Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

تم دعم تانغ ووينتروب جزئيا من قبل NIH-AR070029، NIH-HL086555، NIH-HL134354.

وقد أجريت جميع عمليات التعامل مع الحيوانات والعمليات الجراحية من خلال بروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة أوغوستا. تم تغذية الفئران النظام الغذائي القياسية والمياه الإعلان libitum.
1. عزل الخلايا الليفية الماوس الأولية من الفئرانMdx DM...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparks,+signals+and+shock+absorbers:+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy.">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li><li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors.">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li><li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies.">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy.">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض وراثي مدمر وقاتل في نهاية المطاف يتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤدي إلى ضمور العضلات التدريجي1،2. تظهر نتائجنا التعبير الجيني المزيل المنتم في خلايا السلالة الماجينية المستمدة من DMDmdx iPSC من خلال نهج حذف exon23 من CRISPR/Cas9-بوساطة. ول...

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو واحد من الضمور العضلي الأكثر شيوعا ويتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤثر على 1 من حوالي 5000 الأولاد حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم1. فقدان وظيفة الجينات dystrophin يؤدي إلى عيوب العضلات الهيكلية مما يؤدي إلى انحطاط myofibers التدريجي1,2. وقد تم اختبار فيروس المؤتلف المرتبطة بأدينو (rAAV) بوساطة نظام العلاج الجيني لاستعادة التعبير dystrophin وتحسين وظيفة العضلات، مثل استبدال الجينات باستخدام خلل التوتر الجزئي (μ-Dys). ومع ذلك، فإن نهج rAAV يتطلب حقن متكررة للحفاظ على التعبير عن البروتين الوظيفي3،4. لذلك، نحن بحاجة إلى استراتيجية التي يمكن أن توفر بشكل فعال ودائم استرداد التعبير الجيني dystrophin في المرضى الذين يعانون من DMD. الماوسDMD MDX، نموذج الماوس لDMD، لديه طفرة نقطة في exon 23 من الجينات dystrophin الذي يقدم codon إنهاء سابق لأوانه والنتائج في البروتين المقتطعة غير وظيفية تفتقر إلى C-محطة dystroglycan نطاق ملزم. أظهرت الدراسات الحديثة استخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير الجيني dystrophin عن طريق تصحيح الجينات بدقة أو حذف الطارد اتّصال في الحيوانات الصغيرة والكبيرة5و6و7. أبلغ Long et al.8 عن طريقة تصحيح طفرة الجينات dystrophin في خط الجراثيم الماوس DMDMDX عن طريق إصلاح الموجهة من قبل علم الهولوجي (HDR) القائم على كريسبر / Cas9 تحرير الجينوم. وأفاد الرفاعي وآخرونأن rAAV يمكن أن يقتطع بكفاءة exon 23 متحولة في الفئران عسر التغذية. في هذه الدراسات، تم تصميم gRNAs في الإنترونات 20 و 23 للتسبب في فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتين، والتي استعادت جزئيا التعبير dystrophin بعد إصلاح الحمض النووي عن طريق نهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ). حتى أكثر إثارة, Amoasii وآخرون10 ذكرت مؤخرا فعالية وجدوى rAAV بوساطة كريسبر تحرير الجينات في استعادة التعبير dystrophin في نماذج الكلاب, خطوة أساسية في التطبيق السريري في المستقبل.
DMD يسبب أيضا اضطرابات الخلايا الجذعية11. لتلف العضلات, الخلايا الجذعية العضلات السكنية تجديد خلايا العضلات الموت بعد تمايز العضلات. ومع ذلك، فإن دورات متتالية من الإصابة والإصلاح يؤدي إلى تقصير التيلوميرات في الخلايا الجذعية العضلات12، واستنفاد سابق لأوانه لتجمعات الخلايا الجذعية13،14. ولذلك، يمكن أن يكون مزيج من العلاج بالخلايا الجذعية الذاتية مع تحرير الجينوم لاستعادة التعبير dystrophin نهجا عمليا لعلاج DMD. توفر تقنية CRISPR/Cas9 إمكانية توليد الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC) التي تم تصحيحها وراثياً من أجل تجديد العضلات الوظيفي ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في رفض المناعة. ومع ذلك، iPSCs لديها خطر تشكيل الورم، والتي يمكن تخفيفها من خلال تمايز iPSC في خلايا ذرية myogenic.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام فيروس Sendai غير دمج لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD في iPSCs ومن ثم استعادة التعبير dystrophin عن طريق حذف الجينوم CRISPR /Cas9. بعد التحقق من حذف Exon23 في iPSC عن طريق علم الوراثة، قمنا بتمييز iPSC المصوبة الجينومية في الذرية الميجينية (MPC) عن طريق التمايز الماجينية المستحثة من قبل MyoD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض العضلات التدريجي الحاد الناجم عن الطفرات في جين dystrophin، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى استنفاد خلايا ذرية العضلات. تجميعها بانتظام بين متباعدة قصيرة تكرار باليندروميك / كريسبر المرتبطة 9 (CRISPR / Cas9) تحرير الجينات لديه القدرة على استعادة التعبير عن جين dystrophin. يمكن للخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة ذاتيًا (iPSCs) التي تستمد خلايا العضلات (MPC) تجديد تجمع الخلايا الجذعية/السلفية وإصلاح الأضرار ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في استجابة مناعية. في هذه الدراسة، نقدم مزيج من كريسبر / كاس9 والتكنولوجيات iPSC غير المتكاملة للحصول على الذرية العضلات مع التعبير البروتين dystrophin تعافى. باختصار، نستخدم متجه Sendai غير متكامل لإنشاء خط iPSC من الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD. ثم نستخدم استراتيجية الحذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin من خلال نهاية غير متجانسة الانضمام إلى الجين dystrophin إعادة صياغة. بعد التحقق من استنفاد exon23 exon23 في ثلاث مستعمرات من 94 المستعمرات التي تم اختيارها iPSC، ونحن نميز iPSC في MPC عن طريق doxycycline (دوكس) التي يسببها التعبير MyoD، وهو عامل النسخ الرئيسي يلعب دورا هاما في تنظيم تمايز العضلات. تظهر نتائجنا جدوى استخدام استراتيجية حذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير عن عسر التحجر في MPC المشتقة من iPSC، والتي لديها إمكانات كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية لعلاج DMD.

