Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang en Weintraub werden deels ondersteund door NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Alle behandelings-en chirurgische procedures voor dieren zijn uitgevoerd door een protocol dat is goedgekeurd door het Comité voor institutionele dierenverzorging en-gebruik van Augusta University (IACUC). Muizen werden gevoed standaard dieet en water ad libitum.
1. isolatie van primaire muizen fibroblasten van volwassen DMDMDX -muizen
<ol><li>Euthanaatie volwassen DMDMDX muizen (mannelijk, 2 maanden oud) door co2 verstikking en Thoracotomie volgens iacuc go...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparks,+signals+and+shock+absorbers:+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy.">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li><li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors.">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li><li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies.">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy.">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een destructieve en uiteindelijk fatale erfelijke aandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan Dystrofine, wat leidt tot progressieve spieratrofie1,2. Onze resultaten tonen de herstelde Dystrofine genexpressie in DMDMDX IPSC-afgeleide myogene voorlopercellen door de aanpak van crispr/Cas9-gemedieerde exon23 deletie. Deze aanpak heeft drie voordelen.
Eerst genereerden we iPSCs van DMD<s...

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een van de meest voorkomende spier dystrofieën en wordt gekenmerkt door de afwezigheid van Dystrofine, die 1 van ongeveer 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd1. Verlies van Dystrofine-genen functie resulteert in structurele spier defecten die leiden tot progressieve myovezels degeneratie1,2. Recombinant Adeno-associated virus (rAAV)-gemedieerd gentherapie systeem is getest om de Dystrofine expressie te herstellen en de spierfunctie te verbeteren, zoals het vervangen van genen met behulp van micro-dystrofines (μ-dys). De raav-benadering vereist echter herhaalde injecties om de expressie van het functionele eiwit3,4te ondersteunen. Daarom hebben we een strategie nodig die een effectief en permanent herstel van Dystrofine genexpressie kan bieden bij patiënten met DMD. De DMDMDX Mouse, een muismodel voor DMD, heeft een puntmutatie in Exon 23 van het Dystrofine gen dat een vroegtijdige beëindiging codon introduceert en resulteert in een niet-functioneel afgeknotte proteïne zonder het C-terminale dystroglycan bindings domein. Recente studies toonden het gebruik van crispr/Cas9 technologie aan om Dystrofine genexpressie te herstellen door nauwkeurige gencorrectie of Mutant Exon deletie in kleine en grote dieren5,6,7. Long et al.8 meldde de methode voor het corrigeren van de Dystrofine-genmutatie in DMDMDX -muis kiembaan door homologie-gestuurde reparatie (HDR) op basis van crispr/Cas9 genoom editing. El Refaey et al.9 meldde dat raav de Mutante Exon 23 in dystrofische muizen efficiënt kon accijns. In deze studies werden grna's ontworpen in de Intron 20 en 23 om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te veroorzaken, die de Dystrofine-expressie gedeeltelijk herstelde na DNA-herstel via niet-homologe eindverbindende (nhej). Nog spannender, Amoasii et al.10 meldde onlangs de werkzaamheid en haalbaarheid van raav-gemedieerde crispr Gene Editing in het herstellen van Dystrofine expressie in Canine modellen, een essentiële stap in toekomstige klinische toepassing.
DMD veroorzaakt ook stamcel aandoeningen11. Voor spier schade, residentiële spier stamcellen vullen stervende spiercellen na spier differentiatie. Echter, de opeenvolgende cycli van letsel en reparatie leiden tot verkorting van telomeren in spier stamcellen12, en vroegtijdige uitputting van stamcel groepen13,14. Daarom kan een combinatie van autologe stamceltherapie met genoom bewerking om Dystrofine expressie te herstellen een praktische benadering zijn voor de behandeling van DMD. De CRISPR/Cas9 technologie biedt de mogelijkheid om autologe genetisch gecorrigeerde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) te genereren voor functionele spier regeneratie en verdere complicaties van DMD te voorkomen zonder immuunafstoting te veroorzaken. Echter, iPSCs hebben een risico van tumorvorming, die kan worden verlicht door de differentiatie van iPSC in myogene voorlopercellen.
