Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang och Weintraub stöddes delvis av NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

All hantering av djur och kirurgiska ingrepp utfördes av ett protokoll som godkändes av Augusta University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC). Möss matades standard diet och vatten AD libitum.
1. isolering av primära mus fibroblaster från vuxna DMDMDX -möss
<ol><li>Euthanize vuxna DMDMDX möss (hane, 2 månader gammal) genom Co2 kvävning och thorakotomi enligt Iacuc godkänd av Medical College of Georgia, Augusta University. ...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparks,+signals+and+shock+absorbers:+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy.">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li><li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors.">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li><li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies.">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy.">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en destruktiv och ytterst dödlig ärftlig sjukdom som kännetecknas av brist på dystrofin, vilket leder till progressiv muskelatrofi1,2. Våra resultat visar den återställda dystrofin genuttryck i DMDMDX IPSC-härledda myogena stamceller genom att närma sig CRISPR/Cas9-medierad exon23 radering. Detta tillvägagångssätt har tre fördelar.
Först genererade vi iPSCs från DMDMDX</...

Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en av de vanligaste muskeldystrofierna och kännetecknas av frånvaron av dystrofin, som drabbar 1 av cirka 5 000 nyfödda pojkar över hela världen1. Förlust av dystrofin genfunktion resulterar i strukturella muskel defekter som leder till progressiv myofibers degeneration1,2. Rekombinant Adeno-associerat virus (Raav)-medierad genterapi system har testats för att återställa dystrofin uttrycket och förbättra muskelfunktion, såsom gen ersättning med mikro-dystrofiner (μ-DYS). Emellertid, den Raav tillvägagångssätt kräver upprepade injektioner att upprätthålla uttrycket av det funktionella proteinet3,4. Därför behöver vi en strategi som kan ge effektivt och permanent återvinna dystrofin genuttryck hos patienter med DMD. DMDMDX Mouse, en musmodell för DMD, har en punktmutation i exon 23 av dystrofin genen som introducerar en förtida uppsägning kodon och resulterar i ett icke-funktionellt stympat protein saknar C-Terminal dystroglycan bindande domän. Nyligen genomförda studier visat användning av CRISPR/Cas9 teknik för att återställa dystrofin genuttryck genom noggrann gen korrigering eller mutant exon radering i små och stora djur5,6,7. Long et al.8 rapporterade metoden för att korrigera dystrofin genmutation i DMDMDX Mouse köns cells av Homology-riktad reparation (HDR) baserad CRISPR/Cas9 Genome redigering. El Refaey et al.9 rapporterade att Raav effektivt kunde punktskatter den muterade exon 23 i dystrofiska möss. I dessa studier utformades grnas i introner 20 och 23 för att orsaka dubbelsträngade DNA-raster, som delvis återställde dystrofin-uttrycket efter DNA-reparation via icke-homolog ändsammanfogning (nhej). Ännu mer spännande, amoasii et al.10 rapporterade nyligen effekt och genomförbarhet av Raav-medierad CRISPR genredigering i återställa dystrofin uttryck i Hundarnas modeller, ett viktigt steg i framtida klinisk tillämpning.
DMD orsakar också stamcells sjukdomar11. För muskel skada, bostäder muskelstamceller fylla döende muskelceller efter muskel differentiering. Emellertid, i följd cykler av skada och reparation leda till förkortning av telomererna i muskelstamceller12, och förtida utarmning av stamceller pooler13,14. Därför kan en kombination av autolog stamcellsterapi med genom-redigering för att återställa dystrofin uttryck vara en praktisk metod för behandling av DMD. Den CRISPR/Cas9 teknik ger möjlighet att generera autololog genetiskt korrigerade inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) för funktionell muskel förnyelse och förhindra ytterligare komplikationer av DMD utan att orsaka immun avvisande. Emellertid, iPSCs har en risk för tumör bildning, som skulle kunna lindras genom differentiering av iPSC i myogena stamceller.
I detta protokoll beskriver vi användningen av icke-integrera Sendai virus för att omprogrammering dermal fibroblaster av DMDMDX -möss i iPSCs och sedan återhämta dystrofin uttryck genom CRISPR/Cas9 genomradering. Efter validering av Exon23 radering i iPSC av genotypning, differentierade vi Genome-korrigerad iPSC till Myogenic stamceller (MPC) via MyoD-inducerad myogen differentiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en svår progressiv muskelsjukdom som orsakas av mutationer i dystrofin genen, vilket i slutändan leder till utmattning av muskelstamceller. Grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner/CRISPR-associerad 9 (CRISPR/Cas9) genredigering har potential att återställa uttrycket av dystrofin genen. Autoloka inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)-härledda muskelstamceller (MPC) kan fylla stammen/stamceller pool, reparera skador, och förhindra ytterligare komplikationer i DMD utan att orsaka ett immunsvar. I denna studie introducerar vi en kombination av CRISPR/Cas9 och icke-integrerade iPSC-teknologier för att få muskelstamceller med återvunna dystrofin-proteinuttryck. Kortfattat använder vi en icke-integrera Sendai vektor för att etablera en iPSC linje från dermal fibroblaster av DMDMDX möss. Vi använder sedan CRISPR/Cas9 deletion strategi för att återställa dystrofin uttryck genom en icke-homolog sammanfogning av ominramade dystrofin genen. Efter PCR validering av exon23 utarmning i tre kolonier från 94 plockade iPSC kolonier, vi differentierar iPSC till MPC av doxycyklin (DOX)-inducerad uttryck av MyoD, en viktig transkription faktor spelar en viktig roll i regleringen av muskel differentiering. Våra resultat visar genomförbarheten av att använda CRISPR/Cas9 deletion strategi för att återställa dystrofin uttryck i IPSC-härledda MPC, som har betydande potential för att utveckla framtida terapier för behandling av DMD.

