Name: evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Çalışma ulusal anahtar araştırma ve geliştirme planı (Grant No. 2016YFD0500401) ve Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31302043) tarafından destekleniyordu.

Bu protokolde fareler kullanımı askeri veteriner hekimliği Enstitüsü hayvan refahı Yönetim Komitesi, Askeri Tıp Bilimleri Akademisi, Çin (laboratuar hayvan bakımı ve kullanım Komitesi yetkilendirme, izin tarafından onaylanmıştır numarası JSY-DW-2010-02). Laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için tüm kurumsal ve ulusal yönergeler takip edildi.
1. RNA ekstraksiyonu
<ol><li>Guanidinyum isothiocyanate-fenol-kloroform bazlı ekstraksiyon yöntemleri veya ticari o...

<ol>
	<li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies:+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges.">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li><li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2018.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+in+rabies.">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li><li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies.">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus:+challenges+and+hopes+in+the+21st+century.">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province,+China.">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China:+comparison+across+the+Lyssavirus+genus.">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li><li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans.">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China.">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province,+China.">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li></ol>

Şu anda, rabv Çin 'de neredeyse tüm insan ve hayvan kuduz sorumlu büyük bir Lissavirüse, yanı sıra diğer ülkelerde. Buna ek olarak, bir ıRKV varyantı ilk olarak 201210' da Northeast China 'Daki Jilin eyaletinde Murina leucogaster bat 'tan tespit edildi ve 201711' de Liaoning eyaletinde bir köpeğin ölümüne neden olduğu bildirilmiştir. En son, bir roman Lyssavirus, TWBLV, Ayrıca Tayvan, Çin 'de bir Japon Pipistrelle yarasa tespit edildi ...

