Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang et Weintraub ont été partiellement soutenus par NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Toutes les interventions chirurgicales et de manipulation des animaux ont été effectuées par un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'Augusta (IACUC). Les souris ont été alimentées régime standard et l'eau ad libitum.
1. Isolement des fibroblastes primaires de souris des souris adultes de Dmdmdx
<ol><li>Euthanasier les souris adultes Dmdmdx (mâle, 2 mois) par asphyxie co2 et thoracot...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire destructrice et finalement mortelle caractérisée par un manque de dystrophine, menant à l'atrophie progressive de muscle1,2. Nos résultats démontrent l'expression rétablie de gène de dystrophin dans les cellules myogenic de progéniture d'iPSC d'iPSC par l'approche de la suppression CRISPR/Cas9-négociée d'exon23. Cette approche présente trois avantages.
<p class="jov...

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est l'une des dystrophies musculaires les plus communes et se caractérise par l'absence de dystrophine, affectant 1 des quelque 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde1. La perte de la fonction de gène de dystrophine a comme conséquence des défauts structurels de muscle menant à la dégénérescence progressive de myofibers1,2. Le système de thérapie génique à médiation adéno-associée (rAAV) a été testé pour restaurer l'expression de la dystrophine et améliorer la fonction musculaire, comme le remplacement des gènes à l'aide de micro-dystrophines(Dys). Cependant, l'approche rAAV nécessite des injections répétées pour soutenir l'expression de la protéine fonctionnelle3,4. Par conséquent, nous avons besoin d'une stratégie qui peut fournir l'expression efficace et permanente de gène de dystrophine dans les patients présentant Le DMD. La souris Dmdmdx, un modèle de souris pour DMD, a une mutation de point dans l'exon 23 du gène de dystrophine qui introduit un codon prématuré de terminaison et a comme conséquence une protéine tronquée non fonctionnelle manquant du domaine de liaison de Dystroglycan C-terminal. Des études récentes ont démontré l'utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression du gène de la dystrophine par correction génétique précise ou suppression d'exon mutant chez les petits et grands animaux5,6,7. Long et coll.8 ont rapporté la méthode pour corriger la mutation du gène de la dystrophine dans la lignée germinale de souris Dmdmdx par réparation dirigée par homologie (HDR) basée sur l'édition du génome CRISPR/Cas9. El Refaey et coll.9 ont rapporté que le rAAV pouvait exciser efficacement l'exon 23 mutant chez les souris dystrophiques. Dans ces études, les gRNAs ont été conçus dans les introns 20 et 23 pour causer des ruptures d'ADN à double brin, qui ont partiellement restauré l'expression de dystrophine après réparation d'ADN par l'intermédiaire de jointure de fin non-homologue (NHEJ). Encore plus excitant, Amoasii et coll.10 ont récemment signalé l'efficacité et la faisabilité de l'édition du gène CRISPR par le rAAV dans la restauration de l'expression de la dystrophine dans les modèles canins, une étape essentielle dans l'application clinique future.
DMD provoque également des troubles des cellules souches11. Pour les dommages musculaires, les cellules souches musculaires résidentielles réapprovisionnent les cellules musculaires mourantes après la différenciation musculaire. Cependant, les cycles consécutifs de blessures et de réparation conduisent à un raccourcissement des télomères dans les cellules souches musculaires12, et l'épuisement prématuré des piscines de cellules souches13,14. Par conséquent, une combinaison de thérapie autologue de cellules souches avec l'édition de génome pour reconstituer l'expression de dystrophine peut être une approche pratique pour traiter DMD. La technologie CRISPR/Cas9 offre la possibilité de générer des cellules souches pluripotentes induites induites génétiquement corrigées autologues (iPSC) pour la régénération fonctionnelle des muscles et prévenir d'autres complications de la DMD sans provoquer de rejet immunitaire. Cependant, les iPSC ont un risque de formation de tumeur, qui pourrait être allégé par la différenciation de l'iPSC en cellules progénitrices myogéniques.
Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation du virus Sendai non-intégration pour reprogrammer les fibroblastes dermiques des souris dmdmdx en iPSCs et récupérons ensuite l'expression de dystrophine par suppression de génome de CRISPR/Cas9. Après validation de la suppression d'Exon23 dans l'iPSC par génotypage, nous avons différencié l'iPSC genome-corrected en progéniteurs myogéniques (MPC) par la différenciation myogène MyoD-induite.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire progressive grave provoquée par des mutations dans le gène de dystrophine, qui mène finalement à l'épuisement des cellules progénitrices de muscle. L'édition génétique de 9 (CRISPR/Cas9) a le potentiel de restaurer l'expression du gène de la dystrophine. Les cellules progénitrices musculaires induites autologues (iPSC) dérivées de cellules musculaires (MPC) peuvent reconstituer la piscine de cellules souches/progénitrices, réparer les dommages et prévenir d'autres complications dans la DMD sans provoquer de réponse immunitaire. Dans cette étude, nous introduisons une combinaison de technologies CRISPR/Cas9 et iPSC non intégrées pour obtenir des progéniteurs musculaires avec l'expression récupérée de protéine de dystrophine. En bref, nous utilisons un vecteur Sendai non-intégration pour établir une ligne iPSC à partir de fibroblastes dermiques de souris Dmdmdx. Nous utilisons ensuite la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression de la dystrophine par une jointure non-homologue du gène recadré de dystrophine. Après la validation de PCR de l'épuisement d'exon23 dans trois colonies de 94 colonies choisies d'iPSC, nous différencions iPSC en MPC par l'expression doxycycline (Dox)-induite de MyoD, un facteur de transcription clé jouant un rôle significatif en réglant la différenciation de muscle. Nos résultats montrent la faisabilité d'utiliser la stratégie de suppression CRISPR/Cas9 pour restaurer l'expression de la dystrophine dans le MPC dérivé de l'iPSC, qui a un potentiel important pour développer de futures thérapies pour le traitement de la DMD.

