Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang og Weintraub ble delvis støttet av NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Alle dyr håndtering og kirurgiske prosedyrer ble utført av en protokoll godkjent av Augusta University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC). Mus ble matet standard kosthold og vann ad lib.
1. isolering av primær mus fibroblaster fra voksen DMDMDX mus
<ol><li>Euthanize voksen DMDMDX mus (hann, 2 måneder gammel) av co2 kvelning og toraktomi henhold til IACUC godkjent av Medical College of Georgia, Augusta University. Skjær halen med en ster...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparks,+signals+and+shock+absorbers:+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy.">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li><li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors.">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li><li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies.">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy.">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en destruktiv og til syvende og sist dødelig arvelig sykdom preget av mangel på dystrofingenet, fører til progressiv muskel atrofi1,2. Våre resultater viser den restaurerte dystrofingenet genuttrykk i DMDMDX IPSC-avledet myogenic stamceller ved TILNÆRMINGEN av CRISPR/Cas9-mediert exon23 sletting. Denne tilnærmingen har tre fordeler.
Først genererte vi iPSCs fra DMDMDX m...

Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en av de vanligste muskuløse dystrofi og er karakterisert ved fravær av dystrofingenet, som berører 1 av ca 5 000 nyfødte gutter over hele verden1. Tap av dystrofingenet gen funksjon resulterer i strukturelle muskel feil som fører til progressiv myofibers degenerasjon1,2. Rekombinant adeno-Associated virus (rAAV)-mediert genterapi system har blitt testet for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk og forbedre muskel funksjon, som for eksempel gen erstatning ved hjelp av mikro-dystrophins (μ-Dys). Imidlertid krever rAAV tilnærming gjentatte injeksjoner å opprettholde uttrykk for den funksjonelle protein3,4. Derfor trenger vi en strategi som kan gi effektivt og permanent gjenopprette dystrofingenet genuttrykk hos pasienter med DMD. DMDMDX musen, en mus modell for DMD, har et punkt mutasjon i ekson 23 av dystrofingenet genet som introduserer en tidlig avslutning Codon og resulterer i en ikke-funksjonell avkortet protein mangler C-terminal dystroglycan bindende domene. Nyere studier viste bruk av CRISPR/Cas9 teknologi for å gjenopprette dystrofingenet genuttrykk ved nøyaktig gen korreksjon eller mutant ekson sletting i små og store dyr5,6,7. Long et al.8 rapporterte metoden for korrigering av dystrofingenet genet mutasjon i DMDMDX mus germline av homologi-regissert reparasjon (HDR) basert CRISPR/Cas9 Genova redigering. El Refaey et al.9 rapporterte at rAAV kunne effektivt avgiftsdirektoratet den muterte ekson 23 i dystrophic mus. I disse studiene, gRNAs ble utformet i introns 20 og 23 for å forårsake dobbel-strandet DNA pauser, som delvis restaurert dystrofingenet uttrykk etter DNA reparasjon via ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ). Enda mer spennende, Amoasii et al.10 nylig rapportert effekten og gjennomførbarhet av rAAV-mediert CRISPR genredigering i å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i canine modeller, et viktig skritt i fremtidig klinisk anvendelse.
DMD fører også til Stamcelle forstyrrelser11. For muskel skade, bolig muskel stamceller fylle døende muskelceller etter muskel differensiering. Men, påfølgende sykluser av skade og reparasjon føre til forkortelse av telomerer i muskel stamceller12, og for tidlig tømming av Stamcelle bassengene13,14. Derfor kan en kombinasjon av autologous stilk cellen terapi med Genova redigering for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk være en praktisk tilnærming for behandling DMD. Den CRISPR/Cas9 teknologi gir mulighet for å generere autologous genetisk korrigert indusert Pluripotent stamceller (iPSC) for funksjonell muskel regenerering og hindre ytterligere komplikasjoner av DMD uten å forårsake immun avvisning. Men iPSCs har en risiko for tumor dannelse, som kan bli lindres av differensiering av iPSC inn myogenic stamceller.
I denne protokollen, beskriver vi bruken av ikke-integrere Sendai virus til omprogrammering dermal fibroblaster av DMDMDX mus til iPSCs og deretter gjenopprette dystrofingenet uttrykk ved CRISPR/Cas9 Genova sletting. Etter godkjenningen av Exon23 overstrekingen inne iPSC av genotyperingteknologi, vi differensiert Genova-korrigerte iPSC i myogenic forfedre (MPC) via MyoD-indusert myogenic differensiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en alvorlig progressiv muskel sykdom forårsaket av mutasjoner i dystrofingenet genet, som til slutt fører til utmattelse av muskel stamceller. Gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner/CRISPR-Associated 9 (CRISPR/Cas9) genredigering har potensiale til å gjenopprette uttrykk for det dystrofingenet genet. Autologous indusert Pluripotent stamceller (iPSCs)-avledet muskel stamceller (MPC) kan etterfylle stammen/Stamcelle utvalget, reparere skader, og hindre ytterligere komplikasjoner i DMD uten å forårsake en immunrespons. I denne studien introduserer vi en kombinasjon av CRISPR/Cas9 og ikke-integrerte iPSC-teknologier for å få muskel forfedre med gjenopprettede dystrofingenet protein uttrykk. Kort, bruker vi en ikke-integrere Sendai vektor å etablere en iPSC linje fra dermal fibroblaster av DMDMDX mus. Vi bruker deretter CRISPR/Cas9 sletting strategi for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk gjennom en ikke-homologe slutten sammenføyning av reframed dystrofingenet genet. Etter PCR validering av exon23 nedbryting i tre kolonier fra 94 plukket iPSC kolonier, skiller vi iPSC inn MPC av Doxycycline (dox)-indusert uttrykk for MyoD, en nøkkel transkripsjon faktor spiller en betydelig rolle i regulering muskel differensiering. Våre resultater viser muligheten for å bruke CRISPR/Cas9 sletting strategi for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i iPSC-avledet MPC, som har betydelig potensial for å utvikle fremtidige terapier for behandling av DMD.