Kuduz, Lyssavirus1cinsi içinde virüslerin neden olduğu dünya çapında bir zoonotik hastalıktır. Lyssaviruses (aile Rhabdoviridae), beş proteini kodlayan yaklaşık 12 KB genomu olan tek negatıf telli RNA virüsleridir: N, Fosfoprotein (P), matris proteini (M), glikoprotein (G) ve büyük protein veya polimeraz (L). N geni, genetik mesafe ve antijenik desenlerin nükvendotid dizilerine dayanarak, lyssaviruses klasik kuduz virüsü (RABV) ve kuduz ile ilgili virüsler (RRV) içeren 16 türe bölünmüştür: Lagos bat Virus (LBV), Duvenhage virüsü (DUVV ), Mokola virüsü (mokv), Avrupa bat Lissavirüse 1 (eblv-1), Avrupa bat Lissavirüse 2 (eblv-2), Avustralya bat Lissavirüse (ablv), Aravan virüs (arav), Ikoma virüsü (ıkov), bokeloh bat Lissavirüse (bblv), gannoruwa bat Lissavirüse (gblv), Irkut virüsü (ırkv), Khujand virüs (khuv), Batı Kafkas bat virüs (wcbv), Shimoni bat Virus (shibv), ve Lleida bat Lissavirüse (llebv)2. Son zamanlarda, iki ek lyssaviruses tespit edilmiştir: Kotalahti bat Lissavirüse (KBLV) bir Brandt 's yarasa (Myotis brandtii) içinde Finlandiya 'da 20173 ve Tayvan bat Lissavirüse (twblv) bir Japon Pipistrelle izole () izole Pipistrellus abramus) Içinde Tayvan, Çin içinde 2016 – 20174.
Tüm memeliler kuduz hassastır; Ancak, hiçbir brüt patognomonik lezyonlar veya spesifik klinik belirtiler kimlik izin verir, ve tanı sadece laboratuvarda yapılabilir5. Kuduz tanısı için en yaygın olarak kullanılan yöntem, hem kim hem de OIE5,6tarafından altın standardı olarak kabul edilen yağ şeklindedir. Yine de, FAT bozulabilir/Autolyzed beyin dokusu örnekleri üzerinde güvenilir olmayan sonuçlar üretebilir. Buna ek olarak, beyin omurilik sıvısı (CSF), tükürük ve idrar gibi biyolojik sıvı örneklerinin tahlil edilmesi için kullanılamaz, böylece büyük ölçüde ölüm öncesi tanı7' de istihdamını engelliyor. Alternatif konvansiyonel tanı testleri, kuduz doku kültürü enfeksiyon testi (rtcıt) ve fare aşı testi (MIT) gibi, birkaç gün gerektirir6, hızlı bir tanı gerekli olduğunda büyük bir dezavantajı.
Çeşitli moleküler tanı testleri (örn., RT-PCR tarafından viral RNA tespiti, PCR – enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil [PCR-ELıSA], situ hybridization, ve gerçek zamanlı PCR) kuduz tanısı için hızlı ve hassas teknikler olarak kullanılır8. RT-PCR artık rutin kuduz tanısı için OIS tarafından tavsiye edilir, ve bir heminested (hn) PCR tüm lyssaviruses5algılamak Için tanısal testler ve karasal hayvanlar Için aşılar RIVE Kılavuzu 'nda açıklanmıştır. Burada bir Pan-Lissavirüse iç içe RT-PCR, hangi tüm 18 Lissavirüse türlerin spesifik ve hassas algılama sağlayan veya FAT tarafından elde aşan karşılaştırılabilir tarif. Yöntemin prensibi, cDNA 'ya hedef RNA 'nın (Lissavirüse N geni tarafından bulunan bölge) bir RT 'dir ve ardından iki tur PCR ile cDNA amplifikasyonu tarafından izlenir. CDNA bir 845 BP parçası yükseltmek için dış astar ile ilk yuvarlak PCR uğrar; daha sonra, ikinci tur PCR ilk yuvarlak PCR ürünü bir 371 BP parçası iç astar ile yükseltmek için bir şablon olarak kullanır. PCR iki tur önemli ölçüde tahlil duyarlılığı artar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 &#215; TAE</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">6 &#215; loading buffer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Agarose</td>
			<td style="width:177px;">US Everbright&#174; Inc</td>
			<td style="width:108px;">A-2015-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DL 2,000 Marker</td>
			<td style="width:177px;">Takara</td>
			<td style="width:108px;">3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">dNTPs (2.5 mM)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Electrophoresis System</td>
			<td style="width:177px;">Tanon</td>
			<td style="width:108px;">EPS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Ex-Taq (5 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Imaging System</td>
			<td style="width:177px;">UVITEC</td>
			<td style="width:108px;">Fire Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microcentifuge tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M-MLV reverse transcriptase (200 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2641A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:177px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:108px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">Oligo (dT)15</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:177px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:108px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Tubes</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymearase</td>
			<td style="width:177px;">NEW ENGLAND BioLabs</td>
			<td style="width:108px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pipettors</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Random Primer</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">3801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Inhibitor (40 IU/&#181;L)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:260px;">RNase-free ddH2O</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Taq Buffer (10&#215;)</td>
			<td style="width:177px;">TakaRa</td>
			<td style="width:108px;">9152A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:177px;">Various</td>
			<td style="width:108px;">Various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses

Kuduz virüsü ve aile RhabdoviridaeIçinde cins Lyssavirus diğer üye türlerini algılamak için, Pan-Lyssavirus yuvalanmış Ters transkripsiyon polimeraz zincir REAKSIYONU (Iç Içe RT-PCR) koruma altındaki bölgeyi tespit etmek için geliştirilmiştir lyssaviruses 'in nüklizoprotein (N) geni. Yöntem Ters transkripsiyon uygular (RT) olarak viral RNA kullanarak şablon ve oligo (dT)15 ve rasgele hexamers sentezlemek için astar olarak VIRAL tamamlayıcı DNA (cDNA). Daha sonra, viral cDNA bir 845 BP N gen parçası dış astar kullanarak ilk yuvarlak PCR yükseltmek için bir şablon olarak kullanılan, ikinci tur iç içe PCR tarafından son 371 BP parçası iç astar kullanarak yükseltmek için takip. Bu yöntem, kuduz virüsleri (RABV) farklı genetik klades algılayabilir. Doğrulama, kullanarak 9.624 beyin numuneleri sekiz yerli hayvan türlerinden 10 yıl içinde klinik kuduz teşhis ve gözetim Çin, yöntemi olduğunu gösterdi 100% duyarlılık ve 99,97% özgüllüğü ile karşılaştırıldığında doğrudan floresan antikor testi (FAT), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIS) tarafından önerilen altın standart yöntemdir. Buna ek olarak, yöntem de özellikle% 15 diğer onaylı ve iki roman Lissavirüse türü hedeflenen N gen parçası yükseltmek olabilir 10 rapordaki Uluslararası komitenin taksonomi üzerinde virüslerin (ICTV) sentezlenmiş bir mimik tespiti tarafından değerlendirilir Tüm lyssaviruses, N gen plazmids. Yöntem, kuduz tanısı için FAT 'e uygun bir alternatif sağlar ve Çin 'in Ulusal Standardı (GB/T36789-2018) olarak onaylanmıştır.

