Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

タンとワイントラウブは、NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354によって部分的にサポートされました。

すべての動物の取り扱いと外科的処置は、オーガスタ大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルによって行われました。マウスに標準食と水のアドリビタムを与えた。
1. 成体Dmdmdxマウスからの一次マウス線維芽細胞の単離
<ol><li>ジョージア州立医科大学(オーガスタ大学)が承認したIACUCに従い、CO2窒息および胸部切診により...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィンの欠如を特徴とする破壊的で最終的に致命的な遺伝性疾患であり、進行性筋萎縮症1、2を引き起こす。我々の結果は、CRISPR/Cas9媒介exon23欠失のアプローチにより、Dmdmdx iPSC由来筋原性前駆細胞におけるジストロフィン遺伝子発現の回復を実証した。この方法には 3 つの利点があります。<...

デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、最も一般的な筋ジストロフィーの一つであり、ジストロフィンの不在によって特徴付けられており、世界中の約5,000人の新生児の1人に影響を与える。ジストロフィン遺伝子機能の喪失は、進行性筋線維変性1、2につながる構造的な筋肉欠損をもたらす。組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)媒介遺伝子治療システムは、ジストロフィン発現を回復させ、マイクロジストロフィン(μ-Dys)を用いて遺伝子置換などの筋肉機能を改善するために試験された。しかしながら、rAAVアプローチは、機能性タンパク質3、4の発現を維持するために繰り返し注射を必要とする。したがって、DMD患者においてジストロフィン遺伝子発現を効果的かつ永続的に回復できる戦略が必要である。DMDのマウスモデルであるDmdmdxマウスは、早期終了コドンを導入するジストロフィン遺伝子のエキソン23に点変異を有し、C末端ジストログリカン結合ドメインを欠く非機能的切り捨てタンパク質をもたらす。最近の研究は、小・大型動物5、6、7における正確な遺伝子矯正または変異性エキソン欠失によるジストロフィン遺伝子発現を回復させるCRISPR/Cas9技術の使用を実証した。Long et al.8は、相同性修復(HDR)ベースのCRISPR/Cas9ゲノム編集によりDmdmdxマウス生殖細胞系におけるジストロフィン遺伝子変異を修正する方法を報告した。El Refaey et al.9は、rAAVがジストロフィーマウスで変異型エキソン23を効率的に排除できると報告した。これらの研究では、gRNAは、非相同末端接合(NHEJ)を介してDNA修復後にジストロフィン発現を部分的に回復させた二本鎖DNA切断を引き起こすために、イントロン20および23で設計された。さらにエキサイティングな、Amoasii et al.10は最近、イヌモデルにおけるジストロフィン発現の復元におけるrAAV媒介性CRISPR遺伝子編集の有効性と実現可能性を報告した。
DMDはまた、幹細胞障害11を引き起こす。筋肉の損傷のために, 住宅の筋肉幹細胞は、筋肉分化後に死にかけている筋肉細胞を補充します。.しかしながら、損傷および修復の連続したサイクルは、筋幹細胞12におけるテロメアの短縮、および幹細胞プール13、14の早期枯渇につながる。したがって、自家幹細胞療法とジストロフィン発現を回復させるゲノム編集の組み合わせは、DMDを治療するための実用的なアプローチでありうたることができる。CRISPR/Cas9技術は、機能的な筋肉再生のための自己的に修正された多能性幹細胞(iPSC)を生成し、免疫拒絶反応を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐ可能性を提供します。しかし、iPSCは腫瘍形成のリスクがあり、筋原性前駆細胞へのiPSCの分化によって緩和される可能性がある。
このプロトコルでは、非統合センダイウイルスを用いてDmdmdxマウスの真皮線維芽細胞をiPSCに再プログラミングし、CRISPR/Cas9ゲノム欠失によりジストロフィン発現を回復することを説明する。ジェノタイピングによるiPSCにおけるExon23欠失の検証後、筋染発性筋原分化によりゲノム補正iPSCを筋原性前駆体(MPC)に分化した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされる重度の進行性筋疾患であり、最終的には筋前駆細胞の枯渇につながる。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリドロミックリピート/CRISPR関連9(CRISPR/Cas9)遺伝子編集は、ジストロフィン遺伝子の発現を回復させる可能性を有する。自家誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋肉前駆細胞(MPC)は、幹/前駆細胞プールを補充し、損傷を修復し、免疫応答を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐことができます。本研究では、CRISPR/Cas9と非統合iPSC技術を組み合わせて、回復したジストロフィンタンパク質発現を持つ筋肉前駆体を得ることを紹介する。簡単に言えば、非積分センダイベクターを用いて、Dmdmdxマウスの真皮線維芽細胞からiPSCラインを確立する。次に、CRISPR/Cas9欠失戦略を使用して、再フレームされたジストロフィン遺伝子の非相同末結合を通じてジストロフィン発現を回復させます。94個のピックiPSCコロニーから3つのコロニーにおけるexon23枯渇のPCR検証後、筋分化の調節に重要な役割を果たす重要な転写因子であるMoDのドキシサイクリン(Dox)誘導発現により、iPSCをMPCに分化する。我々の結果は、DMD治療のための将来の治療法を開発する上で大きな可能性を有するiPSC由来MPCにおけるジストロフィン発現を回復させるためにCRISPR/Cas9欠失戦略を用いることを可能にすることを示した。

dmdmdx皮膚線維芽細胞由来iPSCの確立我々は、統合フリーのリプログラミングベクターを用いてDmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からマウスiPSCを生成する効率を実証した。図1Aは、感染後3週間で胚性幹細胞(ESC)様コロニーの出現を実証した。生きたアルカリホスファターゼ(AP)染色によるiPSC誘導の効率を評価する。図1B</strong...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

