Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang e Weintraub foram parcialmente apoiados por NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Todos os procedimentos cirúrgicos e de manuseio de animais foram realizados por um protocolo aprovado pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Augusta (IACUC). Camundongos foram alimentados com dieta padrão e água ad libitum.
1. isolamento de fibroblastos primários do mouse de camundongos DMDMDX adultos
<ol><li>Eutanize adultos DMDMDX camundongos (masculino, 2 meses de idade) por co2 asfixia e toracotomia de acordo com iacuc ...

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença hereditária destrutiva e finalmente fatal caracterizada pela falta de distrofina, levando à atrofia progressiva do músculo1,2. Nossos resultados demonstram a expressão restaurada do gene do distrophin em pilhas de progenitor myogenic de DMDMDX IPSC-derivadas pela aproximação do apagamento EXON23 de crispr/Cas9-negociado. Esta abordagem tem três vantagens.
Primeiram...

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma das distrofias musculares mais comuns e é caracterizada pela ausência de distrofina, afetando 1 de aproximadamente 5.000 meninos recém-nascidos no mundo inteiro1. A perda da função do gene da distrofina resulta em defeitos estruturais do músculo que conduzem à degeneração progressiva do myofibers1,2. O vírus adeno-associado recombinante (rAAV)-o sistema mediado da terapia de gene foi testado para restaurar a expressão do distrophin e para melhorar a função do músculo, tal como a recolocação do gene usando micro-distrophins (μ-DYS). No entanto, a abordagem Raav requer injeções repetidas para sustentar a expressão da proteína funcional3,4. Conseqüentemente, nós precisamos uma estratégia que possa fornecer eficazmente e permanentemente a expressão de gene da distrofina da recuperação nos pacientes com DMD. O DMDMDX mouse, um modelo de mouse para DMD, tem uma mutação de ponto no exon 23 do gene distrofina que introduz um Codon terminação prematura e resulta em uma proteína não-funcional truncado faltando o domínio de ligação C-terminal distroglicanos. Estudos recentes demonstraram o uso da tecnologia crispr/Cas9 para restaurar a expressão gênica de distrofina por correção genética exata ou deleção do exon mutante em animais pequenos e grandes5,6,7. Long et al.8 relataram o método para corrigir a mutação genética da distrofina na germline de DMDMDX mouse por meio da edição do genoma de crispr/Cas9 com base na reparação dirigida por homologia (HDR). El Refaey et al.9 relataram que a Raav poderia, com eficiência, Exir o mutante 23 em camundongos distróficos. Nestes estudos, os grnas foram projetados nos íntrons 20 e 23 para causar rupturas dobro-encalhadas do ADN, que restaurou parcialmente a expressão do distrophin após o reparo do ADN através da junção não-homóloga da extremidade (nhej). Ainda mais excitante, Amoasii et al.10 relataram recentemente a eficácia e a viabilidade da edição do gene crispr mediado pela Raav na restauração da expressão de distrofina em modelos caninos, um passo essencial na futura aplicação clínica.
DMD também provoca distúrbios da célula-tronco11. Para danos musculares, células-tronco musculares residenciais reabastecem células musculares morrendo após a diferenciação muscular. No entanto, os ciclos consecutivos de lesão e reparo levam ao encurtamento dos telômeros nas células-tronco musculares12e depleção prematura de pools de células-tronco13,14. Conseqüentemente, uma combinação de terapia autóloga da pilha de haste com edição do genoma para restaurar a expressão do distrophin pode ser uma aproximação prática para tratar DMD. A tecnologia CRISPR/Cas9 fornece a possibilidade de gerar células-tronco pluripotentes induzidas geneticamente autólogas (iPSC) para a regeneração muscular funcional e evitar complicações adicionais da DMD sem causar rejeição imune. Entretanto, os iPSCs têm um risco da formação do tumor, que poderia ser aliviado pela diferenciação de iPSC em pilhas myogenic do progenitor.
Neste protocolo, nós descrevemos o uso do vírus de Sendai não-integrando a reprogramação fibroblasto dérmicos de ratosMDX de DMD em iPSCs e recuperamos então a expressão do distrophin pelo apagamento do genoma de crispr/Cas9. Após a validação do apagamento Exon23 em iPSC pela genotipagem, nós diferenciamos o iPSC genoma-corrigido em progenitores myogenic (MPC) através da diferenciação myogenic MyoD-induzida.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença progressiva severa do músculo causada por mutações no gene da distrofina, que conduz finalmente ao esgotamento de pilhas do progenitor do músculo. Agrupadas regularmente interespaçadas repetições palindromic curtas/CRISPR-Associated 9 (CRISPR/Cas9) edição de gene tem o potencial para restaurar a expressão do gene distrofina. As pilhas de haste pluripotentes induzidas autólogas (iPSCs)-células progenitoras derivadas do músculo (MPC) podem reabastecer a associação da pilha da haste/progenitor, reparar dano, e impedir umas complicações mais adicionais no DMD sem causar uma resposta imune. Neste estudo, nós introduzimos uma combinação de CRISPR/Cas9 e de tecnologias não-integradas de iPSC para obter progenitores do músculo com expressão recuperada da proteína do distrophin. Resumidamente, utilizamos um vetor de Sendai não integradora para estabelecer uma linha de iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de camundongos DMDMDX . Nós usamos então a estratégia do apagamento de CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão do distrophin através de uma junção não-homóloga da extremidade do gene reframed da distrofina. Depois que a validação do PCR da prostração exon23 em três colônias de 94 escolheu colônias de IPSC, nós diferenciamos IPSC em MPC pela expressão doxiciclina (Dox)-induzida de MyoD, um fator chave da transcrição que joga um papel significativo em regular a diferenciação do músculo. Nossos resultados demonstram a viabilidade do uso da estratégia de deleção CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão de distrofina no MPC derivado do iPSC, que tem um potencial significativo para o desenvolvimento de terapias futuras para o tratamento da DMD.

