Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang y Weintraub fueron parcialmente compatibles con NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Todos los procedimientos quirúrgicos y de manejo de animales fueron realizados por un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Augusta (IACUC). Los ratones fueron alimentados con dieta estándar y agua ad libitum.
1. Aislamiento de fibroblastos primarios de ratón de ratones Dmdmdx adultos
<ol><li>Euthanizar adultodmdx ratones (masculino, 2 meses de edad) por asfixia deCO2 y toracotomía según IACUC a...

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad hereditaria destructiva y, en última instancia, mortal caracterizada por la falta de distrofina, lo que conduce a la atrofia muscular progresiva1,2. Nuestros resultados demuestran la expresión del gen de la distrofina restaurada en las células progenitoras miogénicas derivadas de Dmdmdx iPSC mediante el enfoque de la eliminación del exón23 mediado por CRISPR/Cas9. Este enfoque tiene tres v...

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las distrofias musculares más comunes y se caracteriza por la ausencia de distrofina, afectando a 1 de aproximadamente 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo1. La pérdida de la función del gen de la distrofina da lugar a defectos musculares estructurales que conducen a la degeneración progresiva de las miofibras1,2. Se ha probado el sistema de terapia génica mediado por el virus adeno asociado recombinante (rAAV) para restaurar la expresión de la distrofina y mejorar la función muscular, como el reemplazo de genes mediante microdistrophins(-Dys). Sin embargo, el enfoque de rAAV requiere inyecciones repetidas para sostener la expresión de la proteína funcional3,4. Por lo tanto, necesitamos una estrategia que pueda proporcionar de manera efectiva y permanente la expresión génica de la distrofina en pacientes con DMD. El ratón Dmdmdx, un modelo de ratón para DMD, tiene una mutación puntual en el exón 23 del gen de la distrofina que introduce un codón de terminación prematura y da como resultado una proteína truncada no funcional que carece del dominio de unión de distroglicano C-terminal. Estudios recientes demostraron el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión del gen de la distrofina mediante una corrección génica precisa o la eliminación de exón mutante en animales pequeños y grandes5,6,7. 8 informaron del método para corregir la mutación del gen de la distrofina en la línea germinal del ratón Dmdmdx por reparación dirigida por homología (HDR) basada en la edición del genoma CRISPR/Cas9. 9informaron que el rAAV podría extirpar eficientemente el exón 23 mutante en ratones distróficos. En estos estudios, los gRNA fueron diseñados en los intrones 20 y 23 para causar roturas de ADN de doble cadena, que restauraron parcialmente la expresión de distrofina después de la reparación del ADN a través de la unión final no homóloga (NHEJ). 10 recientemente informaron de la eficacia y viabilidad de la edición de genes CRISPR mediada por rAAV en la restauración de la expresión de distrofina en modelos caninos, un paso esencial en la aplicación clínica futura.
DMD también causa trastornos de las células madre11. Para el daño muscular, las células madre musculares residenciales reponen las células musculares moribundas después de la diferenciación muscular. Sin embargo, los ciclos consecutivos de lesión y reparación conducen a la acortación de telómeros en las células madre musculares12,y el agotamiento prematuro de las agrupaciones de células madre13,14. Por lo tanto, una combinación de terapia de células madre autóloga con edición del genoma para restaurar la expresión de la distrofina puede ser un enfoque práctico para el tratamiento de la DMD. La tecnología CRISPR/Cas9 ofrece la posibilidad de generar células madre pluripotentes inducidas genéticamente autodescriptivas (iPSC) para la regeneración muscular funcional y prevenir más complicaciones de DMD sin causar rechazo inmune. Sin embargo, los ISPC tienen un riesgo de formación de tumores, que podría aliviarse mediante la diferenciación de iPSC en células progenitoras miogénicas.
En este protocolo, describimos el uso del virus Sendai no integrador para reprogramar fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx en isPC y luego recuperar la expresión de distrofina mediante la eliminación del genoma CRISPR/Cas9. Después de la validación de la eliminación de Exon23 en iPSC por genotipado, diferencimos el iPSC corregido por genoma en progenitores miogénicos (MPC) a través de la diferenciación miogénica inducida por MyoD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular progresiva grave causada por mutaciones en el gen de la distrofina, que en última instancia conduce al agotamiento de las células progenitoras musculares. La edición de genes 9 (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada tiene el potencial de restaurar la expresión del gen de la distrofina. Las células progenitoras musculares derivadas de células madre (iPSC) derivadas de células anticuarias derivadas de la ínloga (IPSC) pueden reponer la agrupación de células madre/progenitoras, reparar el daño y prevenir más complicaciones en dMD sin causar una respuesta inmunitaria. En este estudio, introducimos una combinación de tecnologías CRISPR/Cas9 y iPSC no integradas para obtener progenitores musculares con expresión de proteína de distrofina recuperada. Brevemente, utilizamos un vector Sendai no integrador para establecer una línea iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx. A continuación, utilizamos la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de la distrofina a través de una unión final no homóloga del gen de la distrofina reenmarcada. Después de la validación de PCR de agotamiento de exon23 en tres colonias de 94 colonias iPSC escogidas, diferenciamos iPSC en MPC por expresión de MyoD inducida por doxiciclina (Dox), un factor de transcripción clave que desempeña un papel significativo en la regulación de la diferenciación muscular. Nuestros resultados muestran la viabilidad de utilizar la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en MPC derivado de iPSC, que tiene un potencial significativo para desarrollar terapias futuras para el tratamiento de la DMD.