إنشاء DMDMDX الجلد الليفية المستمدة iPSC. أظهرنا كفاءة توليد iPSCs الماوس من الفئرانDMD MDX المستمدة من الخلايا الليفية الجلد باستخدام ناقلات إعادة برمجة خالية من التكامل. ويبين الشكل 1ألف أن ظهور مستعمرات تشبه الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) في ثلاثة أسابيع ...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

هنا، نقدم بروتوكول حذف exon23 المستندة إلى Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin في iPSC من DMDmdx الخلايا الليفية الجلدية المشتقة من الماوس وتميز مباشرة iPSCs في خلايا ذرية myogenic (MPC) باستخدام نظام تنشيط تيت أون MyoD.

تكنولوجيا كريسبر/كاس9 في استعادة التعبير عن عسر الهضم في مُدَجّن العضلات المشتقة من iPSC

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

دوشين هو ضمور العضلات مما تسبب في استنفاد سابق لأوانه من الخلايا السلف العضلات. وهي واحدة من عسر الهضم الأكثر شدة العضلات. لتعزيز تجديد العضلات الوظيفية، ونحن نستخدم CRISPR / Cas9 بوساطة تحرير الجينات لاستعادة التعبير dystrophin في الخلايا الجذعية المستحثة الخلية الجذعية المشتقة من الخلايا السابقة.إن تحرير الجينات CRISPR-Cas9 لديه القدرة على استعادة التعبير الجيني للديستروفين. يمكن للخلايا سلف العضلات المشتقة من iPSC الذاتية تجديد مسام الخلايا الجذعية وإصلاح الضرر ومنع حدوث مضاعفات أخرى في DMD دون التسبب في استجابة مناعية. عوامل مختلفة من الخلايا iPS في الخلايا بروجينيك ميوجيني خفضت من خطر الورم إعادة التكوين في خلايا iPS.العديد من العلاجات التي تجمع بين الخلايا السلف العضلية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات الذاتية مع تصحيح وراثي بوساطة CRISPR-Cas9 هي استراتيجيات علاج ضمور العضلات الدوشين الواعدة. يمكن استخدام هذه التقنية لعلاج العديد من الأمراض الخلقية عن طريق تحرير الخلايا الجذعية الذاتية وراثيا، بما في ذلك أمراض القلب والدماغ والدم. وأظهرنا دليلا على هذا النهج يمكن أن توفر للقراء مع الخبرة في التعامل مع إعادة برمجة الخلايا وتحرير الجينات، الذي لا يزال يشكل تحديا.تحت مجهر مقلوب، فحص مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية الماوس المصابة. وضع علامة على المستعمرات في الجزء السفلي من الطبق مع علامة الكائن ذاتية التحبير. تطبيق حلقات الاستنساخ مدهون لتغطية مستعمرات الخلية ملحوظ.إضافة 100 ميكرولترات من 0.05٪ تريبسين-EDTA لكل حلقة الاستنساخ ووضع لوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم, نقل الخلايا المهضوية مع نصائح ماصة 100 ميكرولتر إلى لوحات ثقافة 48 جيدا تحتوي على 250 ملليلتر من متوسط نمو MES. احتضان الخلايا في حاضنة درجة 37 مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 85٪.عندما يقرأون التقاء 70٪، حدد الآبار مع خلايا جيدة النمو وإضافة 250 ملليلتر من حل TVP لهضم لمدة 30 دقيقة. ثم، نقل ثقافة الخلية من كل بئر إلى طبق ستة سنتيمترات. كرر تطبيق حلقات الاستنساخ والاحتضان لعدة مرات حتى يتم الحصول على موحدة، والمستنسخات على شكل النوم.الآن، هضم iPSCs الماوس المعد عن طريق إضافة ملليلتر واحد من حل TVP. نقل ثقافة الخلية إلى لوحة 24-well المغلفة مع فيبونكتين وجيلاتين واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الخلايا تصل إلى التقاء 50٪، والتحول إلى 500 ميكرولترات من الثقافة الطازجة المتوسطة التي تحتوي على ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر بوليبرين.