Inrättande av DMDMDX Skin fibroblaster härledda IPSC. Vi demonstrerade effektiviteten för att generera mus iPSCs från DMDMDX möss härledd hud fibroblast med hjälp av integrations fria omprogrammering vektorer. Figur 1a visade att uppkomsten av embryonala STAMCELLER (ESC)-liknande kolonier vid tre veckor efter infektion. Vi utvärderar effektiviteten av iPSC induktion av levande alkaliskt fosfatas (AP) fläcken; Figu...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Här presenterar vi en Cas9-baserade exon23 radering protokoll för att återställa dystrofin uttryck i IPSC från DMDMDX mus-derived hud fibroblaster och direkt differentiera iPSCs till Myogenic progenitorceller (MPC) med hjälp av tet-on MyoD aktiveringssystem.

CRISPR/Cas9-teknik för att återställa Dystrophin uttryck i iPSC-derived muskel progenitorer

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne är en muskeldystrofi orsakar för tidigt ansträngande av muskel stamceller stamceller. Det är en av de allvarligaste muskeldystrofier. För att främja en funktionell muskelregenerering använder vi CRISPR/Cas9-medierad genredigering för att återställa dystrofinuttryck i inducerade pluripotenta stamceller-härledda muskel progenitor celler.CRISPR-Cas9-genredigeringen har potential att återställa dystrofingenuttrycket. Autolog iPSC-härledda muskel stamceller stamceller celler kan fylla på stamceller por, reparera skador, och förhindra ytterligare komplikationer i DMD utan att orsaka ett immunsvar. Olika medel av iPS-celler i Myogenic Progenitor Celler minskade risken för tumör re-genesis i iPS-celler.Flera terapier som kombinerar autologa Induced Pluripotent Stem Cell-härledda muskel stamceller stamceller celler med CRISPR-Cas9-medierad genetisk korrigering är lovande Duchennes muskeldystrofi behandlingsstrategier. Denna teknik kan användas för att behandla många medfödda sjukdomar genom att genetiskt redigera autologa stamceller, inklusive hjärta, hjärna och blodsjukdom. Vi visade demonstration av detta tillvägagångssätt kan ge läsarna med erfarenhet av att hantera cell omprogrammering och genredigering, som fortfarande är en utmaning.Under ett inverterat mikroskop, undersöka kolonierna av infekterade mus embryonala stamceller. Markera kolonierna längst ner i skålen med självinkande objektmarkör. Applicera infettade kloningringar för att täcka de markerade cellkolonierna.Tillsätt 100 mikroliter på 0,05%Trypsin-EDTA till varje kloningsring och placera plattan i en inkubator på 37 grader Celsius i fem minuter. Sedan överför du de smälta cellerna med 100-mikroliterpipetsar till 48-brunnskulturplattor som innehåller 250 milliliter MES-tillväxtmedium. Inkubera cellerna i inkubatorn 37 Degree Celsius med 5%Koldioxid och 85%-luftfuktighet.När de läser 70%sammanflödet, välj brunnarna med välvuxna celler och tillsätt 250 milliliter AVTP-lösning för att smälta i 30 minuter. Överför sedan cellkulturen från varje brunn till en sex centimeters maträtt. Upprepa tillämpa kloning ringar och inkubation i flera gånger tills enhetliga, dorm-formade kloner erhålls.Nu, smälta den förberedda musen iPSCs genom att lägga till en milliliter av TVP-lösning. Överför cellkulturen till en 24-brunnsplatta belagd med Fibronectin och Gelatin och inkubera vid 37 grader Celsius med 5%Koldioxid. Efter att cellerna nått 50%sammanflödet, byta till 500 mikroliter av färskt odlingsmedium som innehåller åtta mikrogram per milliliter Polybrene.Lägg sedan till 100 mikroliter av