In dit protocol beschrijven we het gebruik van het niet-integrerende Sendai-virus om dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen te herprogrammeren in ipscs en vervolgens Dystrofine-expressie te herstellen door crispr/Cas9 genoom verwijdering. Na validatie van Exon23 deletie in iPSC door genotypering, we onderscheiden genoom-gecorrigeerde iPSC in myogene voor ouders (MPC) via MyoD-geïnduceerde myogenic differentiatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige progressieve spierziekte veroorzaakt door mutaties in het Dystrofine gen, wat uiteindelijk leidt tot uitputting van spier voorlopercellen. Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR-geassocieerde 9 (CRISPR/Cas9) genbewerking heeft het potentieel om de uitdrukking van het Dystrofine-gen te herstellen. Autologe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)-afgeleide spier voorlopercellen (MPC) kunnen de stam-/voorloper celpool aanvullen, schade herstellen en verdere complicaties in DMD voorkomen zonder een immuunrespons te veroorzaken. In deze studie introduceren we een combinatie van CRISPR/Cas9 en niet-geïntegreerde iPSC-technologieën om spier voorlopercellen te verkrijgen met teruggewonnen Dystrofine-eiwit expressie. Kort samengevat gebruiken we een niet-integrerende Sendai-vector om een iPSC-lijn op te zetten van dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen. Vervolgens gebruiken we de crispr/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine expressie te herstellen door een niet-homologe eind verbinding van het de Dystrofine gen. Na PCR-validering van exon23 depletie in drie kolonies uit 94 geplukt iPSC-kolonies, onderscheiden we iPSC in MPC door doxycycline (Dox)-geïnduceerde expressie van MyoD, een belangrijke transcriptiefactor die een belangrijke rol speelt bij het reguleren van spier differentiatie. Onze resultaten tonen de haalbaarheid van het gebruik van CRISPR/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine-expressie te herstellen in de met iPSC afgeleide MPC, die een significant potentieel heeft voor het ontwikkelen van toekomstige therapieën voor de behandeling van DMD.

Oprichting van DMDMDX -huid fibroblasten afgeleid IPSC. We toonden de efficiëntie van het genereren van muis iPSCs van DMDMDX muizen afgeleide huid fibroblast met behulp van de integratie-vrije herprogrammering vectoren. Figuur 1a toonde aan dat de verschijning van embryonale stamcel (ESC)-achtige kolonies op drie weken na infectie. We evalueren de efficiëntie van iPSC-inductie door Live alkalische fosfatase (AP) vlek; A...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Hier presenteren we een Cas9-gebaseerd exon23 deletie protocol om Dystrofine expressie in iPSC te herstellen van DMDMDX Mouse-afgeleide huid fibroblasten en direct ipscs te onderscheiden in myogene voorlopercellen (MPC) met behulp van het Tet-on myod activeringssysteem.

CRISPR/Cas9 technologie in het herstellen van Dystrofine expressie in door iPSC afgeleide spier voorlopercellen

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne is een spierdystrofie veroorzaakt voortijdige uitputten van spiervererver voorloper cellen. Het is een van de meest ernstige spierdystrofies. Om een functionele spierregeneratie te bevorderen, gebruiken we CRISPR/Cas9-gemedieerde genbewerking om dystrofineexpressie te herstellen in geïnduceerde pluripotente spiervererverstoorercellen.De CRISPR-Cas9 genbewerking heeft het potentieel om dystrofisch genexpressie te herstellen. Autologe iPSC-afgeleide spiervererveroorzaker cellen kunnen de stamcel porie aanvullen, schade herstellen, en verdere complicaties in DMD voorkomen zonder een immuunrespons te veroorzaken. Verschillende agenten van iPS-cellen in myogene voorlopercellen verminderden het risico op tumorhersenen in iPS-cellen.Verschillende therapieën die autologe Induced Pluripotent Stem Cell-afgeleide spiervererver voortlevercellen combineren met CRISPR-Cas9-gemedieerde genetische correctie beloven Duchenne Spierdystrofie behandeling strategieën. Deze technologie kan worden gebruikt om veel aangeboren ziekten te behandelen door het genetisch bewerken van autologe stamcellen, waaronder hart-, hersen- en bloedziekte. We toonden demonstratie van deze aanpak kan de lezers te voorzien van ervaring in de behandeling van cel herprogrammering en genbewerking, die blijft een uitdaging.Onder een omgekeerde