Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

तांग और Weintraub आंशिक रूप से NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 द्वारा समर्थित थे.

सभी पशु हैंडलिंग और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं अगस्ता विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल द्वारा प्रदर्शन किया गया. चूहे मानक आहार और पानी विज्ञापन libitum ख...

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	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

Duchenne पेशी Dystrophy (DMD) एक विनाशकारी और अंततः घातक वंशानुगत रोग डिस्ट्रोपिन की कमी की विशेषता है, प्रगतिशील मांसपेशी शोष के लिए अग्रणी1,2. हमारे परिणाम CRISPR/Cas9-मध्यस्थ exon23 विलोपन के दृष्टिकोण ?...

Duchenne मांसपेशियों dystrophy (DMD) सबसे आम मांसपेशियों dystrophies में से एक है और dystrophin की अनुपस्थिति की विशेषता है, दुनिया भर में लगभग 5,000 नवजात लड़कों में से 1 को प्रभावित1. डाइस्ट्रोपिन जीन समारोह की कमी के परिणामस्वरूप संरचनात्मक मांसपेशी दोष होते हैं जिससे प्रगतिशील मायोफाइबर अध: पतन1,2. रिकॉमबिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएएवी)-मध्यस्थ जीन थेरेपी सिस्टम का परीक्षण डाइस्ट्रोपिन अभिव्यक्ति को बहाल करने और मांसपेशियों के समारोह में सुधार करने के लिए किया गया है, जैसे कि माइक्रो-डाइस्ट्रोफिन का उपयोग करके जीन प्रतिस्थापन (जेड-Dys)। तथापि, आरएवी दृष्टिकोण को कार्यात्मक प्रोटीन 3,4 की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए बार-बार इंजेक्शन की आवश्यकता होतीहै। इसलिए, हम एक रणनीति है कि प्रभावी ढंग से प्रदान कर सकते हैं और स्थायी रूप से DMD के साथ रोगियों में dystrophin जीन अभिव्यक्ति ठीक की जरूरत है. Dmdmdx माउस, DMD के लिए एक माउस मॉडल, dystrophin जीन के exon 23 में एक बिंदु उत्परिवर्तन है कि एक समय से पहले समाप्ति codon परिचय और एक गैर कार्यात्मक छोटा प्रोटीन सी-टर्मिनल dystroglycan बाध्यकारी डोमेन की कमी में परिणाम है. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि छोटे औरबड़ेजानवरोंमें सटीक जीन सुधार या उत्परिवर्ती एक्सोन विलोपन द्वारा डिस्ट्रोपिन जीन अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9 तकनीक का उपयोग किया गया है. लांग एट अल8 ने होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) आधारित CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन द्वारा Dmdmdx माउस germline में डिस्ट्रोफिन जीन उत्परिवर्तन को सही करने की विधि की सूचना दी। एल Refaey एट अल9 की सूचना दी है कि rAAV कुशलतापूर्वक उत्परिवर्ती exon 23 dystrophic चूहों में उत्पाद निकाल सकता है. इन अध्ययनों में, gRNAs introns में डिजाइन किए गए थे 20 और 23 डबल-स्ट्रेस्ड डीएनए टूट जाता है, जो आंशिक रूप से गैर-homologous अंत में शामिल होने के माध्यम से डीएनए की मरम्मत के बाद dystrophin अभिव्यक्ति बहाल (NHEJ). इससे भी अधिक रोमांचक, Amoasii एटअल. 10 हाल ही में प्रभावकारिता और canine मॉडल, भविष्य नैदानिक आवेदन में एक आवश्यक कदम में dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने में rAAV-मध्यस्थ CRISPR जीन संपादन की व्यवहार्यता की सूचना दी.
DMD भी स्टेम सेल विकारों का कारण बनताहै 11. मांसपेशियों की क्षति के लिए, आवासीय मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं मांसपेशियों भेदभाव के बाद मर मांसपेशी कोशिकाओं की भरपाई. तथापि, चोट और मरम्मत के लगातार चक्र से मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं में टेलोमर्स का आकारकमहो जाता है , और स्टेम सेल पूल13,14की समय पूर्व कमी होती है . इसलिए, dystrophin अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए जीनोम संपादन के साथ autologous स्टेम सेल थेरेपी का एक संयोजन DMD के इलाज के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण हो सकता है. CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी कार्यात्मक मांसपेशी पुनर्जनन के लिए autologous आनुवंशिक रूप से सही प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) पैदा करने की संभावना प्रदान करता है और प्रतिरक्षा अस्वीकृति के कारण के बिना DMD के आगे जटिलताओं को रोकने. हालांकि, iPSCs ट्यूमर गठन का खतरा है, जो myogenic जनक कोशिकाओं में iPSC के भेदभाव से कम किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम DMdmdx चूहों के dermal फाइब्रोब्लास्ट्स iPSCs में reprogramming और फिर CRISPR/Cas9 जीनोम विलोपन द्वारा dystrophin अभिव्यक्ति ठीक करने के लिए गैर एकीकृत Sendai वायरस के उपयोग का वर्णन. जीनोटाइपिंग द्वारा iPSC में Exon23 विलोपन के सत्यापन के बाद, हम MyoD प्रेरित myogenic भेदभाव के माध्यम से myogenic संतति (एमपीसी) में जीनोम-सुधारित iPSC विभेदित.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