lentiviral partikellösningen till musens iPSCs. Inkubera cellerna i tre dagar vid 37 grader Celsius med 5%Koldioxid. Därefter bestämmer den minsta koncentrationen av Blasticidin och Hygromycin B som är på halv döda takt inom 24 timmar.Lägg till media på 2,5 mikrogram per milliliter Blasticidin och 100 mikrogram per milliliter Hygromycin B i cellerna, vänta i tre dagar och välj de celler som förblir vidhäftande som uppställningsinfekterade celler. Smält de utvalda mus iPSCs med 0,5 milliliter AV TVP-lösning, varje brunn i en ny 24-brunnsplatta, och inkubera celler i 30 minuter vid 37 grader Celsius med 5%Koldioxid. Sedan pipettera iPSCs i enstaka celler och räkna cellerna med en cellräkningskammare.Välj ca 150 rötade enstaka celler och späd med MES medium i 10 centimeter skålen, kultur vid 37 grader Celsius med 5%Koldioxid. Efter ca 10 dagar, under ett inverterat mikroskop, använd 10 mikroliter sterila pipett tips för att plocka enstaka kolonier och överföra varje koloni i 50 mikroliter av TVP-lösning i en 96-brunnsplatta. Digest vid 37 grader Celsius i 30 minuter.Tillförlitlig manuell kloning plockning är avgörande för framgången med skörd CRISPR/Cas9-redigerade Induced Pluripotent Stamceller. Sedan överföra och dela de smälta cellerna från varje brunn i ytterligare två 96-brunnskulturplattor. Inkubera vid 37 grader Celsius tills 70%konfluent.Med cellkolonierna vid 70%sammanflödet, ta bort mediet i 96-brunnsplattan. Tillsätt 25 mikroliter Lysreagens som innehåller 1%Proteinase K-lösning till varje brunn och överför lysaten till en annan 96-brunns PCR-platta. Täta PCR-plattan med självhäftande tätningar och inkubera plattan i en termisk cycler vid 55 grader Celsius i 30 minuter och sedan vid 95 grader Celsius i 45 minuter för att lysa cellerna och denaturera Proteinas K.Därefter, i ett PCR-rör, tillsätt två mikroliter av lysate, 10 mikroliter av 2 DNAX Polymeras Premix, 7 mikroliters av DNase-fritt vatten , och en mikroliter av DMD Exon23 primers.Starta PCR-reaktionen enligt manuskriptet. Ladda sedan PCR-reaktionen som medföljer 2,2 mikroliter lastningsbuffert på en 2%agarosgel. Kör gelen på 100 till 150 volt i 30 minuter och inspektera gelen i UV-belysning.I detta protokoll utformades två guide RNAs som flankerar mutanten Exon23. Efter Cas9-medierad dubbel-stranded raster och icke-homologa slutet-sammanfogning, mutant Exon23 togs bort, vilket möjliggör trunkerade men funktionella Dystrophin produktion. För att undvika läckage av Trypsin-lösning måste vi applicera fett jämnt på botten av ringarna.Kombinationen av CRISPR/Cas9-genomredigering med ett tacked-on MyoD-aktiveringssystem ger en säker, genomförbar och effektiv strategi för autolog transplantation hos Duchennes muskeldystrofipatienter med basala stamceller från genåtervinning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Effektiv Generering av hiPSC Neural Lineage Specifika Knockin Reportrar Använda crispr / Cas9 och Cas9 Dubbel Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generera crispr / Cas9 medierad monoallel Strykningar att studera Enhancer Funktion i mus embryonala stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Avbildning av muskel-senan morfogenes i Drosophila puppor

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

En in vitro 3D-modell och Computational pipeline för att kvantifiera den Vasculogenic potentialen hos iPSC-härledda endoteliala progenitorer

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...