Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

탕과 와인트라우브는 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354에 의해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물 취급 및 외과 적 절차는 오거스타 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 의해 수행되었다. 마우스는 표준 식이요법과 물 광고 리비텀을 공급하였다.
1. 성인 Dmdmdx 마우스에서 기본 마우스 섬유 아세포의 격리
<ol><li>조지아 의과 대학에 의해 승인 IACUC에 따라 CO2 질식 및 흉부 절제술에 의해 성인 Dmdmdx 마우스 (?...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

듀첸 근이영양증(DMD)은 디스트로핀의 부족을 특징으로 하는 파괴적이고 궁극적으로 치명적인 유전질환으로, 진행성 근육 위축으로 이어지는1,2. 우리의 결과는 CRISPR/Cas9 매개 exon23 결실의 접근법에 의해Dmdmdx iPSC 유래 myogenic 전구 세포에서 복원된 디스트로핀 유전자 발현을 입증한다. 이 방법은 세 가지 장점이 있습니다.
첫?...

Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 가장 일반적인 근 이영양증의 한개이고 전세계 대략 5,000명의 신생아 소년의 1에 영향을 미치는 dystrophin의 부재에 의해 특징입니다1. 디스트로핀 유전자 기능의 손실은 진보적 인 myofibers 변성으로 이어지는 구조적 근육 결함을초래1,2. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)-매개 유전자 치료 시스템은 마이크로 디스트로핀(μ-Dys)을 이용한 유전자 교체와 같은 디스트로핀 발현을 복원하고 근육 기능을 향상시키는 것으로 시험되었다. 그러나, rAAV 접근법은 기능성 단백질3,4의발현을 유지하기 위해 반복주사를 요구한다. 따라서, 우리는 DMD를 가진 환자에 있는 dystrophin 유전자 발현을 효과적이고 영구적으로 복구할 수 있는 전략이 필요합니다. DMD를 위한 마우스 모델인Dmdmdx 마우스는, 조기 종결 코동을 도입하고 C 말단 디스트로글리칸 결합 도메인이 결여된 비기능성 잘린 단백질을 초래하는 디스트로핀 유전자의 엑소(23)에서 포인트 돌연변이를 갖는다. 최근 연구는 크고 작은동물5,6,7에서정확한 유전자 보정 또는 돌연변이 엑시온 결실에 의해 디스트로핀 유전자 발현을 복원하는 CRISPR/Cas9 기술의 사용을 입증하였다. Long etal.8은 상동성 지향 수리(HDR) 기반 CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의해Dmdmdx 마우스 생식선에서 디스트로핀 유전자 돌연변이를 교정하는 방법을 보고했다. 엘 레페이 외9 는 rAAV가 영양 실조 마우스에서 돌연변이 엑슨 23을 효율적으로 소비 할 수 있다고보고했다. 이 연구 결과에서, gRNAs는 비 상동성 끝 접합을 통해 DNA 복구 후에 디스트로핀 발현을 부분적으로 복구하는 이중 좌초된 DNA 중단을 일으키는 원인이 되기 위하여 인트론 20 및 23에서 디자인되었습니다 (NHEJ). 더욱 흥미진진한, Amoasii 등10은 최근 개 모델에서 디스트로핀 발현을 복원하는 데 있어 rAAV 매개 CRISPR 유전자 편집의 효능 및 타당성을 보고했으며, 이는 향후 임상 적용에 필수적인 단계이다.
DMD는 또한 줄기 세포 무질서(11)를일으키는 원인이 됩니다. 근육 손상에 대 한, 주거 근육 줄기 세포 근육 분화 후 죽어가는 근육 세포를 보충. 그러나, 상해 및 수리의 연속적인 주기는 근육 줄기 세포(12)에서텔로미어의 단축으로 이어지고, 줄기 세포 풀의 조기 고갈13,14. 따라서, 디스트로핀 발현을 복원하기 위한 게놈 편집과 자가 줄기 세포 요법의 조합은 DMD 를 치료하기 위한 실용적인 접근법이 될 수 있다. CRISPR/Cas9 기술은 기능적인 근육 재생을 위해 자가 수정된 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하고 면역 거부를 일으키지 않으면서 DMD의 추가 합병증을 예방할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나, iPSCs는 myogenic 전구 세포로 iPSC의 분화에 의해 완화될 수 있던 종양 대형의 리스크가 있습니다.
이 프로토콜에서는Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포를 iPSCs로 재프로그래밍한 다음 CRISPR/Cas9 게놈 삭제에 의한 디스트로핀 발현을 복구하기 위해 비통합 Sendai 바이러스의 사용을 설명합니다. 유전자 형이 나는 에 의해 iPSC에서 Exon23 삭제의 검증 후, 우리는 MyoD 유도 myogenic 분화를 통해 myogenic 선조 (MPC)로 게놈 보정 iPSC를 분화.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 궁극적으로 근육 전구 세포의 고갈로 이끌어 내는 dystrophin 유전자에 있는 돌연변이에 기인한 가혹한 진보적인 근육 질병입니다. 클러스터된 정기적으로 연속된 짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 9 (CRISPR/Cas9) 유전자 편집은 디스트로핀 유전자의 발현을 회복시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 자가성 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)-유래 근육 전구 세포 (MPC)는 줄기 / 전구 세포 풀을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방 할 수 있습니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 및 비통합 iPSC 기술의 조합을 도입하여 회복된 디스트로핀 단백질 발현을 가진 근육 선조를 얻습니다. 간략하게, 우리는 Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포로부터 iPSC 라인을 확립하기 위해 비통합 센다이 벡터를 사용합니다. 그런 다음 CRISPR/Cas9 결실 전략을 사용하여 재프레임된 디스트로핀 유전자의 비상동성 말 결합을 통해 디스트로핀 발현을 복원합니다. 94개의 iPSC 콜로니에서 3개의 콜로니에서 exon23 고갈의 PCR 검증 후, 우리는 근육 분화 조절에 중요한 역할을 하는 주요 전사 인자인 MyoD의 독시사이클린(Dox)-유도 발현에 의해 iPSC를 MPC로 분화합니다. 우리의 결과는 DMD의 처리를 위한 미래 치료를 개발하기 위한 중요한 잠재력을 가지고 있는 iPSC 파생된 MPC에 있는 dystrophin 표현을 복구하기 위하여 CRISPR/Cas9 삭제 전략을 사용하는 타당성을 보여줍니다.