Duchenne मांसपेशियों dystrophy (DMD) एक गंभीर प्रगतिशील मांसपेशी रोग dystrophin जीन में उत्परिवर्तन के कारण है, जो अंततः मांसपेशियों की संतान कोशिकाओं की थकावट की ओर जाता है. क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल वाले लघु पैलिड्रोमिक दोहराता है/CRISPR-संबद्ध 9 (CRISPR/Cas9) जीन संपादन में डाइस्ट्रोपिन जीन की अभिव्यक्ति को बहाल करने की क्षमता है। ऑटोलॉगस प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)-derived मांसपेशी जनक कोशिकाओं (एमपीसी) स्टेम / जनक सेल पूल की भरपाई कर सकते हैं, क्षति की मरम्मत, और एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण के बिना DMD में आगे जटिलताओं को रोकने. इस अध्ययन में, हम बरामद डिस्ट्रोफिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ मांसपेशी जनक प्राप्त करने के लिए CRISPR/Cas9 और गैर एकीकृत iPSC प्रौद्योगिकियों का एक संयोजन पेश करते हैं। संक्षेप में, हम Dmdmdx चूहों के dermal फाइब्रोब्लास्ट्स से एक iPSC लाइन स्थापित करने के लिए एक गैर एकीकृत Sendai वेक्टर का उपयोग करें. फिर हम एक गैर-समजात अंत reframed dystrophin जीन के शामिल होने के माध्यम से dystrophin अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9 विलोपन रणनीति का उपयोग करें. 94 उठाया iPSC कालोनियों से तीन कालोनियों में exon23 कमी के पीसीआर सत्यापन के बाद, हम myoD के doxycycline (Dox)-प्रेरित अभिव्यक्ति द्वारा एमपीसी में iPSC अंतर, एक प्रमुख प्रतिलेखन कारक मांसपेशियों भेदभाव को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है. हमारे परिणाम iPSC व्युत्पन्न MPC में डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9 विलोपन रणनीति का उपयोग करने की व्यवहार्यता दिखाते हैं, जिसमें डीएमडी के उपचार के लिए भविष्य के उपचारों के विकास की महत्वपूर्ण क्षमता है।

Dmdmdx त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स की स्थापना iPSC व्युत्पन्न. हम Dmdmdx चूहों से माउस iPSCs उत्पन्न करने की दक्षता का प्रदर्शन किया एकीकरण मुक्त reprogramming वैक्टर का उपयोग कर त्वचा फाइब्रोब्लास्ट व्युत्?...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

यहाँ, हम Dmdmdx माउस व्युत्पन्न त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से iPSC में dystrophin अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए एक Cas9 आधारित exon23 विलोपन प्रोटोकॉल पेश करते हैं और सीधे myogenic जनक कोशिकाओं में iPSCs अंतर (MPC) Tet-on MyoD सक्रियण प्रणाली का उपयोग कर.

