Name: crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

Tang ve Weintraub kısmen NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan işleme ve cerrahi işlemler Augusta Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokol ile gerçekleştirildi. Fareler standart diyet ve su reklam libitum beslendi.
1. Erişkin Dmdmdx farelerden birincil fare fibroblastlarının izolasyonu
<ol><li>Eutaize yetişkin Dmdmdx fareler (erkek, 2 aylık) CO2 boğulma ve torakotomi Tarafından IACUC Göre Georgia Tıp Koleji tarafından onaylanan, August...

<ol>
	<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li><li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparks,+signals+and+shock+absorbers:+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy.">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li><li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors.">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li><li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies.">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy.">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li><li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li><li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients.">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li><li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li><li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division.">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li><li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx/mTR+mice.">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li><li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244 (2015).</li><li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector.">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li><li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties.">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li></ol>

Duchenne Musküler Distrofi (DMD) yıkıcı ve sonuçta ölümcül kalıtsal bir hastalık distrofin eksikliği ile karakterize, ilerleyici kas atrofisi yol1,2. Sonuçlarımız, CRISPR/Cas9 aracılı ekson23 silme yaklaşımı ile Dmdmdx iPSC kaynaklı miyojenik progenitor hücrelerinde geri yüklenen distrofin gen ekspresyonunu göstermektedir. Bu yaklaşımın üç avantajı vardır.
İlk olarak, entegre olmayan bir RNA ve...

