Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang e Weintraub sono stati parzialmente supportati da NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Tutte le procedure di movimentazione e chirurgia degli animali sono state eseguite da un protocollo approvato dall'Augusta University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I topi sono stati alimentati dieta standard e acqua al libitum.
1. Isolamento dei fibroblasti di topi primari da topimdx adulti Dmd
<ol><li>Eutanasia adulto Dmd topimdxi (maschio, 2 mesi) da CO2 asfissia e toracotomia secondo IACUC approvato dal Medical College of Georgia, Un...

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia ereditaria distruttiva e in definitiva fatale caratterizzata da una mancanza di distrofina, che porta ad un'atrofia muscolare progressiva1,2. I nostri risultati dimostrano l'espressione genica distrofina ripristinata nelle cellule progenitrici miogenie derivate da Dmdmdx iPSC dall'approccio della delezione di eon23 mediata da CRISPR/Cas9. Questo approccio presenta tre vantaggi.
<p class="jove...

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle distrofie muscolari più comuni ed è caratterizzata dall'assenza di distrofina, che colpisce 1 di circa 5.000 neonati in tutto il mondo1. La perdita della funzione genica della distrofina si traduce in difetti muscolari strutturali che portano alla degenerazione progressiva delle miofibre1,2. Il sistema di terapia genica mediata da un virus adeno ricombinante (rAAV) è stato testato per ripristinare l'espressione della distrofina e migliorare la funzione muscolare, come la sostituzione genica utilizzando micro-distrofine. Tuttavia, l'approccio rAAV richiede iniezioni ripetute per sostenere l'espressione della proteina funzionale3,4. Pertanto, abbiamo bisogno di una strategia in grado di fornire in modo efficace e permanente l'espressione genica della distrofina nei pazienti con DMD. Il topomdx Dmd, un modello murino per la DMD, ha una mutazione puntiforme nell'esone 23 del gene della distrofina che introduce un codone di terminazione prematura e si traduce in una proteina troncata non funzionale alla mancanza del dominio di legame disproglycan del terminale C. Recenti studi hanno dimostrato l'uso della tecnologia CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione genica della distrofina mediante una correzione genica accurata o la delezione di esoni mutanti in animali piccoli e grandi5,6,7. Long et al.8 ha riportato il metodo per correggere la mutazione del gene distrofina nella germina murinamdx Dmd mediante la riparazione diretta da omologia (HDR) basata sull'editing del genoma CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 ha riferito che rAAV potrebbe in modo efficiente eccitare l'esone mutante 23 in topi distrofici. In questi studi, i gRNA sono stati progettati negli introni 20 e 23 per causare rotture del DNA a doppio filamento, che hanno parzialmente ripristinato l'espressione della distrofina dopo la riparazione del DNA tramite l'unione finale non omologa (NHEJ). Ancora più eccitante, Amoasii et al.10 hanno recentemente riportato l'efficacia e la fattibilità dell'editing genico CRISPR mediato da rAAV nel ripristino dell'espressione della distrofina nei modelli canini, un passo essenziale nella futura applicazione clinica.
La DMD causa anche disturbi delle cellule staminali11. Per danni muscolari, le cellule staminali muscolari residenziali riforniscono le cellule muscolari morenti dopo la differenziazione muscolare. Tuttavia, i cicli consecutivi di lesioni e riparazione portano ad accorciamento dei telomeri nelle cellule staminali muscolari12, e l'esaurimento prematuro di piscine di cellule staminali13,14. Pertanto, una combinazione di terapia autologa con l'editing del genoma per ripristinare l'espressione della distrofina può essere un approccio pratico per il trattamento della DMD. La tecnologia CRISPR/Cas9 offre la possibilità di generare cellule staminali pluripotenti indotte geneticamente corrette autologie (iPSC) per la rigenerazione muscolare funzionale e prevenire ulteriori complicazioni della DMD senza causare il rigetto immunitario. Tuttavia, gli iPSC hanno un rischio di formazione del tumore, che potrebbe essere alleviato dalla differenziazione dell'iPSC nelle cellule progenitrici miogeniche.
In questo protocollo, descriviamo l'uso del virus Sendai non integrato per riprogrammare i fibroblasti dermici di topimdxi Dmd in iPSC e quindi recuperiamo l'espressione della distrofina con la cancellazione del genoma CRISPR/Cas9. Dopo la convalida della delezione di Exon23 in iPSC mediante genotipizzazione, abbiamo differenziato l'iPSC corretto dal genoma in progenitori miogenici (MPC) tramite la differenziazione miogenica indotta da MyoD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave malattia muscolare progressiva causata da mutazioni nel gene della distrofina, che alla fine porta all'esaurimento delle cellule progenitrici muscolari. L'editing genico a breve area(CRISPR/Cas9) interspaziale regolarmente interspaziale ha il potenziale per ripristinare l'espressione del gene della distrofina. Le cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali muscolari (MPC) autologhe indotte possono ricostituire il pool di cellule staminali/progenitrici, riparare i danni e prevenire ulteriori complicazioni nella DMD senza causare una risposta immunitaria. In questo studio, introduciamo una combinazione di CRISPR/Cas9 e tecnologie iPSC non integrate per ottenere progenitori muscolari con espressione proteica di distrofina recuperata. In breve, utilizziamo un vettore Sendai non integrato per stabilire una linea iPSC dai fibroblasti dermici dei topimdxi Dmd. Usiamo quindi la strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina attraverso un'unione finale non omologa del gene della distrofina riformulato. Dopo la convalida PCR dell'esaurimento dell'eso23 in tre colonie da 94 colonie iPSC selezionate, differenziamo iPSC in MPC per espressione indotta da Dox (Dox) di MyoD, un fattore chiave di trascrizione che svolge un ruolo significativo nella regolazione della differenziazione muscolare. I nostri risultati mostrano la fattibilità dell'utilizzo della strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina nell'MPC derivato da iPSC, che ha un potenziale significativo per lo sviluppo di future terapie per il trattamento della DMD.