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी iPSC में Dystrophin अभिव्यक्ति बहाल करने में व्युत्पन्न मांसपेशी संतति

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

ड्यूचेर्न एक मस्कुलर डिस्ट्रॉफी है जो मांसपेशियों की जनक कोशिकाओं को समय से पहले थकाऊ बनाता है। यह सबसे गंभीर मस्कुलर डिस्ट्रोफीज में से एक है। एक कार्यात्मक मांसपेशी उत्थान को बढ़ावा देने के लिए, हम प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न मांसपेशी जनक कोशिकाओं में डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति बहाल करने के लिए CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन संपादन का उपयोग करें ।CRISPR-Cas9 जीन संपादन में डिस्ट्रोफिन जीन अभिव्यक्ति को बहाल करने की क्षमता है। ऑटोलॉगस आईपीएससी-व्युत्पन्न मांसपेशी जनक कोशिकाएं स्टेम सेल पोर की भरपाई कर सकती हैं, क्षति की मरम्मत कर सकती हैं, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा किए बिना डीएमडी में आगे की जटिलताओं को रोक सकती हैं। मायोजेनिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं में आईपीएस कोशिकाओं के विभिन्न एजेंटों ने आईपीएस कोशिकाओं में ट्यूमर री-उत्पत्ति का खतरा कम कर दिया।कई उपचार जो ऑटोलॉगस प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मांसपेशी जनक कोशिकाओं को CRISPR-Cas9-मध्यस्थता आनुवंशिक सुधार के साथ जोड़ते हैं, ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी उपचार रणनीतियों का वादा कर रहे हैं। इस तकनीक का उपयोग हृदय, मस्तिष्क और रक्त रोग सहित आनुवांशिक रूप से ऑटोलॉगस स्टेम कोशिकाओं को संपादित करके कई जन्मजात बीमारियों के इलाज के लिए किया जा सकता है। हमने दिखाया कि इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन पाठकों को सेल रीप्रोग्रामिंग और जीन एडिटिंग से निपटने में अनुभव प्रदान कर सकता है, जो एक चुनौती बनी हुई है ।एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत, संक्रमित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की उपनिवेशों की जांच करें। सेल्फ इंकिंग ऑब्जेक्ट मार्कर के साथ डिश के नीचे कॉलोनियों को चिह्नित करें। चिह्नित सेल कॉलोनियों को कवर करने के लिए ग्रीज़ क्लोनिंग रिंग्स लागू करें।प्रत्येक क्लोनिंग रिंग में 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लेट को पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें। फिर, एमईएस विकास माध्यम के 250 मिलीलीटर युक्त 48-अच्छी संस्कृति प्लेटों में 100-माइक्रोलीटर पिपेट युक्तियों के साथ पचाने वाली कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 85% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।जब वे 70% संगम पढ़ते हैं, तो अच्छी तरह से विकसित कोशिकाओं वाले कुओं का चयन करें और 30 मिनट तक पचाने के लिए 250 मिलीलीटर टीवीपी समाधान जोड़ें। फिर, सेल संस्कृति को प्रत्येक कुएं से छह सेंटीमीटर डिश में स्थानांतरित करें। वर्दी, छात्रावास के आकार के क्लोन प्राप्त होने तक कई बार क्लोनिंग के छल्ले और इनक्यूबेशन लगाने दोहराएं।अब, टीवीपी समाधान के एक मिलीलीटर जोड़कर तैयार माउस आईपीएससी को पचा लें। सेल संस्कृति को फाइब्रोनेक्टिन और जिलेटिन के साथ लेपित 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं के 50% संगम तक पहुंचने के बाद, आठ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पॉलीब्रेन युक्त ताजा संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोलीटर पर स्विच करें।इसके बाद माउस आईपीएससी में लेंटीवायरल पार्टिकल सॉल्यूशन के 100 माइक्रोलीटर डालें। कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, ब्लास्टिसिडिन और हाइग्रोमाइसिन बी की न्यूनतम एकाग्रता निर्धारित करें जो 24 घंटे के भीतर आधी मार दर पर है।कोशिकाओं में 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ब्लास्टिसिडिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर हाइग्रोमाइसिन बी के मीडिया को जोड़ें, तीन दिनों तक प्रतीक्षा करें, और उन कोशिकाओं का चयन करें जो संक्रमित कोशिकाओं को स्टैबलिंग के रूप में अनुयायी रहते हैं। टीवीपी समाधान के 0.5 मिलीलीटर के साथ चयनित माउस आईपीएससी को पचा लें, प्रत्येक अच्छी तरह से एक नई 24-अच्छी प्लेट में, और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, आईपीएससी को एकल कोशिकाओं में पिपेट करें और कोशिकाओं को सेल काउंटिंग चैंबर के साथ गिनें।लगभग 150 पचा एकल कोशिकाओं का चयन करें और 10 सेंटीमीटर डिश में एमईएस माध्यम के साथ पतला, 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति। लगभग 10 दिनों के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत, एकल उपनिवेशों को चुनने और प्रत्येक कॉलोनी को 96-अच्छी प्लेट में टीवीपी समाधान के 50 माइक्रोलीटर में स्थानांतरित करने के लिए 10 माइक्रोलीटर बाँझ पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचा।विश्वसनीय मैनुअल क्लोनिंग उठा CRISPR कटाई की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है/Cas9-संपादित प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल । फिर, स्थानांतरण और प्रत्येक अच्छी तरह से एक और दो ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में पचा कोशिकाओं को विभाजित । 70% तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।70% संगम पर सेल कॉलोनियों के साथ, 96-वेल प्लेट में माध्यम को हटा दें। लिसिस रिएजेंट के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें प्रत्येक कुएं में 1% प्रोटीनेज के समाधान होता है और लाइज़ेट को एक और 96-अच्छी पीसीआर प्लेट में स्थानांतरित करें। चिपकने वाली जवानों के साथ पीसीआर प्लेट सील और 30 मिनट के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिलर में थाली इनक्यूबेट और फिर ४५ मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं lyse और प्रोटीनेज K.तो, denature, एक पीसीआर ट्यूब में, lysate के दो माइक्रोलीटर, 2x डीएनए पॉलीमरेज प्रीमिक्स के 10 माइक्रोलीटर, DNase-मुक्त पानी के 7 माइक्रोलीटर जोड़ें , और DMD Exon23 प्राइमर का एक माइक्रोलीटर ।पांडुलिपि के अनुसार पीसीआर रिएक्शन शुरू करें। फिर, 2% एगर उठे जेल पर बफर लोड करने के 2.2 माइक्रोलीटर के साथ आपूर्ति की गई पीसीआर प्रतिक्रिया लोड करें। 30 मिनट के लिए 100 से 150 वोल्ट पर जेल चलाएं और यूवी लाइट के नीचे जेल का निरीक्षण करें।इस प्रोटोकॉल में, उत्परिवर्ती Exon23 को पार्श्व करने वाले दो गाइड आरएनए डिजाइन किए गए थे। Cas9-मध्यस्थता डबल-फंसे ब्रेक और गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने के बाद, उत्परिवर्ती Exon23 को हटा दिया गया था, जिससे कटा हुआ लेकिन कार्यात्मक डिस्ट्रोफिन उत्पादन की अनुमति मिली। ट्रिप्सिन समाधान के रिसाव से बचने के लिए, हमें छल्ले के नीचे समान रूप से तेल लागू करने की आवश्यकता है।एक टैक्ड-ऑन मायोड एक्टिवेशन सिस्टम के साथ CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन का संयोजन जीन रिकवरी बेसल जनक कोशिकाओं के साथ ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी रोगियों में ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए एक सुरक्षित, व्यवहार्य और प्रभावी रणनीति प्रदान करता है ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