Établissement des fibroblastes de peau de Dmdmdx dérivés d'iPSC. Nous avons démontré l'efficacité de générer des iPSC de souris à partir de souris Dmdmdx dérivées fibroblaste de peau en utilisant les vecteurs de reprogrammation sans intégration. La figure 1A a démontré que l'apparition de cellules souches embryonnaires (ESC) semblables à des colonies à trois semaines après l'infection. Nous évaluons l'efficacité de l'inducti...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Ici, nous présentons un protocole de suppression d'exon23 basé cas9 pour reconstituer l'expression de dystrophine dans l'iPSC des fibroblastes de peau souris-dérivés de Dmd et différencient directement des iPSC en cellules myogènes de progéniture (MPC) utilisant le système d'activation de Tet-on MyoD.

Technologie CRISPR/Cas9 dans la restauration de l'expression de la dystrophine chez les progéniteurs musculaires dérivés de l'iPSC

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne est une dystrophie musculaire causant un épuisement prématuré des cellules progénitrices musculaires. C’est l’une des dystrophies musculaires les plus sévères. Pour favoriser une régénération musculaire fonctionnelle, nous utilisons l’édition de gènes à base de CRISPR/Cas9 pour restaurer l’expression de la dystrophine dans les cellules progénitrices musculaires induites dérivées des cellules souches pluripotentes.L’édition du gène CRISPR-Cas9 a le potentiel de restaurer l’expression du gène de la dystrophine. Les cellules progénitrices musculaires autologues dérivées de l’iPSC peuvent reconstituer le pore des cellules souches, réparer les dommages et prévenir d’autres complications dans la DMD sans provoquer de réponse immunitaire. Différents agents des cellules iPS dans les cellules progénitrices myogéniques ont réduit le risque de re-genèse tumorale dans les cellules iPS.Plusieurs thérapies qui combinent les cellules progénitrices musculaires induites par les cellules souches pluripotentes autologues avec la correction génétique crispr-cas9-24 sont des stratégies prometteuses de traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. Cette technologie peut être utilisée pour traiter de nombreuses maladies congénitales en éditant génétiquement des cellules souches autologues, y compris le cœur, le cerveau et les maladies du sang. Nous avons montré que la démonstration de cette approche peut fournir aux lecteurs une expérience dans la manipulation de la reprogrammation cellulaire et l’édition de gènes, ce qui reste un défi.Au microscope inversé, examiner les colonies de cellules souches embryonnaires de souris infectées. Marquer les colonies au fond du plat avec le marqueur d’objet auto-en-king. Appliquer des anneaux de clonage graissés pour couvrir les colonies cellulaires marquées.Ajouter 100 microlitres de 0,05% Trypsin-EDTA à chaque anneau de clonage et placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les cellules digérées avec des pointes de pipette de 100 microlitres à des plaques de culture de 48 puits contenant 250 millilitres de milieu de croissance MES. Incuber les cellules dans l’incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 85% d’humidité.Quand ils lisent 70% de confluence, sélectionnez les puits avec des cellules bien cultivées et ajoutez 250 millilitres de solution TVP à digérer pendant 30 minutes. Ensuite, transférez la culture cellulaire de chaque puits à un plat de six centimètres. Répéter l’application d’anneaux de clonage et d’incubation pendant plusieurs fois jusqu’à ce que des clones uniformes en forme de dortoir soient obtenus.Maintenant, digérer les iPSCs de souris préparés en ajoutant un millilitre de solution TVP. Transférer la culture cellulaire dans une plaque de 24 puits recouverte de fibronectine et de gélatine et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après que les cellules atteignent 50% de confluence, passer à 500 microlitres de milieu de culture frais contenant huit microgrammes par millilitre polybrene.