18 Lissavirüse türünün tespit edilmesi için yuvalanmış RT-PCR sonuçları Şekil 1' de gösterilir. Tüm PCR pozitif kontroller negatif kontrol hiçbir bant ile ikinci tur amplifikasyonlar ilk-ve 371 BP beklenen 845 BP gösterdi. Tüm 18 lyssaviruses beklenen 845 ve/veya 371 BP bantları, iç içe RT-PCR tüm 18 lyssaviruses algıladı gösteren üretilen. On altı lyssaviruses plazmids PCR iki turda verimli amplifikasyon vardı, ama iki, yani ARAV ve ıKOV, ya ilk veya ikinci tur PCR...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses at JoVE.com

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

İç içe rt-PCR tüm Lyssaviruses tespit etmek için geliştirilmiştir, tüm dahil olmak üzere 16 ICTV onaylı ve iki roman Lyssavirus türleri. Bu yöntemin doğrulanması Çin'de klinik kuduz tanı ve gözetim 10 yıl içinde 9000'den fazla hayvan beyin örnekleri kullanılarak kanıtlanmıştır. İç içe olan RT-PCR sadece taze beyin dokusu örneklerinde değil, aynı zamanda bozulmuş numuneler üzerinde de inandırıcı sonuçlar üretebilir.Bu yöntemin su baskını, beyin omurilik sıvısı, tükürük ve idrar gibi biyolojik sıvı örneklerini tahsin etmek için kullanılabilir, böylece bu yöntem ültimatom tanılarına uygulanabilir. PCR taşıma kontaminasyonunu en aza indirmek için, negatif ve pozitif kontroller hazırlamak önemlidir Adımlar atmak gerçekten önemlidir. Örneğin, her RNA ekstraksiyon için hazırlanması gereken, PCR kurmak ve jel elektroforez fiziksel olarak ayrı alanlarda çalıştırılmalıdır.Ayrıca, peptid zincirinde kuduz kontaminasyonunu önlemek için RNA ekstraksiyonu ve ters transkripsiyonda spiral bantların kullanılması tavsiye edilir. Ajanlarınızı buzüzerinde hazırlamak, eldivenlerinizi düzenli olarak değiştirmek ve ribonükleaz içermeyen malzemelerin kullanılması ribonükleaz girişini önler ve RNA'nın bozulmasını önler. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi kuduz şüphesi doku, deri biyopsisi, tükürük, beyin omurilik sıvısı veya RABV enfekte hücre kültüründen RNA ayıklayın.Devam etmeye hazır olduğunuzda, gerekli reaktifleri dondurucudan alın ve buzda tutun. Kullanmadan önce her reaktifi eritmeye ve girdap haline getirin. CDNA'ya viral RNA'nın ters transkripsiyonu için buz üzerindeki her örnek için 12 mikro litre reaksiyon karışımı ve bir temiz odada metin protokolünün Tablo 1'inde belirtildiği gibi 1,5 mililitrelik santrifüj tüpü hazırlayın.Pipetleme varyasyonlarını hesaba katmak için, gerekenden en az bir reaksiyon boyutu daha büyük bir ana karışım hacmi hazırlayın ve ardından reaksiyon karışımını 0,2 mililitrelik PCR tüplere bölün. Şablon odasındaki bir PCR iş istasyonunda, reaksiyon karışımına numunenin veya kontrollerden birinin sekiz mikrolitresini ekleyin. Pozitif kontrol sabit RABV suşu CVS11 ile enfekte hücre kültüründen çıkarılan RNA ise negatif kontrol Rnase içermeyen çift distile su içerir.Her tüpün içeriğini ilk girdap ve kısa bir süre santrifüj ederek karıştırın. Bundan sonra reaksiyon tüplerini bir termocycler'a yükleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi cDNA sentez programını ayarlayın ve çalıştırın.İlk olarak, gerekli reaktifleri alın ve kullanıma hazır olana kadar temiz bir odada buz üzerinde tutun. Hazır olduğunuzda, çözülme ve girdap reaktifler. Daha sonra, metin protokolünün Tablo 2'sinde belirtildiği gibi 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpteki her numune için 48 mikrolitre ilk yuvarlak PCR karışımı hazırlayın ve reaksiyon karışımını 0,2 mililitreLIK PCR tüplere bölün.