Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang und Weintraub wurden teilweise von NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 unterstützt.

Alle Tierbehandlungen und chirurgischen Eingriffe wurden durch ein Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Augusta genehmigt wurde. Mäuse wurden mit Standarddiät und Wasser ad libitum gefüttert.
1. Isolierung von primären Maus-Fibroblasten von erwachsenen Dmdmdx Mäusen
<ol><li>Euthanisieren Erwachsene Dmdmdx Mäuse (männlich, 2 Monate alt) durch CO2 Erstickung und Thorakotomie nach IACUC gene...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine destruktive und letztlich tödliche Erbkrankheit durch einen Mangel an Dystrophin gekennzeichnet, was zu progressiver Muskelatrophie1,2. Unsere Ergebnisse zeigen die wiederhergestellte Dystrophin-Genexpression in Dmdmdx iPSC-abgeleiteten myogenen Vorläuferzellen durch den Ansatz der CRISPR/Cas9-vermittelten Exon23-Deletion. Dieser Ansatz hat drei Vorteile.
Zunächst haben wir iPSCs a...

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine der häufigsten Muskeldystrophien und zeichnet sich durch das Fehlen von Dystrophin aus, von dem 1 von etwa 5.000 neugeborenen Jungen weltweit betroffen ist1. Der Verlust der Dystrophin-Genfunktion führt zu strukturellen Muskeldefekten, die zu einer progressiven Myofiberdegeneration1,2führen. Das rekombinante adenoassoziierte Virus (rAAV)-vermittelte Gentherapiesystem wurde getestet, um die Dystrophinexpression wiederherzustellen und die Muskelfunktion zu verbessern, wie z. B. Genersatz mittels Mikrodystrophine (-Dys). Der rAAV-Ansatz erfordert jedoch wiederholte Injektionen, um die Expression des funktionellen Proteins3,4aufrechtzuerhalten. Daher brauchen wir eine Strategie, die eine effektive und dauerhafte Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression bei Patienten mit DMD bietet. Die Dmdmdx Maus, ein Mausmodell für DMD, hat eine Punktmutation in exon 23 des Dystrophin-Gens, die ein vorzeitiges Beendigungscodon einführt und zu einem nicht-funktionellen abgeschnittenen Protein führt, das nicht die C-terminale dystroglygische Bindungsdomäne enthält. Jüngste Studien haben den Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression durch genaue Genkorrektur oder mutierte Exon-Deletion bei kleinen und großen Tieren5,6,7gezeigt. Long et al.8 berichtete über die Methode zur Korrektur der Dystrophin-Genmutation in Dmdmdx Mauskeimbahn durch homology-directed repair (HDR) basierte CRISPR/Cas9 Genombearbeitung. El Refaey et al.9 berichteten, dass rAAV das mutierte Exon 23 bei dystrophischen Mäusen effizient verbrauchen konnte. In diesen Studien wurden gRNAs in den Introns 20 und 23 entwickelt, um doppelsträngige DNA-Brüche zu verursachen, die die Dystrophinexpression nach DNA-Reparatur über nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) teilweise wiederhergestellt haben. Noch spannender ist, dass Amoasii et al.10 kürzlich über die Wirksamkeit und Machbarkeit der rAAV-vermittelten CRISPR-Genbearbeitung bei der Wiederherstellung der Dystrophinexpression in Canine-Modellen berichtet haben, ein wesentlicher Schritt in der zukünftigen klinischen Anwendung.