ثم، إضافة 100 ميكرولترات من حل جزيئات العدسي فيروس إلى iPSCs الماوس. احتضان الخلايا لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. المقبل, تحديد الحد الأدنى تركيز Blasticidin وHygromycin B الذي هو في نصف معدل القتل في غضون 24 ساعة.إضافة وسائل الإعلام من 2.5 ميكروغرام لكل المليلتر Blasticidin و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر Hygromycin B في الخلايا، والانتظار لمدة ثلاثة أيام، وتحديد الخلايا التي لا تزال تنتظّر كخلايا مصابة طعن. اجسّد الماوس المحدد iPSCs مع 0.5 ملليلتر من حل TVP ، كل بئر في لوحة جديدة من 24 بئرًا ، وخلايا احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم، ماصة iPSCs في خلايا واحدة وعد الخلايا مع غرفة العد خلية.حدد حوالي 150 الخلايا المفردة المهضمة وتمييع مع MES المتوسطة في 10 سم طبق, ثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد حوالي 10 أيام، تحت مجهر مقلوب، واستخدام 10 نصائح الماصات معقم ميكرولتر لاختيار مستعمرات واحدة ونقل كل مستعمرة إلى 50 ميكرولترات من حل TVP في لوحة 96 جيدا. اجسه في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.يعتبر التقاط الاستنساخ اليدوي الموثوق به أمرًا بالغ الأهمية لنجاح حصاد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من نوع CRISPR/Cas9. ثم، نقل وتقسيم الخلايا المهضوية من كل بئر إلى اثنين آخر لوحات ثقافة 96-well. احتضان في 37 درجة مئوية حتى 70٪ التقاء.مع مستعمرات الخلية في التقاء 70٪، وإزالة المتوسطة في لوحة 96-جيدا. إضافة 25 ميكرولترات من كاشف التحلل التي تحتوي على 1٪ محلول البروتين K لكل بئر ونقل lysate إلى آخر 96 جيدا PCR لوحة. ختم لوحة PCR مع الأختام لاصقة واحتضان لوحة في دورة حرارية في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم في 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لlyse الخلايا وdenaturee البروتينات K.Then، في أنبوب PCR، إضافة اثنين من microliters من lysate، 10 ميكرولترات من 2x الحمض النووي بوليميراز بريميكس، 7 ميكرولترات من المياه الخالية من DNase ، و مصغرة واحدة من الزهق DMD Exon23.بدء تفاعل PCR وفقا للمخطوطة. ثم، تحميل تفاعل PCR الموردة مع 2.2 ميكرولترات من تحميل العازلة على هلام agarose 2٪. تشغيل الجل في 100 إلى 150 فولت لمدة 30 دقيقة وفحص هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.في هذا البروتوكول، تم تصميم اثنين من RNAs دليل التي تحيط Exon23 متحولة. بعد كاس 9 بوساطة فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل وغير متجانسة نهاية الانضمام، تم حذف إكسون23 متحولة، مما يسمح للإنتاج Dystrophin اقتطاع ولكن وظيفية. لتجنب تسرب من محلول تريبسين، نحن بحاجة إلى تطبيق الشحوم بالتساوي إلى الجزء السفلي من الحلقات.مزيج من CRISPR / Cas9 الجينوم تحرير مع نظام تنشيط ميود متكت على توفير استراتيجية آمنة ومجدية وفعالة لزرع الذاتية في مرضى ضمور العضلات دوشين مع الخلايا البروجينية القاعدية الانتعاش الجيني.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

الجيل الفعال للhiPSC العصبية النسب مراسلون Knockin معينة باستخدام كريسبر / Cas9 وCas9 مزدوجة نظام Nickase

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر وخط أنابيب حسابي لتحديد الإمكانات الأوعية الدموية لالذرية البطانية المشتقة من iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...