Şablon odasındaki bir PCR iş istasyonunda, ilk yuvarlak PCR karışımına iki mikrolitrelik cDNA örneği ekleyin. Pozitif kontrol olarak iki mikrolitre CVS11 cDNA ve negatif kontrol olarak iki mikrolitre çift distile su ekleyin. Ardından, mühürlü tüpleri metin protokolünün Tablo 3'te listelenen parametrelerini kullanarak pcr termocycler ve döngüye aktarın.Başlamak için, metin protokolünün Tablo 4'te belirtildiği gibi 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpteki her numune için 48 mikrolitre ikinci yuvarlak PCR karışımı hazırlayın ve reaksiyon karışımını 0,2 mililitreLIK PCR tüplere bölün. İkinci tur PCR karışımına ilk tur PCR ürününden iki mikrolitre ekleyin. PCR bu tur için negatif bir kontrol olarak çift distile su ekleyin.Daha sonra, metin protokolünün Tablo 3'te listelenen parametreleri kullanarak PCR termobisikletgerçekleştirin. İlk olarak, Tris-asetat EDTA 100 mililitre agarose 1.5 gram ekleyin ve iyice eritmek için bir mikrodalga fırında ısıtın. Daha sonra, %0.01'lik son konsantrasyonda ethidyum bromür ekleyin Jeli kalıba dökün ve en az 30 dakika ortam sıcaklığında katılaşmaya bırakın.Yükleme örneklerini, her PCR ürününden beş mikrolitreyi bir mikrolitre 6x yükleme tamponu ile karıştırarak hazırlayın. Ayrı ayrı kuyulara örnekleri ve uygun DNA belirteci yükleyin ve boya hattı jel aşağı yaklaşık% 75-80 olana kadar 120 volt yaklaşık 30 ila 45 dakika jel çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, gücü kapatın ve elektrotları güç kaynağından ayırın.Daha sonra jeli dikkatlice jel kutusundan çıkarın. DNA parçalarını görselleştirmek ve fotoğraflamak için bir UV jeli belgeleme cihazı kullanın. İç içe geçen ters transkripsiyon PCR'yi metin protokolünde belirtildiği şekilde karakterize edin.18 Lyssavirus türünü tespit etmek için iç içe bir RT-PCR'nin sonuçları burada gösterilmiştir. PCR pozitif kontroller, beklenen bandı ilk turda 845 baz çiftinde ve ikinci turda 371 baz çiftinde gösterir. Negatif kontroller için bant görülmez.18 Lyssaviruse'ın da pozitif kontrolle aynı iki bandı ürettiği görülür ve iç içe geçen RT-PCR'nin 18 Lyssavirüs'ün tümini tespit ettiğini gösterir. Plazmidlerin 16'sı iki tur PCR'de etkili amplifikasyona sahipken, ikisi Aravan virüsü ve Ikoma virüsü sırasıyla birinci veya ikinci turda yükseltilir. Yöntemin duyarlılığı farklı Lyssavirus plazmidlerin saptanmasında, mikrolitre başına 2,24 ile 240 molekül arasında değişen değerlerarasında farklılık gösterir.Bu farklılıklar, viral dizi çeşitliliği nedeniyle astarlar ve şablonlar arasındaki uyuşmazlıklara bağlanabilir. İç içe pcr ile test edilen klinik örneklerden 9,624 beyin dokularının fat ile test edilenlerle karşılaştırılması, iç içe geçen RT-PCR'nin %100 hassasiyet ve özgüllük olarak %99,97 oranında olduğunu göstermektedir. Tüm on laboratuvar, iç içe vraklı RT-PCR'nin yüksek özgüllüğe ve tekrarlanabilirliğe sahip olduğunu gösteren, yanlış negatif veya yanlış pozitif olmayan, FAT'e uygun olarak %100 iç içe RT-PCR sonuçları elde etmiştir.RT-PCR artık Kuduz teknolojilerini kullanmak için OIE tarafından tavsiye edilir. Ve iç içe olan RT-PCR'miz 2018 yılında Çin'de kuduz teknolojilerinin ulusal standardı olarak kanıtlanmıştır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...