Duchenne musküler distrofi (DMD) en sık görülen kas distrofilerinden biridir ve distrofin yokluğu ile karakterizedir, dünya çapında yaklaşık 5.000 yenidoğan erkek 1 etkileyen1. Distrofin gen fonksiyonunun kaybı ilerleyici miyofiberdejenerasyona yol açan yapısal kas defektleri ile sonuçlanır1,2. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) aracılı gen terapi sistemi, distrofin ekspresyonunu geri getirmek ve mikro-distrofinler (μ-Dys) kullanılarak gen replasmanı gibi kas fonksiyonlarını iyileştirmek için test edilmiştir. Ancak, rAAV yaklaşımı fonksiyonel protein ekspresyonunu sürdürmek için tekrarlanan enjeksiyonlar gerektirir3,4. Bu nedenle DMD'li hastalarda distrofin gen ekspresyonunu etkin ve kalıcı olarak kurtarabilecek bir stratejiye ihtiyacımız var. DMD için bir fare modeli olan Dmdmdx fare, erken sonlandırma kodonu ile sonuçlanan ve C-terminal distroglisan bağlayıcı etki alanından yoksun fonksiyonel olmayan bir kesilmiş proteinle sonuçlanan distrofin geninin ekson 23'ünde bir nokta mutasyonuna sahiptir. Son çalışmalar, küçükve büyük hayvan5,6,7doğru gen düzeltme veya mutant ekson silme ile distrofin gen ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 teknolojisinin kullanımını göstermiştir. Long ve ark.8 homoloji yönelimli onarım (HDR) tabanlı CRISPR/Cas9 genom düzenleme ile Dmdmdx fare germline disttrophin gen mutasyonu düzeltmek için yöntem bildirdi. El Refaey ve ark.9 rAAV'nin distrofik farelerde mutant ekson 23'ü verimli bir şekilde çıkarabileceğini bildirdi. Bu çalışmalarda, gRNA'lar intronlar 20 ve 23'te çift iplikli DNA kırılmalarına neden olacak şekilde tasarlanmıştır ve bu da homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla DNA onarımı sonrası distrofin ekspresyonunu kısmen düzeltmiştir. Daha da heyecan verici, Amoasii veark. 10 son zamanlarda caninmodelleri, gelecekteki klinik uygulamada önemli bir adım distrofin ekspresyonu geri rAAV aracılı CRISPR gen düzenleme etkinliğini ve fizibilite bildirdi.
DMD de kök hücre bozukluklarına neden olur11. Kas hasarı için, konut kas kök hücreleri kas farklılaşması ndan sonra ölmekte olan kas hücrelerini doldurmak. Ancak, yaralanma ve onarım ardışık döngüleri kas kök hücrelerinde telomerlerin kısaltılmasına yol12, ve kök hücre havuzlarının erken tükenmesi13,14. Bu nedenle, distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için genom düzenleme ile otolog kök hücre tedavisinin bir kombinasyonu DMD tedavisinde pratik bir yaklaşım olabilir. CRISPR/Cas9 teknolojisi, fonksiyonel kas rejenerasyonu için genetik olarak düzeltilmiş indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSC) üretme ve immün reddedilmeye neden olmadan DMD'nin daha fazla komplikasyonunu önleme olanağı sağlar. Ancak, iPSC'lerin tümör oluşumu riski vardır, bu da iPSC'nin miyojenik progenitor hücrelere farklılaşması ile hafifletilebilir.
Bu protokolde, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarının iPSC'lere yeniden programlanması ve daha sonra CRISPR/Cas9 genom deletion ile distrofin ekspresyonunun kurtarılması için sendai virüsünün entegre olmayan kullanımını açıklıyoruz. IPSC'de Exon23 deleasyonunun genotipleme ile doğrulanmasından sonra, genom düzeltilmiş iPSC'yi MyoD kaynaklı miyojenik farklılaşma yoluyla miyojenik progenitörlere (MPC) ayırdık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31-gauge needle</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Incision</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Scalpels</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Various&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>87 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TVP solution (for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110-082</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>186 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat-buffered saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15090046</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES growth medium(for 500 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Slution 100x</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>MT30004CI</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>408.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G7513</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK/GS3 Inhibitor Supplement</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210510-500UL</td>
			<td>500 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mES frozen medium(for 50 mL of complete solution)</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D2650</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D6429</td>
			<td>24.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Characterized</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>CS210511</td>
			<td>50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>RRID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J19943-k2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6964</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgeI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3552L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>AB_2633275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32731</td>