Dmdmdx 피부 섬유아세포 유래 iPSC의 확립. 우리는 통합없는 재프로그래밍 벡터를 사용하여Dmdx 마우스 유래 피부 섬유 아세포로부터 마우스 iPSC를 생성하는 효율성을 입증했습니다. 도 1A는 감염 후 3주에 배아 줄기세포(ESC)와 유사 콜로니의 출현을 입증하였다. 우리는 살아있는 알칼리성 인산염 (AP) 얼룩에 의한 iPSC 유도의 효율을 평가합니?...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

여기서, 우리는Dmdmdx 마우스 유래 피부 섬유아세포로부터 iPSC에서 디스트로핀 발현을 복원하고 Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화하는 Cas9 기반 exon23 결실 프로토콜을 제시한다.

iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne은 근육 전구 세포의 조기 피로를 일으키는 근육 이영양증입니다. 그것은 가장 심각한 근 이영양증 중 하나입니다. 기능성 근육 재생을 촉진하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집을 사용하여 유도 된 다능줄기 세포 유래 근육 전구 세포에서 dystrophin 발현을 복원합니다.CRISPR-Cas9 유전자 편집은 dystrophin 유전자 발현을 복원할 가능성이 있습니다. 자가 iPSC 유래 근육 전구 세포는 줄기 세포 모공을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방할 수 있습니다. 근생 전구 세포로 iPS 세포의 상이한 에이전트는 iPS 세포에 있는 종양 재창종의 리스크를 감소했습니다.자백 유도 만능 줄기 세포 유래 근육 전구 세포를 CRISPR-Cas9 매개 유전자 교정과 결합하는 몇몇 치료는 Duchenne 근 이영양증 치료 전략을 유망합니다. 이 기술은 심장, 두뇌 및 혈액 병을 포함하여 자가 줄기 세포를 유전으로 편집하여 많은 선천성 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 접근법의 데모가 도전으로 남아 있는 세포 재프로그래밍 및 유전자 편집처리에 있는 경험을 독자에게 제공할 수 있었다는 것을 보여주었습니다.반전 된 현미경에서 감염된 마우스 배아 줄기 세포의 식민지를 검사하십시오. 자체 잉크 오브젝트 마커로 접시 바닥에 식민지를 표시합니다. 기름칠된 복제 링을 적용하여 표시된 세포 식민지를 덮습니다.각 복제 링에 0.05%의 트립신-EDTA 100 마이크로리터를 추가하고 5분간 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 이어서, MES 성장 배지의 250 밀리리터를 포함하는 48웰 배양 판에 100 마이크로리터 파이펫 팁으로 소화된 세포를 전송한다. 이산화탄소 5%와 습도 85%로 섭씨 37도 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.70%의 합류를 읽을 때 잘 자란 셀이 있는 우물을 선택하고 TVP 용액 250밀리리터를 추가하여 30분 동안 소화합니다. 그런 다음 각 웰에서 6센티미터 접시로 세포 배양을 옮김합니다. 균일한 기숙사 모양의 클론이 얻어지을 때까지 복제 링과 인큐베이션을 여러 번 반복적으로 적용하십시오.이제 TVP 솔루션의 밀리리터 를 추가하여 준비된 마우스 iPSC를 소화합니다. 