Istituzione di fibroblasti cutaneimdx Dmd derivati iPSC. Abbiamo dimostrato l'efficienza della generazione di iPSC del mouse da topimdx Dmd che derivano dal fibroblasto cutaneo utilizzando i vettori di riprogrammazione senza integrazione. La figura 1A ha dimostrato che la comparsa di colonie simili a cellule staminali embrionali (ESC) a tre settimane dall'infezione. Valutiamo l'efficienza dell'induzione iPSC con macchie di fosfofosate alcalina...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Qui, presentiamo un protocollo di eliminazione exon23 basato su Cas9 per ripristinare l'espressione distrofina in iPSC da fibroblasti cutanei derivati da mousemdx Dmd e differenziare direttamente gli iPSC in cellule progenitrici miogenie (MPC) utilizzando il sistema di attivazione Tet-on MyoD.

Tecnologia CRISPR/Cas9 nel ripristino dell'espressione della distrofina nei progenitori muscolari derivati da iPSC

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne è una distrofia muscolare che causa l'esaurimento prematuro delle cellule progenitrici muscolari. È una delle distrofie muscolari più gravi. Per promuovere una rigenerazione muscolare funzionale, utilizziamo l'editing genico mediato CRISPR /Cas9 per ripristinare l'espressione di distrofica nelle cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.L'editing genico CRISPR-Cas9 ha il potenziale per ripristinare l'espressione genica della distrofica. Le cellule progenitrici muscolari derivate da iPSC autologhe possono reintegrare il poro delle cellule staminali, riparare i danni e prevenire ulteriori complicazioni nella DMD senza causare una risposta immunitaria. Diversi agenti delle cellule iPS nelle cellule progenitrici miogeniche hanno ridotto il rischio di re-genesi tumorale nelle cellule iPS.Diverse terapie che combinano cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte autologhe con correzione genetica mediata da CRISPR-Cas9 sono promettenti strategie di trattamento della distrofia muscolare di Duchenne. Questa tecnologia può essere utilizzata per trattare molte malattie congenite modificando geneticamente le cellule staminali autologhe, tra cui cuore, cervello e malattie del sangue. Abbiamo dimostrato che questo approccio può fornire ai lettori esperienza nella gestione della riprogrammazione cellulare e dell'editing genico, che rimane una sfida.Al microscopio rovesciato, esaminare le colonie di cellule staminali embrionali di topo infette. Segna le colonie nella parte inferiore del piatto con il marcatore dell'oggetto auto-inchiodamento. Applicare anelli di clonazione unti per coprire le colonie cellulari contrassegnate.Aggiungere 100 microlitri dello 0,05%Trypsin-EDTA a ciascun anello di clonazione e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, trasferire le celle digerite con punte di pipetta da 100 microlitri su piastre di coltura a 48 pozzi contenenti 250 millilitri di mezzo di crescita MES. Incubare le cellule nell'incubatore di 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e l'85% di umidità.Quando leggono il 70% di confluenza, selezionare i pozzi con cellule ben coltivate e aggiungere 250 millilitri di soluzione TVP da digerire per 30 minuti. Quindi, trasferire la coltura cellulare da ogni pozzo a un piatto di sei centimetri. Ripetere l'applicazione di anelli di clonazione e incubazione per diverse volte fino a ottenere cloni uniformi a forma di dormitorio.Ora, digerisci gli IPSC del mouse preparati aggiungendo un millilitro di soluzione TVP. Trasferire la coltura cellulare in una piastra di 24 po 'rivestita con fibronectina e gelatina e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Dopo che le cellule hanno raggiunto il 50% di confluenza, passare a 500 microlitri di mezzo di coltura fresco contenenti otto microgrammi per millilitro Polibrene.Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di particelle lentivirali agli IPSC del mouse. Incubare le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, determinare la concentrazione minima di Blasticidina e Igromicina B che è a metà tasso di uccisione entro 24 ore.Aggiungere il supporto di 2,5 microgrammi per millilitro Blasticidina e 100 microgrammi per millilitro Igromicina B nelle cellule, attendere tre giorni e selezionare le cellule che rimangono aderenti come cellule infette di sterco. Digerire gli IPSC del mouse selezionati con 0,5 millilitri di soluzione TVP, ognuno in una nuova piastra da 24 po ', e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius con 5%anidride carbonica. Quindi, pipettare gli iPSC in singole celle e contare le celle con una camera di conteggio delle celle.Selezionare circa 150 singole cellule digerite e diluire con mezzo MES in piatto da 10 centimetri, coltura a 37 gradi Celsius con 5%anidride carbonica. Dopo circa 10 giorni, al microscopio invertito, utilizzare 10 punte di pipetta sterile a microlitro per raccogliere singole colonie e trasferire ogni colonia in 50 microlitri di soluzione TVP in una piastra da 96 pozzetti. Digerire a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Una raccolta manuale affidabile della clonazione è fondamentale per il successo della raccolta delle cellule staminali pluripotenti indotte modificate CRISPR/Cas9. Quindi, trasferire e dividere le cellule digerite da ogni pozzo in altre due piastre di coltura da 96 pozzi. Incubare a 37 gradi Celsius fino al 70% confluente.Con le colonie cellulari al 70% di confluenza, rimuovere il mezzo nella piastra da 96 pozzi. Aggiungere 25 microlitri di reagente di lisi contenenti soluzione 1%Proteinasi K ad ogni pozzo e trasferire il lisato in un'altra piastra PCR da 96 porri. Sigillare la piastra PCR con guarnizioni adesive e incubare la piastra in un ciclore termico a 55 gradi Celsius per 30 minuti e quindi a 95 gradi Celsius per 45 minuti per lisciviare le cellule e denaturare la Proteinasi K.Quindi, in un tubo PCR, aggiungere due microlitri del litolato, 10 microlitri di 2x DNA Polymerasi Premix, 7 microlitri di acqua priva di DNasi , e un microlitro di primer DMD Exon23.Avviare la reazione PCR in base al manoscritto. Quindi, caricare la reazione PCR fornita con 2,2 microlitri di buffer di carico su un gel di agarosio al 2%. Far funzionare il gel a 100-150 volt per 30 minuti e ispezionare il gel sotto la luce UV.In questo protocollo sono state progettate due RNA guida che fiancheggiano il mutante Exon23. Dopo le pause a doppio filamento mediate da Cas9 e l'unione finale non omologa, il mutante Exon23 fu eliminato, consentendo la produzione troncata ma funzionale di distrofina. Per evitare la perdita della soluzione di tripina, dobbiamo applicare il grasso uniformemente sul fondo degli anelli.La combinazione dell'editing del genoma CRISPR/Cas9 con un sistema di attivazione MyoD attaccato fornisce una strategia sicura, fattibile ed efficace per il trapianto autologo in pazienti con distrofia muscolare di Duchenne con cellule progenitrici basali di recupero genico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

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In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...