DMD verursacht auch Stammzellstörungen11. Bei Muskelschäden füllen die muskuchen Muskelstammzellen nach der Muskeldifferenzierung sterbende Muskelzellen auf. Jedoch, die aufeinanderfolgenden Zyklen der Verletzung und Reparatur führen zu Verkürzung der Telomere in Muskelstammzellen12, und vorzeitige Erschöpfung der Stammzellbecken13,14. Daher kann eine Kombination aus autologer Stammzelltherapie mit Genombearbeitung zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression ein praktischer Ansatz zur Behandlung von DMD sein. Die CRISPR/Cas9-Technologie bietet die Möglichkeit, autologe genetisch korrigierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zur funktionellen Muskelregeneration zu erzeugen und weitere Komplikationen von DMD zu verhindern, ohne eine Immunabstoßung zu verursachen. IPSCs haben jedoch ein Risiko für eine Tumorbildung, die durch die Differenzierung von iPSC in myogene Vorläuferzellen gemildert werden könnte.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung des nicht integrierenden Sendai-Virus zur Umprogrammierung dermaler Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen in iPSCs und dann die Dystrophinexpression durch CRISPR/Cas9-Genomlöschung. Nach der Validierung der Exon23-Deletion bei iPSC durch Genotypisierung differenzierten wir genomkorrigiertes iPSC in myogene Vorläufer (MPC) über MyoD-induzierte myogene Differenzierung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere progressive Muskelerkrankung, die durch Mutationen im Dystrophin-Gen verursacht wird, was letztlich zur Erschöpfung der Muskelvorläuferzellen führt. Die regelmäßig interspaceed short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) Genbearbeitung hat das Potenzial, die Expression des Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Autologinduzierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) abgeleitete Muskelvorläuferzellen (MPC) können den Stamm-/Vorläuferzellpool auffüllen, Schäden reparieren und weitere Komplikationen in DMD verhindern, ohne eine Immunantwort zu verursachen. In dieser Studie führen wir eine Kombination aus CRISPR/Cas9 und nicht integrierten iPSC-Technologien ein, um Muskelvorläufer mit wiedergewonnener Dystrophin-Proteinexpression zu erhalten. Kurz gesagt, verwenden wir einen nicht integrierenden Sendai-Vektor, um eine iPSC-Linie aus dermalen Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen zu erstellen. Wir verwenden dann die CRISPR/Cas9-Löschstrategie, um die Dystrophinexpression durch eine nicht-homologe Endverbindung des regerahmten Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Nach der PCR-Validierung der Exon23-Erschöpfung in drei Kolonien aus 94 ausgewählten iPSC-Kolonien differenzieren wir iPSC in MPC durch Doxycyclin (Dox)-induzierte Expression von MyoD, einem wichtigen Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Muskeldifferenzierung spielt. Unsere Ergebnisse zeigen die Durchführbarkeit der Verwendung der CRISPR/Cas9-Löschstrategie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleitetem MPC, die ein erhebliches Potenzial für die Entwicklung zukünftiger Therapien zur Behandlung von DMD hat.

Etablierung von Dmdmdx Haut-Fibroblasten abgeleitet iPSC. Wir demonstrierten die Effizienz der Erzeugung von Maus-iPSCs von Dmdmdx-Mäusen abgeleiteten Haut-Fibroblasten mit den integrationsfreien Reprogrammierungsvektoren. Abbildung 1A zeigte, dass das Auftreten embryonaler Stammzellen (ESC)-ähnliche Kolonien drei Wochen nach der Infektion. Wir bewerten die Effizienz der iPSC-Induktion durch lebende alkalische Phosphatase (AP) Fleck; <strong...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.

CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne ist eine Muskeldystrophie, die vorzeitige Erschöpfung der Muskelvorläuferzellen verursacht. Es ist eine der schwersten Muskeldystrophien. Um eine funktionelle Muskelregeneration zu fördern, verwenden wir CRISPR/Cas9-vermittelte Genbearbeitung, um die Dystrophinexpression in induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Muskelvorläuferzellen wiederherzustellen.Die CRISPR-Cas9 Genbearbeitung hat das Potenzial, die Dystrophin-Genexpression wiederherzustellen. Autologe iPSC-abgeleitete Muskelvorläuferzellen können die Stammzellpore auffüllen, Schäden reparieren und weitere Komplikationen in DMD verhindern, ohne eine Immunantwort zu verursachen. Verschiedene Wirkstoffe von iPS-Zellen in myogenen Vorläuferzellen reduzierten das Risiko einer Tumor-Regenese in iPS-Zellen.Mehrere Therapien, die autologe induzierte Pluripotente Stammzell-abgeleitete Muskelvorläuferzellen mit CRISPR-Cas9-vermittelter genetischer Korrektur kombinieren, versprechen Duchenne-Muskeldystrophie-Behandlungsstrategien. Diese Technologie kann verwendet werden, um viele angeborene Krankheiten durch die genetische Bearbeitung autologer Stammzellen, einschließlich Herz-, Gehirn- und Blutkrankheiten, zu