			<td>AB_2633280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32732</td>
			<td>AB_2633281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AFP</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>RB-365-A1</td>
			<td>AB_59574</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>19245S</td>
			<td>AB_2734735</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Dystrophin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PA5-32388</td>
			<td>AB_2549858</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LIN28A (D1A1A) XP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>8641S</td>
			<td>AB_10997528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MYH2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>mAb2F7</td>
			<td>AB_1157865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nanog-XP</td>
			<td>CST</td>
			<td>8822S</td>
			<td>AB_11217637</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td>
			<td>CST</td>
			<td>83932S</td>
			<td>AB_2721046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab97959</td>
			<td>AB_2341193</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA1(MC480)&#160;</td>
			<td>CST</td>
			<td>4744s</td>
			<td>AB_1264258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH (H-196)</td>
			<td>SANTA CRUZ&#160;</td>
			<td>sc-14007</td>
			<td>AB_671397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Live Stain (500x)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A14353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI/Esp3I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0580L/R0734L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>205805-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent Cells</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A16517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR Lysis Reagent (cell)</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>302-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (1 U/mL)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP26535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; 
			QIAEX II Gel Extraction Kit (500)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin, type A</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL Injection</td>
			<td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td>
			<td>45822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3142L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-CRISPRv2-blast</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>83480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>99377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&#160;&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4,000</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA161510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TR1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CB354688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max Premix</td>
			<td>TakaRa</td>
			<td>R045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>VIAGEN BIOTECH</td>
			<td>507-PKP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19453980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Lentivirus Titration Kit</td>
			<td>abm</td>
			<td>LV900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzol RT</td>
			<td>Molecular Research Center, INC</td>
			<td>RN 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Modified</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9729-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralBoost Reagent (500x)</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>VB100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 technology in restoring dystrophin expression in ipsc-derived muscle progenitors

Duchenne musküler distrofi (DMD) distrofin genimutasyonları nedeniyle ciddi bir ilerleyici kas hastalığıdır, sonuçta kas atalarının tükenmesine yol açar. Kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar/CRISPR ilişkili 9 (CRISPR/Cas9) gen düzenleme distrofin geninin ekspresyonunu geri getirme potansiyeline sahiptir. Otolog indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs)-türetilmiş kas progenitor hücreleri (MPC) kök / progenitor hücre havuzu doldurmak, onarım hasarı, ve bir bağışıklık yanıtı neden olmadan DMD daha fazla komplikasyonları önlemek. Bu çalışmada, recovered distrofin protein ekspresyonu ile kas ataları elde etmek için CRISPR/Cas9 ve entegre olmayan iPSC teknolojilerinin bir kombinasyonunu sokulduk. Kısaca, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarından bir iPSC hattı oluşturmak için entegre olmayan bir Sendai vektörü kullanıyoruz. Daha sonra, yeniden çerçevelenmiş distrofin geninin homolog olmayan bir uçla distropin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanırız. 94 seçilmiş iPSC kolonisinden üç kolonide exon23 tükenmesinin PCR doğrulanmasından sonra, kas farklılaşmasının düzenlenmesinde önemli rol oynayan önemli bir transkripsiyon faktörü olan MyoD'nin doksisiklin (Dox) indüklenen ekspresyonu ile iPSC'yi MPC'ye ayırırız. Sonuçlarımız, DMD tedavisi için gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir potansiyele sahip olan iPSC kaynaklı MPC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanmanın fizibilitesini göstermektedir.