Estabelecimento de fibroblastos de pele DMDMDX derivados de IPSC. Demonstramos a eficiência da geração de iPSCs de mouse a partir de fibroblastos de pele derivados DMDMDX usando os vetores de reprogramação sem integração. A Figura 1a demonstrou que a aparência de células-tronco embrionárias (ESC)-como colônias em três semanas após a infecção. Nós avaliamos a eficiência da indução de iPSC pela mancha alcalina viva da fosfatas...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Aqui, nós apresentamos um protocolo de apagamento exon23 baseado em Cas9 para restaurar a expressão de distrofina em iPSC de fibroblastos de pele derivados do mouseMDX DMD e diferenciar diretamente iPSCs em células progenitoras miogênicas (MPC) usando o sistema de ativação Tet-on MyoD.

Tecnologia CRISPR/Cas9 na restauração da expressão de distrofina em progenitores musculares derivados de iPSC

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne é uma distrofia muscular que causa exaustão prematura de células progenitoras musculares. É uma das distrofias musculares mais severas. Para promover uma regeneração muscular funcional, usamos a edição de genes mediados pelo CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão da distrofina em células progenitoras musculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas.A edição do gene CRISPR-Cas9 tem o potencial de restaurar a expressão genética da distrofina. Células progenitoras musculares derivadas do iPSC podem repor o poro de células-tronco, reparar danos e evitar complicações adicionais no DMD sem causar uma resposta imune. Diferentes agentes das células iPS em células progenitoras miogênicas reduziram o risco de re-gênese tumoral em células iPS.Várias terapias que combinam células progenitoras músculos pluripotentes pluripotentes auto-autólogos com correção genética mediada por CRISPR-Cas9 estão prometendo estratégias de tratamento de distrofia muscular de Duchenne. Essa tecnologia pode ser usada para tratar muitas doenças congênitas editando geneticamente células-tronco autólogas, incluindo doenças cardíacas, cerebrais e sanguíneas. Mostramos que a demonstração dessa abordagem pode proporcionar aos leitores experiência no manuseio de reprogramação celular e edição de genes, o que continua sendo um desafio.Sob um microscópio invertido, examine as colônias de células-tronco embrionárias de camundongos infectados. Marque as colônias no fundo do prato com o marcador de objeto auto-inking. Aplique anéis de clonagem untadas para cobrir as colônias de células marcadas.Adicione 100 microliters de 0,05% Trypsin-EDTA a cada anel de clonagem e coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, transfira as células digeridas com pontas de pipeta de 100 microliteres para placas de cultura de 48 poços contendo 250 mililitros de meio de crescimento MES. Incubar as células na incubadora 37 Graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 85% de umidade.Quando lerem 70% de confluência, selecione os poços com células bem cultivadas e adicione 250 mililitros de solução TVP para digerir por 30 minutos. Em seguida, transfira a cultura celular de cada poço para um prato de seis centímetros. Repita a aplicação de anéis de clonagem e incubação por várias vezes até que clones uniformes em forma de dormitório sejam obtidos.Agora, digerir os iPSCs do mouse preparados adicionando um mililitro