Etablering av DMDMDX hud fibroblaster avledet IPSC. Vi demonstrerte effektiviteten av å generere musen iPSCs fra DMDMDX mus avledet hud Fibroblast ved hjelp av integrering-fri omprogrammering vektorer. Figur 1a viste at utseendet på embryonale stamceller (ESC)-lignende kolonier på tre uker etter smitte. Vi evaluerer effektiviteten til iPSC induksjon ved Live alkalisk fosfatase (AP) beis; Figur 1B viser at prose...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Her presenterer vi en Cas9-basert exon23 sletting protokoll for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i iPSC fra DMDMDX mus-avledet hud fibroblaster og direkte differensiere iPSCs til myogenic stamceller (MPC) ved hjelp av tet-on MyoD aktiveringssystem.

CRISPR/Cas9 teknologi i gjenopprette Dystrofingenet uttrykk i iPSC-avledet Muscle forfedre

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne er en muskeldystrofi forårsaker for tidlig utmattende muskel stamceller. Det er en av de mest alvorlige muskeldystrofiene. For å fremme en funksjonell muskelregenerering bruker vi CRISPR/Cas9-mediert genredigering for å gjenopprette dystrophinuttrykk i induserte pluripotente stamcelleavledede muskeltamtamceller.CRISPR-Cas9 genredigering har potensial til å gjenopprette dystrophin genuttrykk. Autologe iPSC-avledede muskel stamceller kan fylle stamcelleporene, reparere skade, og forhindre ytterligere komplikasjoner i DMD uten å forårsake en immunrespons. Ulike midler av iPS-celler i myogene stamceller reduserte risikoen for tumorregenerert genese i iPS-celler.Flere terapier som kombinerer autolog indusert pluripotent stamcelle-avledet muskel stamceller med CRISPR-Cas9-mediert genetisk korreksjon er lovende Duchenne Muskeldystrofi behandlingsstrategier. Denne teknologien kan brukes til å behandle mange medfødte sykdommer ved genetisk redigering autologe stamceller, inkludert hjerte, hjerne, og blodsykdom. Vi viste demonstrasjon av denne tilnærmingen kan gi leserne erfaring i håndtering av celleomprogrammering og genredigering, noe som fortsatt er en utfordring.Under et omvendt mikroskop, undersøk koloniene til infiserte mus embryonale stamceller. Merk koloniene nederst på parabolen med den selv-inking objektmarkøren. Påfør smurte kloning ringer for å dekke de merkede cellekoloniene.Tilsett 100 mikroliter på 0,05 % Trypsin-EDTA i hver kloningring og legg platen i en inkubator ved 37 grader Celsius i fem minutter. Deretter overfører du de fordøyde cellene med 100 mikroliter pipettespisser til 48-brønns kulturplater som inneholder 250 milliliter MES-vekstmedium. Inkuber cellene i 37 Grader Celsius inkubator med 5% karbondioksid og 85% fuktighet.Når de leser 70% samløpet, velg brønnene med godt dyrkede celler og legg til 250 milliliter TVP-løsning for å fordøye i 30 minutter. Deretter overfører du cellekulturen fra hver brønn til en seks centimeter rett. Gjenta påføring av kloning ringer og inkubasjon i flere ganger til uniform, dorm-formet kloner er oppnådd.Nå fordøyer du de forberedte musen iPSCene ved å legge til en milliliter TVP-løsning. Overfør cellekulturen til en 24-brønns plate belagt med Fibronectin og Gelatin og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Når cellene når 50% samløpet, bytt til 500 mikroliter frisk kultur medium som inneholder åtte mikrogram per milliliter polybrene.Deretter legger du til 100 mikroliter av lentiviralpartikkelløsningen til musens iPSCer. Inkuber cellene i tre dager ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid. Deretter bestemmer du minimumskonsentrasjonen av Blasticidin og Hygromycin B som er på halv drapshastighet innen 24 timer.Legg til mediet på 2,5 mikrogram per milliliter Blasticidin og 100 mikrogram per milliliter Hygromycin B i cellene, vent i tre dager, og velg cellene som forblir tilhenger som stabling infiserte celler. Fordøy de valgte musen iPSCene med 0,5 milliliter TVP-løsning, hver brønn i en ny 24-brønnsplate, og inkuber celler i 30 minutter ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid. Deretter pipette iPSCene i enkeltceller og telle cellene med et celletellingskammer.Velg ca 150 fordøyde enkeltceller og fortynne med MES medium i 10 centimeter parabolen, kultur på 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Etter ca 10 dager, under et omvendt mikroskop, bruk 10 mikroliter sterile pipettespisser for å plukke enkeltkolonier og overføre hver koloni til 50 mikroliter TVP-løsning i en 96-brønns plate. Digest ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Pålitelig manuell kloning plukking er avgjørende for suksessen med å høste CRISPR / Cas9-redigerte induserte pluripotente stamceller. Deretter overfører og deler du de fordøyde cellene fra hver brønn inn i ytterligere to 96-brønns kulturplater. Inkuber ved 37 grader Celsius til 70% samløpet.Med cellekoloniene ved 70% samløpet, fjern mediet i 96-brønnplaten. Tilsett 25 mikroliter lysis reagens som inneholder 1% Proteinase K-løsning til hver brønn og overfør lysatet til en annen 96-brønns PCR-plate. Forsegle PCR-platen med selvklebende tetninger og inkuber platen i en termisk cycler ved 55 grader Celsius i 30 minutter og deretter ved 95 grader Celsius i 45 minutter for å lyse cellene og denatur proteinase K.Then, i et PCR-rør, tilsett to mikroliter av lysatet, 10 mikroliter 2x DNA Polymerase Premix, 7 mikroliter DNase-fritt vann , og en mikroliter dmd Exon23 primere.Start PCR-reaksjonen i henhold til manuskriptet. Deretter laster du PCR-reaksjonen som følger med 2,2 mikroliter lastebuffer på en 2% agarose gel. Kjør gelen på 100 til 150 volt i 30 minutter og inspiser gelen under UV-lys.I denne protokollen ble to guide-RNA-er som flankerer mutanten Exon23 utformet. Etter at Cas9-medierte dobbelttrådet pauser og ikke-homolog slutt-sammenføyning, mutant Exon23 ble slettet, slik at for avkortet, men funksjonell Dystrophin produksjon. For å unngå lekkasje av Trypsin-løsning, må vi påføre fett jevnt til bunnen av ringene.Kombinasjonen av CRISPR/Cas9 genomredigering med et taklet MyoD-aktiveringssystem gir en sikker, gjennomførbar og effektiv strategi for autolog transplantasjon hos Duchenne muskeldystrofipasienter med gengjenoppretting basal stamceller.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generering av IPSC-avledet menneskelige hjerne Organoids til Model Tidlig nevrologiske lidelser

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av transgene genuttrykk i Individuell Netthinnestamfedre i kimære Sebrafisk embryoer å studere Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Bruk av RNAi og varme-sjokk-indusert transkripsjon faktor uttrykk å omprogrammere bakterie celler til nerveceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

En in vitro 3D modell og beregningsorientert rørledning å kvantifisere det Vasculogenic potensialet av iPSC-avledet endothelial forfedre

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...