HiPSC तंत्रिका वंश विशिष्ट Knockin रिपोर्टर के कुशल उत्पादन का प्रयोग CRISPR / Cas9 और Cas9 डबल Nickase सिस्टम

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

सृजन CRISPR / Cas9 मध्यस्थता Monoallelic विलोपन माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में बढ़ाने समारोह का अध्ययन करने

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC व्युत्पन्न मानव मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी जल्दी neurodevelopmental विकार मॉडल

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Chimeric zebrafish भ्रूण में अलग-अलग रेटिना प्रोजेनिटर्स में ट्रांसजेनिक जीन एक्सप्रेशन के vivo इमेजिंग में सेल Nonautonomous प्रभावों का अध्ययन करने के लिए

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

RNAi और हीट शॉक-प्रेरित प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के आवेदन के लिए सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स के लिए रोगाणु कोशिकाओं reprogram

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo में मांसपेशी की इमेजिंग- Drosophila कोषस्थों में पट्टा Morphogenesis

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

पाड़-मुक्त, तीन आयामी इंसुलिन व्यक्त Pancreatoids से माउस अग्नाशय Progenitors इन विट्रो में की पीढ़ी

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

एक In Vitro 3 D मॉडल और गणनात्मक पाइपलाइन iPSC-Derived Endothelial संतति के Vasculogenic क्षमता को परिमाणित करने के लिए

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...