microscoop, onderzoeken de kolonies van geïnfecteerde muis embryonale stamcellen. Markeer de kolonies aan de onderkant van de schotel met de zelf-inktobject marker. Breng ingevette kloonringen aan om de gemarkeerde celkolonies te bedekken.Voeg 100 microliters van 0,05% Trypsin-EDTA toe aan elke kloonring en plaats de plaat vijf minuten in een couveuse op 37 graden Celsius. Breng vervolgens de verteerde cellen met 100-microliter pipettips over naar 48-well kweekplaten met 250 milliliter MES-groeimedium. Incubeer de cellen in de 37 graden Celsius incubator met 5%kooldioxide en 85% vochtigheid.Wanneer ze lezen 70%samenvloeiing, selecteert u de putten met goed gekweekte cellen en voeg 250 milliliter TVP-oplossing toe om gedurende 30 minuten te verteren. Breng vervolgens de celcultuur van elke put over naar een schaal van zes centimeter. Herhaal het aanbrengen van kloonringen en incubatie gedurende meerdere malen totdat uniforme, slaapzaalvormige klonen zijn verkregen.Verteerbaar nu de voorbereide muis-iPSC's door een milliliter TVP-oplossing toe te voegen. Breng de celcultuur over in een 24-put plaat bekleed met Fibronectin en Gelatine en incubeer bij 37 graden Celsius met 5%Kooldioxide. Nadat de cellen 50% samenvloeiing hebben bereikt, schakelt u over op 500 microliter vers kweekmedium met acht microgram per milliliter Polybrene.Voeg vervolgens 100 microliter van de lentivirale deeltjesoplossing toe aan de iPSC's van de muis. Incubeer de cellen gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Bepaal vervolgens de minimale concentratie van Blasticidin en Hygromycine B, die binnen 24 uur met de helft van de dodensnelheid is.Voeg de media van 2,5 microgram per milliliter Blasticidin en 100 microgram per milliliter Hygromycine B in de cellen, wacht drie dagen en selecteer de cellen die blijven hechten als stabling geïnfecteerde cellen. Verteren de geselecteerde muis iPSC's met 0,5 milliliter TVP-oplossing, elk goed in een nieuwe 24-put plaat, en incubaat cellen gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Vervolgens u de iPSC's in enkele cellen pipetten en de cellen tellen met een celtelkamer.Selecteer ongeveer 150 verteerde enkele cellen en verdun met MES medium in 10 centimeter schotel, cultuur op 37 graden Celsius met 5%Kooldioxide. Na ongeveer 10 dagen, onder een omgekeerde microscoop, gebruik 10 microliter steriele pipet tips om enkele kolonies te plukken en elke kolonie over te brengen in 50 microliters van TVP-oplossing in een 96-put plaat. Verteren op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Betrouwbare handmatige klonen plukken is van cruciaal belang voor het succes van het oogsten van CRISPR / Cas9-bewerkte Induced Pluripotent Stamcellen. Breng de verteerde cellen vervolgens over en verdeel ze van elke put in nog eens twee 96-put kweekplaten. Incubeer bij 37 graden Celsius tot 70%confluent.Met de celkolonies bij 70%-samenvloeiing, verwijder het medium in de 96-put plaat. Voeg 25 microliter Lysis reagens met 1%Proteinase K oplossing toe aan elke put en breng het lysaat over naar een andere PCR-plaat met 96-putten. Verzegel de PCR-plaat met kleefzegels en vouw de plaat in een thermisch cycler gedurende 30 minuten af bij 55 graden Celsius en vervolgens 45 minuten op 95 graden Celsius om de cellen te lyseen en de Proteinase K te denatureren. in een PCR-buis, voeg twee microliter van het lysaat, 10 microliter van 2x DNA Polymerase Premix, 7 microliter DNase-vrij water , en een microliter van DMD Exon23 primers.Start de PCR-reactie volgens het manuscript. Laad vervolgens de PCR-reactie die wordt geleverd met 2,2 microliter laadbuffer op een 2%agarose gel. Laat de gel 30 minuten op 100 tot 150 volt draaien en inspecteer de gel onder UV-licht.In dit protocol werden twee gids RNAs ontworpen die de mutant Exon23 flankeren. Na Cas9-gemedieerde dubbelstrengs pauzes en niet-homologe end-joining, mutant Exon23 werd geschrapt, waardoor afgekapte, maar functionele Dystrophin productie. Om te voorkomen dat de lekkage van Trypsin oplossing, moeten we vet gelijkmatig toe te passen op de bodem van de ringen.De combinatie van CRISPR/Cas9 genoombewerking met een geplakt MyoD-activeringssysteem biedt een veilige, haalbare en effectieve strategie voor autologe transplantatie bij Duchenne Spierdystrofiepatiënten met gene recovery basale voorlopercellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...