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution de particules lentivirales aux iPSCs de souris. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, déterminez la concentration minimale de Blasticidine et hygromycine B qui est à la moitié du taux de mortalité dans les 24 heures.Ajouter le média de 2,5 microgrammes par millilitre blasticidine et 100 microgrammes par millilitre hygromycine B dans les cellules, attendre trois jours, et sélectionnez les cellules qui restent adhérentes comme cellules infectées stabling. Digérer les iPSCs de souris sélectionnés avec 0,5 millilitres de solution TVP, chacun bien dans une nouvelle plaque de 24 puits, et incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, pipette les iPSCs en cellules simples et compter les cellules avec une chambre de comptage cellulaire.Sélectionnez environ 150 cellules individuelles digérées et diluer avec le milieu MES dans un plat de 10 centimètres, la culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après environ 10 jours, sous un microscope inversé, utilisez 10 pointes stériles de pipette de microlitre pour choisir des colonies simples et transférer chaque colonie dans 50 microlitres de solution TVP dans une plaque de 96 puits. Digérer à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Une cueillette manuelle fiable du clonage est essentielle au succès de la récolte des cellules souches pluripotentes induites éditées par CRISPR/Cas9. Ensuite, transférez et divisez les cellules digérées de chaque puits en deux autres plaques de culture de 96 puits. Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à 70% confluent.Avec les colonies cellulaires à 70% de confluence, retirer le milieu dans la plaque de 96 puits. Ajouter 25 microlitres de réattant lysis contenant 1% de solution Proteinase K à chaque puits et transférer le lysate dans une autre plaque PCR de 96 puits. Sceller la plaque PCR avec des joints adhésifs et incuber la plaque dans un cycleur thermique à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant 45 minutes pour lyser les cellules et dénoter la Proteinase K.Then, dans un tube PCR, ajouter deux microlitres du lysate, 10 microlitres de 2x ADN Polymerase Premix, 7 microlitres d’eau sans DNase , et un microlitre d’amorce DMD Exon23.Démarrez la réaction PCR selon le manuscrit. Ensuite, chargez la réaction PCR fournie avec 2,2 microlitres de tampon de chargement sur un gel agarose de 2%. Faire fonctionner le gel de 100 à 150 volts pendant 30 minutes et inspecter le gel sous la lumière UV.Dans ce protocole, deux ARN guides qui flanquent le mutant Exon23 ont été conçus. Après que cas9-23-20-gélifiés de double-brin et non-homologue fin-jointant, exon23 mutant a été supprimé, permettant la production tronquée mais fonctionnelle de dystrophine. Pour éviter la fuite de la solution Trypsin, nous devons appliquer la graisse uniformément au fond des anneaux.La combinaison de l’édition du génome CRISPR/Cas9 avec un système d’activation myoD clouté fournit une stratégie sûre, réalisable et efficace pour la transplantation autologue chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne avec des cellules progénitrices basiques de récupération génétique.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l&#39;CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

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Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

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The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Un modèle 3D in vitro et un pipeline computationnel pour quantifier le potentiel vasculogénique des progéniteurs endothéliaux dérivés de l'iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...