Establecimiento de fibroblastos cutáneos Dmdmdx derivados de iPSC. Demostramos la eficiencia de generar iPSCs de ratón a partir de ratones Dmdmdx derivados de fibroblastos cutáneo utilizando los vectores de reprogramación sin integración. La Figura 1A demostró que la aparición de colonias similares a células madre embrionarias (ESC) a las tres semanas después de la infección. Evaluamos la eficiencia de la inducción de iPSC por manch...

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CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.

Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne es una distrofia muscular que causa agotamiento prematuro de las células progenitoras musculares. Es una de las distrofias musculares más graves. Para promover una regeneración muscular funcional, utilizamos la edición de genes mediado por CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en células progenitoras musculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas.La edición del gen CRISPR-Cas9 tiene el potencial de restaurar la expresión génica de la distrofina. Las células progenitoras musculares derivadas de iPSC autólogos pueden reponer el poro de las células madre, reparar el daño y prevenir complicaciones adicionales en la DMD sin causar una respuesta inmunitaria. Diferentes agentes de células iPS en células progenitoras miogénicas redujeron el riesgo de regénesis tumoral en las células iPS.Varias terapias que combinan células progenitoras musculares derivadas de células madre inducidas inducidas por autólogos con corrección genética mediada por CRISPR-Cas9 están prometiendo estrategias de tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne. Esta tecnología se puede utilizar para tratar muchas enfermedades congénitas mediante la edición genética de células madre autólogas, incluyendo el corazón, el cerebro y las enfermedades de la sangre. Mostramos que la demostración de este enfoque puede proporcionar a los lectores experiencia en el manejo de la reprogramación celular y la edición de genes, lo que sigue siendo un desafío.Bajo un microscopio invertido, examine las colonias de células madre embrionarias de ratón infectadas. Marque las colonias en la parte inferior del plato con el marcador de objeto autointinuada. Aplique anillos de clonación engrasados para cubrir las colonias celulares marcadas.Agregue 100 microlitros de 0.05%Trypsin-EDTA a cada anillo de clonación y coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, transfiera las células digeridas con puntas de pipeta de 100 microlitros a placas de cultivo de 48 pozos que contengan 250 mililitros de medio de crecimiento MES. Incubar las células en la incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 85% de humedad.Cuando leen 70%confluencia, seleccione los pozos con células bien cultivadas y agregue 250 mililitros de solución TVP para digerir durante 30 minutos. Luego, transfiera el cultivo celular de cada pozo a un plato de seis centímetros. Repita la aplicación de anillos de clonación e incubación varias veces hasta obtener clones uniformes en forma de dormitorio.Ahora, digiere los iPSC de ratón preparados agregando un mililitro de solución TVP. Transfiera el cultivo celular a una placa de 24 pozos recubierta con Fibronectina y Gelatina e incubar a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Después de que las células