Dmdmdx deri fibroblastlarının kurulması iPSC türetilmiştir. Dmdmdx farelerden, entegrasyoniçermeyen yeniden programlama vektörlerini kullanarak deri fibroblastından elde edilen fare iPSC'lerinin üretilmesinin verimliliğini gösterdik. Şekil 1A, embriyonik kök hücre (ESC) benzeri kolonilerin enfeksiyondan üç hafta sonra ortaya çıktı. Canlı alkali fosfataz (AP) lekesi ile iPSC indüksiyonunun etkinliğini değerlendiriyoruz; <...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Burada, Dmdmdx fare kaynaklı deri fibroblastlarından iPSC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek ve Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanarak iPSC'leri doğrudan miyojenik progenitor hücrelerine (MPC) ayırmak için Cas9 tabanlı ekson23 silme protokolü salıyoruz.

iPSC Kaynaklı Kas Atalarında Distrofin Ekspresyonunun Geri Kazanilmesinde CRISPR/Cas9 Teknolojisi

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne kas atahücrelerinin erken tükenmesine neden olan bir kas distrofisidir. En şiddetli Kas Distrofilerinden biridir. Fonksiyonel bir kas rejenerasyonu teşvik etmek için, indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı kas progenitor hücrelerinde distrofin ekspresyonu geri CRISPR / Cas9 aracılı gen düzenleme kullanın.CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi distrofin gen ekspresyonunu geri getirme potansiyeline sahiptir. Otolog iPSC türetilmiş kas atası hücreleri kök hücre gözeneklerini yenileyebilir, hasarı onarabilir ve bağışıklık yanıtına neden olmadan DMD'de daha fazla komplikasyonu önleyebilir. Miyojenik Progenitor Hücrelere iPS hücrelerinin farklı ajanları iPS hücrelerinde tümör yeniden ortaya çıkan riskini azalttı.CRISPR-Cas9 aracılı genetik düzeltme ile otolog İndüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı kas progenitor hücreleri birleştiren çeşitli tedaviler Duchenne Musküler Distrofi tedavi stratejileri umut verici. Bu teknoloji genetik otolog kök hücreleri düzenleyerek birçok konjenital hastalıkların tedavisinde kullanılabilir, kalp de dahil olmak üzere, beyin, ve kan hastalığı. Bu yaklaşımın gösterilmesinin okuyuculara hücre yeniden programlama ve gen düzenleme konusunda deneyim kazandırabileceğini gösterdik, ki bu da bir sorun olmaya devam ediyor.Ters bir mikroskop altında, enfekte fare embriyonik kök hücrelerinkolonileri inceleyin. Kendi kendine mürekkepli nesne işaretçisi ile yemeğin altındaki kolonileri işaretleyin. İşaretli hücre kolonilerini kapsayacak şekilde yağlanmış klonlama halkaları uygulayın.Her klonlama halkasına %0,05 Tripsin-EDTA'dan 100 mikrolitre ekleyin ve plakayı 5 dakika boyunca 37 derecede bir kuvöze yerleştirin. Daha sonra, 100 mikrolitrelik pipet uçları ile sindirilmiş hücreleri 250 mililitre MES büyüme ortamı içeren 48 kuyulu kültür plakalarına aktarın. Hücreleri %5 Karbondioksit ve %85 nem oranıyla 37 Santigrat Derece kuvözde kuluçkaya yatırın.%70 birleşimi okuduklarında, iyi yetiştirilen hücrelere sahip kuyuları seçin ve 30 dakika sindirmek için 250 mililitre TVP çözeltisi ekleyin. Daha sonra hücre kültürünü her kuyudan altı santimetrelik bir tabağa aktarın. Üniforma, yurt şeklindeki klonlar elde edilene kadar klonlama halkaları ve kuluçka uygulamalarını birkaç kez tekrarlayın.Şimdi, bir mililitre TVP çözeltisi ekleyerek hazırlanan fare iPSC'lerini sindirin. Hücre kültürünü Fibronektin ve Jelatin ile kaplanmış 24 kuyulu bir tabağa aktarın ve %5 Karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücreler %50 birleştiğinde, mililitre Polibrene başına sekiz mikrogram içeren 500 mikrolitre taze kültür ortamına geçin.Daha sonra fare iPSC'lerine 100 mikrolitre merceksi partikül çözeltisi ekleyin. Hücreleri %5 Karbondioksit le 37 derecede üç gün kuluçkaya yatırın. Sonra, Blasticidin ve Hygromycin B'nin minimum konsantrasyonunun 24 saat içinde yarı ölüm hızında olduğunu belirleyin.Hücrelere mililitre Blasticidin başına 2,5 mikrogram ve mililitre Hygromycin B başına 100 mikrogram medya ekleyin, üç gün bekleyin, ve enfekte hücreleri stabling olarak yapışık kalan hücreleri seçin. Seçilen fare iPSC'lerini 0,5 mililitre TVP çözeltisi ile sindirin, her biri yeni 24 kuyulu bir plakada, ve hücreleri %5 Karbondioksitle 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, pipet tek hücrelere iPSCs ve bir hücre sayma odası ile hücreleri saymak.Yaklaşık 150 sindirilmiş tek hücre seçin ve MES orta ile seyreltmek 10 santimetre çanak, kültür 37 derece santigrat ile% 5 Karbondioksit. Yaklaşık 10 gün sonra, ters bir mikroskop altında, tek koloniler almak ve 96-iyi plaka TVP çözeltisi 50 mikrolitre içine her koloni aktarmak için 10 mikrolitre steril pipet ipuçları kullanın. 37 derecede 30 dakika sindirin.Güvenilir manuel klonlama toplama CRISPR/Cas9-düzenlenmiş İndüklenen Pluripotent Kök Hücreleri hasat başarısı için önemlidir. Daha sonra, aktarılan hücreleri her kuyudan başka bir 96-well kültür plakaları içine bölmek. 37 derecede %70'e kadar kuluçkaya yat.Hücre kolonilerinin %70'inin birleştiği yerde, 96 kuyulu plakadaki ortayı çıkarın. Her kuyuya %1 Proteinaz K çözeltisi içeren 25 mikrolitre Lysis reaktifi ekleyin ve lysate'yi başka bir 96 kuyulu PCR plakasına aktarın. PCR plakasını yapışkan contalarla kapatın ve plakayı 55 santigrat derecede 30 dakika, sonra 95 derecede 45 derecede inkübe ederek hücreleri inceleyin ve Proteinase K.Then'i denatüre edinin. bir PCR tüpünde, iki mikrolitre lysate, 10 mikrolitre 2x DNA Polimeraz Premix, 7 mikrolitre DNase içermeyen su ekleyin , ve DMD Exon23 astar bir mikrolitre.El yazmasına göre PCR reaksiyonuna başlayın. Daha sonra, %2'lik agarose jelüzerine 2,2 mikrolitre yükleme tamponu ile birlikte verilen PCR reaksiyonu yükleyin. Jeli 100 ila 150 voltta 30 dakika çalıştırın ve jeli UV ışığı altında inceleyin.Bu protokolde, mutant Exon23'ü çevreleyen iki kılavuz RNA tasarlanmıştır. Cas9 aracılı çift iplikçikli molalar ve homolog olmayan son birleştirme sonrasında mutant Exon23 silinerek kesilmiş ancak fonksiyonel Distrofin üretimine olanak sağladı. Trypsin çözeltisinin sızmasını önlemek için halkaların altına eşit yağ uygulamamız gerekir.CRISPR/Cas9 genom düzenlemesinin tacked-on MyoD aktivasyon sistemi ile birleşimi, gen kurtarma bazal progenitor hücreleri olan Duchenne Musküler Distrofi hastalarında otolog transplantasyon için güvenli, uygulanabilir ve etkili bir strateji sağlar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...