세포 배양을 섬유네틴과 젤라틴으로 코팅한 24웰 플레이트로 옮기고 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포가 50%에 도달하면 밀리리터 폴리브레네 당 8마이크로그램을 함유한 신선한 배양 배지 500마이크로리터로 전환합니다.그런 다음, 마우스 iPSCs에 렌티바이러스 입자 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다. 37°C에서 3일간 세포를 배양하여 이산화탄소 5%를 증정합니다. 다음으로, 24시간 이내에 반킬 속도로 있는 블라스팅신과 히그로마이신 B의 최소 농도를 결정합니다.밀리리터 블라스티시딘당 2.5 마이크로그램의 미디어를 추가하고 밀리리터 히그로마이신 B당 100 마이크로그램을 세포에 넣고 3일 동안 기다린 후 감염된 세포를 안정화하는 것으로 부착된 세포를 선택합니다. 선택한 마우스 iPSC를 0.5 밀리리터의 TVP 용액으로 소화하고, 새로운 24웰 플레이트에서 각각 잘 소화하고, 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 iPSC를 단일 셀로 피펫하고 셀 카운팅 챔버로 셀을 계산합니다.약 150개의 소화된 단일 세포를 선택하고 MES 배지로 희석하여 10센티미터 의 접시로 희석하고, 이산화탄소는 섭씨 37도에서 배양합니다. 약 10 일 후, 반전 된 현미경에서, 사용 10 마이크로 리터 멸균 파이펫 팁 단일 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트에 TVP 솔루션의 50 마이크로 리터로 각 식민지를 전송합니다. 섭씨 37도에서 30분간 소화하세요.CRISPR/Cas9 편집 유도 만능 줄기 세포를 수확하는 성공에 는 신뢰할 수 있는 수동 복제 따기가 중요합니다. 그런 다음 소화된 세포를 각각의 다른 2개의 96웰 배양 판으로 옮기고 나눕니다. 섭씨 37도에서 70%까지 배양합니다.70%의 결합에서 세포 콜로니를 사용하면 96웰 플레이트의 배지를 제거하십시오. 각 웰에 1%Proteinase K 용액을 함유한 25개의 리시스 시약을 추가하고 용액을 다른 96웰 PCR 플레이트로 옮습니다. PCR 플레이트를 접착 씰로 밀봉하고 30분 동안 섭씨 55도에서 열 사이클러에 플레이트를 인큐베이션한 다음 45도에서 45도의 섭씨에서 세포를 lyse및 단백질을 해독하고, PCR 튜브에 2개의 마이크로리터, 2DNA 의 마이크로리터 프리클리터 10마이크로리터를 추가했습니다. , DMD Exon23 프라이머의 마이크로 리터 1개.원고에 따라 PCR 반응을 시작합니다. 그런 다음, 2.2 마이크로리터의 적재 버퍼와 함께 제공되는 PCR 반응을 2%아가로즈 젤에 적재한다. 젤을 100~150볼트에서 30분간 실행하고 자외선 아래에서 젤을 검사합니다.이 프로토콜에서는 돌연변이 Exon23 측면에 있는 두 개의 가이드 RNA가 설계되었습니다. Cas9 매개 이중 좌초 휴식 및 비 동종 최종 결합 후 돌연변이 Exon23이 삭제되어 잘린 하지만 기능적인 Dystrophin 생성이 허용되었습니다. 트립신 솔루션의 누출을 방지하기 위해, 우리는 고리의 바닥에 고르게 그리스를 적용해야합니다.CRISPR/Cas9 게놈 편집과 근육 측정기 활성화 시스템의 조합은 유전자 회복 기저 전구 세포를 가진 Duchenne 근 이영양증 환자에서 자가 이식을 위한 안전하고, 실현 가능하고 효과적인 전략을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...