ここでは、Dmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からiPSC中のジストロフィン発現を復元し、Tet-on MyoD活性化システムを用いてiPSCを筋原性前駆細胞(MPC)に直接分化させるCas9ベースのexon23欠失プロトコルを提示する。

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

デュシェンヌは筋ジストロフィーで、筋肉前駆細胞の早期排気を引き起こす。これは、最も重度の筋ジストロフィーの一つです。機能的な筋肉再生を促進するために、CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集を用いて、誘導多能性幹細胞由来筋前駆細胞におけるジストロフィン発現を回復させます。CRISPR-Cas9遺伝子編集は、ジストロフィン遺伝子発現を回復する可能性を秘めています。自己iPSC由来の筋前駆細胞は、幹細胞の毛穴を補充し、損傷を修復し、免疫応答を引き起こすことなくDMDのさらなる合併症を防ぐことができます。筋原性前駆細胞へのiPS細胞の異なる薬剤は、iPS細胞における腫瘍再発生のリスクを減少させた。自家誘導多能性幹細胞由来の筋前駆細胞とCRISPR-Cas9媒介性遺伝子矯正を組み合わせたいくつかの治療法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療戦略を有望である。この技術は、心臓、脳、血液疾患を含む自己幹細胞を遺伝的に編集することによって、多くの先天性疾患を治療するために使用することができます。我々は、このアプローチのデモンストレーションは、読者に細胞リプログラミングと遺伝子編集の取り扱い経験を提供できることを示した。逆顕微鏡の下で、感染したマウス胚性幹細胞のコロニーを調べる。皿の底にあるコロニーを自己インクオブジェクトマーカーでマークします。マークされた細胞コロニーを覆うためにグリースクローニングリングを適用します。各クローニングリングに0.05%トリプシン-EDTAの100マイクロリットルを加え、5分間摂氏37度のインキュベーターにプレートを置きます。次に、100マイクロリットルのピペットチップを用いて消化した細胞を、250ミリリットルのMES増殖培地を含む48ウェル培養プレートに移す。5%の二酸化炭素と85%の湿度で37°Cインキュベーターで細胞をインキュベートします。彼らは70%合流を読むとき, よく成長した細胞を持つ井戸を選択し、30分間消化するためにTVP溶液の250ミリリットルを追加します。次に、各ウェルから6センチメートルの皿に細胞培養を移す。クローニングリングとインキュベーションを繰り返し、均一で寮状のクローンが得られるまで繰り返します。次に、1ミリリットルのTVP溶液を加えて、準備したマウスiPSCを消化します。フィブロネクチンとゼラチンでコーティングされた24ウェルプレートに細胞培養液を移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。細胞が50%合流した後、ポリブレン当たり8マイクログラムを含む500マイクロリットルの新鮮な培養培地に切り替えます。次に、マウスiPSCにレンチウイルス粒子溶液の100マイクロリットルを加える。5%の二酸化炭素で摂氏37度で3日間細胞をインキュベートする。次に、24時間以内に殺滅率が半分であるブラストシジンおよびハイグロマイシンBの最小濃度を決定する。1ミリリットルブラストシジンあたり2.5マイクログラム、1ミリリットルハイグロマイシンBあたり100マイクログラムの培地を細胞に加え、3日間待ち、感染細胞を刺すように付着したままの細胞を選択します。選択したマウスiPSCを0.5ミリリットルのTVP溶液で消化し、それぞれが新しい24ウェルプレートで、セルを摂氏37度で30分間インキュベートし、5%の二酸化炭素を加えます。次いで、iPSCを単一細胞にピペットし、細胞計数チャンバーを有する細胞を数える。約150個の消化単一細胞を選択し、MES培地で10センチメートル皿に希釈し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で培養する。約10日後、逆顕微鏡の下で、10マイクロリットルの無菌ピペットチップを使用して単一のコロニーを選び、各コロニーを96ウェルプレートのTVP溶液の50マイクロリットルに移します。37°Cで30分間消化します。CRISPR/Cas9編集による多能性幹細胞の収穫を成功させるためには、信頼性の高い手動クローニングピッキングが不可欠です。その後、消化した細胞を各ウェルから別の2つの96ウェル培養プレートに移して分割します。70%コンフルエントまで摂氏37度でインキュベート。70%合流の細胞コロニーで、96ウェルプレート内の培地を取り除きます。1%のプロテイン酵素K溶液を含む25マイクロリットルの溶解試薬を各ウェルに加え、溶解液を別の96ウェルPCRプレートに移します。PCRプレートを粘着シールで密封し、サーマルサイクラーでプレートを摂氏55度で30分間インキュベートし、摂氏95度で45分間摂氏95分で細胞を溶性し、プロテネラーゼKを変性させる。、およびDMD Exon23プライマーの1マイクロリットル。原稿に従ってPCR反応を開始します。次いで、2.2マイクロリットルの負荷バッファーを供給したPCR反応を2%アガロースゲルにロードします。ゲルを100~150ボルトで30分間実行し、UV光下でゲルを検査します。このプロトコルでは、変異体Exon23に隣接する2つのガイドRNAが設計されました。Cas9媒介性二本鎖破断および非相同的な終末結合後、変異体Exon23が削除され、切り捨てられたが機能的なジストロフィン産生を可能にした。トリプシン溶液の漏れを避けるために、我々はリングの底に均等にグリースを適用する必要があります。CRISPR/Cas9ゲノム編集とトットオンMyoD活性化システムの組み合わせは、遺伝子回収基底前細胞を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者における自己移植のための安全で実現可能かつ効果的な戦略を提供します。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...