behandeln. Wir haben gezeigt, dass die Demonstration dieses Ansatzes den Lesern Erfahrung im Umgang mit Zellumprogrammierung und Genbearbeitung bieten kann, was eine Herausforderung bleibt.Untersuchen Sie unter einem invertierten Mikroskop die Kolonien infizierter embryonaler Mausstammzellen. Markieren Sie die Kolonien am boden der Schale mit dem selbstfänzigen Objektmarker. Tragen Sie gefettete Klonringe auf, um die markierten Zellkolonien abzudecken.Fügen Sie 100 Mikroliter 0,05%Trypsin-EDTA zu jedem Klonring hinzu und legen Sie die Platte fünf Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Dann übertragen Sie die verdauten Zellen mit 100-Mikroliter-Pipettenspitzen auf 48-Well-Kulturplatten, die 250 Milliliter MES-Wachstumsmedium enthalten. Inkubieren Sie die Zellen im 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid und 85% Feuchtigkeit.Wenn sie 70% Konfluss lesen, wählen Sie die Brunnen mit gut gewachsenen Zellen und fügen Sie 250 Milliliter TVP-Lösung für 30 Minuten zu verdauen. Übertragen Sie dann die Zellkultur von jedem Brunnen auf ein Sechs-Zentimeter-Gericht. Wiederholen Sie das Auftragen von Klonringen und der Inkubation für mehrere Male, bis einheitliche, wohnheimförmige Klone erhalten sind.Verdauen Sie nun die vorbereiteten Maus-iPSCs, indem Sie einen Milliliter TVP-Lösung hinzufügen. Übertragen Sie die Zellkultur in eine 24-Well-Platte, die mit Fibronectin und Gelatine beschichtet ist, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nachdem die Zellen 50% Konfluss erreicht haben, wechseln Sie zu 500 Mikroliter frischem Kulturmedium, das acht Mikrogramm pro Milliliter Polybren enthält.Fügen Sie dann 100 Mikroliter der lentiviralen Partikellösung zu den mausiPSCs hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für drei Tage bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes bestimmen Sie die minimale Konzentration von Blasticidin und Hygromycin B, die bei der halben Killrate innerhalb von 24 Stunden ist.Fügen Sie die Medien von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin B in die Zellen, warten Sie drei Tage, und wählen Sie die Zellen, die als Stabilisatoren infizierter Zellen haften bleiben. Verdauen Sie die ausgewählten Maus-iPSCs mit 0,5 Milliliter TVP-Lösung, die jeweils gut in einer neuen 24-Well-Platte enthalten, und brüten Sie Zellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Anschließend pipette die iPSCs in einzelne Zellen und zählen die Zellen mit einer Zellzählkammer.Wählen Sie etwa 150 verdaut Einzelzellen und verdünnen Sie mit MES-Medium in 10-Zentimeter-Schale, Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid. Nach etwa 10 Tagen, unter einem invertierten Mikroskop, verwenden Sie 10 Mikroliter sterile Pipettenspitzen, um einzelne Kolonien zu pflücken und jede Kolonie in 50 Mikroliter TVP-Lösung in einer 96-Well-Platte zu übertragen. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius verdauen.Zuverlässige manuelle Klonung ist entscheidend für den Erfolg der Ernte von CRISPR/Cas9-bearbeiteten induzierten Pluripotenten Stammzellen. Dann übertragen und teilen Sie die verdauten Zellen aus jedem Brunnen in zwei weitere 96-Well-Kulturplatten. Bei 37 Grad Celsius bis 70% konfluent inkubieren.Mit den Zellkolonien bei 70%Konfluss entfernen Sie das Medium in der 96-Well-Platte. Fügen Sie 25 Mikroliter Lysis-Reagenz mit 1%Proteinase-K-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und übertragen Sie das Lysat auf eine weitere 96-Well-PCR-Platte. Versiegeln Sie die PCR-Platte mit Klebedichtungen und inkubieren Sie die Platte in einem thermischen Cycler bei 55 Grad Celsius für 30 Minuten und dann bei 95 Grad Celsius für 45 Minuten, um die Zellen zu lysieren und die Proteinase K.Then, in einem PCR-Rohr, fügen Sie zwei Mikroliter des Lysats, 10 Mikroliter 2x DNA Polymerase Premix, 7 Mikroliter DNase-freies Wasser hinzu. und einen Mikroliter DMD Exon23 Primer.Starten Sie die PCR-Reaktion entsprechend dem Manuskript. Dann laden Sie die pcR-Reaktion, die mit 2,2 Mikroliter Ladepuffer versorgt wird, auf ein 2%Agarose-Gel. Führen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 100 bis 150 Volt und inspizieren Sie das Gel unter UV-Licht.In diesem Protokoll wurden zwei Führungs-RNAs entworfen, die den mutierten Exon23 flankieren. Nach Cas9-vermittelten Doppelsträngigenpausen und nicht-homologe Endverbindung wurde der mutierte Exon23 gelöscht, was eine abgeschnittene, aber funktionelle Dystrophin-Produktion ermöglichte. Um das Auslaufen der Trypsin-Lösung zu vermeiden, müssen wir Fett gleichmäßig auf den Boden der Ringe auftragen.Die Kombination von CRISPR/Cas9 Genombearbeitung mit einem aufgehefteten MyoD-Aktivierungssystem bietet eine sichere, praktikable und effektive Strategie für die autologe Transplantation bei Duchenne-Muskeldystrophie-Patienten mit Gen-Recovery-Basalvorläuferzellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...