alcancen el 50% de confluencia, cambie a 500 microlitros de medio de cultivo fresco que contienen ocho microgramos por mililitro de polibrene.A continuación, añada 100 microlitros de la solución de partículas lentivirales a los iPSC del ratón. Incubar las células durante tres días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. A continuación, determinar la concentración mínima de Blasticidin y Hygromicina B que está a la mitad de la tasa de muerte dentro de 24 horas.Agregue el medio de 2,5 microgramos por mililitro Blasticidin y 100 microgramos por mililitro de higromicina B a las células, espere tres días y seleccione las células que permanecen adherentes como células infectadas estables. Digerir los iPSC de ratón seleccionados con 0,5 mililitros de solución TVP, cada uno en una nueva placa de 24 pocillos, e incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Luego, pipetee los iPSC en celdas individuales y cuente las células con una cámara de conteo de células.Seleccione alrededor de 150 células individuales digeridas y diluya con mes medios en un plato de 10 centímetros, cultivo a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de unos 10 días, bajo un microscopio invertido, utilice 10 puntas de pipeta estériles microlitro para recoger colonias individuales y transferir cada colonia a 50 microlitros de solución TVP en una placa de 96 pozos. Digerir a 37 grados centígrados durante 30 minutos.La recolección manual fiable de clonación es fundamental para el éxito de la cosecha de células madre pluripotentes inducidas por CRISPR/Cas9 editadas por CRISPR/Cas9. Luego, transfiera y divida las células digeridas de cada pozo en otras dos placas de cultivo de 96 pozos. Incubar a 37 grados centígrados hasta el 70% confluente.Con las colonias celulares al 70% de confluencia, retire el medio en la placa de 96 pozos. Añadir 25 microlitros de reactivo de lysis que contengan 1%De solución de Proteinasa K a cada pozo y transferir el lisosato a otra placa PCR de 96 pozos. Sellar la placa PCR con sellos adhesivos e incubar la placa en un ciclor térmico a 55 grados Celsius durante 30 minutos y luego a 95 grados Celsius durante 45 minutos para angarizar las células y desnaturalizar la Proteinase K.Then, en un tubo PCR, añadir dos microlitros del lisosato, 10 microlitros de 2x DNA Polymerase Premix, 7 microlitros de DNase , y un microlitro de imprimaciones DMD Exon23.Inicie la reacción PCR según el manuscrito. A continuación, cargue la reacción PCR suministrada con 2,2 microlitros de tampón de carga en un gel de 2% de agarosa. Ejecute el gel a 100 a 150 voltios durante 30 minutos e inspeccione el gel con luz UV.En este protocolo, se diseñaron dos ARN guía que flanquean al mutante Exon23. Después de que Cas9 mediara roturas de doble cadena y unión final no homóloga, el mutante Exon23 fue eliminado, permitiendo la producción de distrofina truncada pero funcional. Para evitar la fuga de la solución de Trypsin, necesitamos aplicar grasa uniformemente en la parte inferior de los anillos.La combinación de la edición del genoma CRISPR/Cas9 con un sistema de activación MyoD tachado proporciona una estrategia segura, factible y eficaz para el trasplante autólogo en pacientes con distrofia muscular de Duchenne con células progenitoras basales de recuperación génica.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...