ARN del tejido sospechoso de rabia, biopsias de piel, saliva, líquido cefalorraquídeo o cultivo celular infectado por RABV como se describe en el protocolo de texto.Cuando esté listo para proceder, retire los reactivos necesarios del congelador y manténgalos en hielo. Asegúrese de descongelar y vórtice cada reactivo antes de usarlo. Para la transcripción inversa del ARN viral a ADNnr prepare 12 micro litros de mezcla de reacción para cada muestra sobre hielo y un tubo centrífugo de 1,5 mililitros como se describe en la Tabla 1 del protocolo de texto en una sala limpia.Para tener en cuenta las variaciones de pipeteo, prepare un volumen de mezcla maestra al menos un tamaño de reacción mayor de lo requerido y, a continuación, divida la mezcla de reacción en tubos PCR de 0,2 mililitros. En una estación de trabajo PCR en una sala de plantillas, agregue ocho microlitros de la muestra o uno de los controles a la mezcla de reacción. El control positivo es ARN extraído del cultivo celular infectado con la cepa de rabv fijo CVS11, mientras que el control negativo contiene agua destilada doble libre de arnés.Mezclar el contenido de cada tubo primero vórtice y luego centrifugando brevemente. Después de esto, cargue los tubos de reacción en un termociclador. Configure y ejecute el programa de síntesis de ADNc como se describe en el protocolo de texto.En primer lugar, recupere los reactivos necesarios y manténgalos sobre hielo en una sala limpia hasta que estén listos para usar. Cuando esté listo, descongele y vórtice los reactivos. A continuación, prepare 48 microlitros de la primera mezcla de PCR redonda para cada muestra en un tubo centrífuga de 1,5 mililitros como se describe en la Tabla 2 del protocolo de texto y divida la mezcla de reacción en tubos PCR de 0,2 mililitros.En una estación de trabajo PCR en una sala de plantillas, agregue una muestra de dos microlitros del ADNc en la primera mezcla de PCR redonda. Incluya dos microlitros de CVS11 cDNA como control positivo, y dos microlitros de agua destilada doble como control negativo. A continuación, transfiera los tubos sellados a un termociclador PCR y circule utilizando los parámetros enumerados en la Tabla 3 del protocolo de texto.Para empezar, prepare 48 microlitros de la mezcla de PCR de segunda ronda para cada muestra en un tubo centrífuga de 1,5 mililitros como se describe en la Tabla 4 del protocolo de texto y divida la mezcla de reacción en tubos PCR de 0,2 mililitros. Agregue dos microlitros del producto PCR de primera ronda a la mezcla de PCR de segunda ronda. Incluya agua destilada doble como control negativo para esta ronda de PCR.A continuación, realice el termociccling PCR utilizando los parámetros enumerados en la Tabla 3 del protocolo de texto. Primero, añadir 1,5 gramos de agarosa a 100 mililitros de Tris-acetato EDTA y calentarlo en un horno microondas para disolverlo a fondo. A continuación, añadir bromuro de etidio a una concentración final de 0,01%Vierta el gel en el molde y déjelo solidificarlo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.Prepare las muestras de carga mezclando cinco microlitros de cada producto PCR con un microlitro de búfer de carga 6x. Cargue por separado las muestras y el marcador de ADN adecuado en los pozos y ejecute el gel durante aproximadamente 30 a 45 minutos a 120 voltios hasta que la línea de tinte esté aproximadamente entre un 75 y un 80% por el gel. Una vez finalizada la ejecución, apague la alimentación y desconecte los electrodos de la fuente de alimentación.A continuación, retire cuidadosamente el gel de la caja de gel. Utilice un dispositivo de documentación de gel UV para visualizar y fotografiar los fragmentos de ADN. Caracterice el PCR de transcripción inversa anidado como se describe en el protocolo de texto.Los resultados de un RT-PCR anidado representativo para detectar 18 especies de Lyssavirus se muestran aquí. Los controles positivos de PCR muestran la banda esperada en 845 pares base en la amplificación de la primera ronda y en 371 pares base para la segunda. No se ve ninguna banda para los controles negativos.Los 18 Lyssavirus se ven para producir las mismas dos bandas que el control positivo, lo que indica que el RT-PCR anidado detectó los 18 Lyssavirus. Mientras que 16 de los plásmidos tienen amplificación eficiente en dos rondas de PCR, dos de ellos, el virus de Aravan y el virus de Ikoma, se amplifican sólo en la primera o segunda ronda, respectivamente. La sensibilidad del método varía en la detección de diferentes plásmidos de lyssavirus, de valores que van de 2.24 a 2, 240 moléculas por microlitro.Estas diferencias se pueden atribuir a las discordancias entre los primeros y las plantillas debido a la diversidad de secuencias virales. Una comparación de 9.624 tejidos cerebrales de muestras clínicas que son probados por PCR anidado frente a los probados con FAT muestra que rt-PCR anidado como una sensibilidad del 100% y una especificidad del 99,97%La conformidad entre los dos métodos es 99,07%Diez otros laboratorios de la rabia fueron invitados a realizar la prueba para validar aún más el RT-PCR anidado. Los diez laboratorios obtuvieron resultados anidados rt-PCR que son 100% de acuerdo con el FAT, sin falsos negativos o falsos positivos, lo que indica que el RT-PCR anidado tiene una alta especificidad y reproducibilidad.RT-PCR ahora es recomendado por la OIE para el uso de tecnologías de rabia. Y nuestro RT-PCR anidado ha sido probado como el estándar nacional de tecnologías de rabia en China en 2018.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Investigación

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...