de solução TVP. Transfira a cultura celular para uma placa de 24 poços revestida com Fibronectina e Gelatina e incubar a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5%. Depois que as células atingirem 50% de confluência, mude para 500 microliters de meio de cultura fresca contendo oito microgramas por mililitro Polybrene.Em seguida, adicione 100 microliters da solução de partícula lentiviral aos iPSCs do mouse. Incubar as células por três dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, determine a concentração mínima de Blasticidin e Hygromiccin B que está em meia taxa de morte dentro de 24 horas.Adicione a mídia de 2,5 microgramas por mililitro Blasticidin e 100 microgramas por mililitro Hygromycin B nas células, espere por três dias e selecione as células que permanecem aderentes como células infectadas por estada. Digerir os iPSCs de mouse selecionados com 0,5 mililitros de solução TVP, cada um bem em uma nova placa de 24 poços, e incubar células por 30 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, pipeta os iPSCs em células únicas e conte as células com uma câmara de contagem de células.Selecione cerca de 150 células únicas digeridas e dilua com mes médio em prato de 10 centímetros, cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após cerca de 10 dias, sob um microscópio invertido, use 10 dicas de pipeta estéril microliter para escolher colônias únicas e transferir cada colônia para 50 microlitros de solução TVP em uma placa de 96 poços. Digerir a 37 graus Celsius por 30 minutos.A clonagem manual confiável é fundamental para o sucesso da colheita de células-tronco pluripotentes induzidas pelo CRISPR/Cas9. Em seguida, transfira e divida as células digeridas de cada poço em outras duas placas de cultura de 96 poços. Incubar a 37 graus Celsius até 70% confluente.Com as colônias de células com 70% de confluência, remova o meio na placa de 96 poços. Adicione 25 microliters de reagente Lysis contendo 1% de solução Proteinase K para cada poço e transfira o lysate para outra placa PCR de 96 poços. Sele a placa PCR com vedações adesivas e incubar a placa em um cicloviário térmico a 55 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, a 95 graus Celsius por 45 minutos para lise as células e desnaturar o Proteinase K.Então, em um tubo PCR, adicione dois microliters do lysate, 10 microliters de 2x DNA Polymerase Premix, 7 microliters de água livre de DNase , e um microliter de primers DMD Exon23.Inicie a reação do PCR de acordo com o manuscrito. Em seguida, carregue a reação do PCR fornecida com 2,2 microliters de tampão de carga em um gel de 2%agarose. Execute o gel a 100 a 150 volts por 30 minutos e inspecione o gel sob luz UV.Neste protocolo, dois guias RNAs que flanqueiam o mutante Exon23 foram projetados. Depois de quebras duplas mediadas por Cas9 e finalização não homólogo, o mutante Exon23 foi excluído, permitindo a produção truncada, mas funcional de Distrofina. Para evitar o vazamento da solução Trypsin, precisamos aplicar graxa uniformemente na parte inferior dos anéis.A combinação de edição de genomas CRISPR/Cas9 com um sistema de ativação myoD afixado fornece uma estratégia segura, viável e eficaz para transplante autólogo em pacientes com distrofia muscular de Duchenne com células progenitoras basais de recuperação genética.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...