Name: an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00
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लेखकों को डॉ पीटर Davies शुक्रिया अदा करना चाहूंगा अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में PHF-1 और CP13 एंटीबॉडी और डॉ मार्क डायमंड की आपूर्ति के लिए टेक्सास, साउथैवेस्टर्न विश्वविद्यालय में, ताऊ constructs प्रदान करने के लिए । यह काम अल्जाइमर एसोसिएशन (NIRG-14-322164) से अनुदान के लिए S.H.Y. और कैलिफोर्निया संस्थान से पुनर्योजी चिकित्सा के लिए (TB1-01193) पीआर को समर्थन किया गया था

1. मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी
<ol><li>4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटों के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग पिघलना (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को गर्म करने की अनुमति नहीं है या यह जमना होगा) । 1 मिलील?...

<ol>
	<li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease+in+2015:+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation.">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein.">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li><li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia.">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li><li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo.">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li><li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice.">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model.">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li><li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation.">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li><li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species.">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li><li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells,+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+human+neural+stem+cells.">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).</li><li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects.">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).</li><li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation.">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल मानव तौपविकृति के एक इन विट्रो मॉडल की उत्पत्ति का वर्णन करता है जो सिल्वर-दाग-धनात्मक समुच्चय और थायोफ्लेविन-पॉजिटिव न्यूरोफाइनेन्शिलरी कोणों (एनएफएफटी) को दर्शाती है । इसके अलावा, transduced ...

माइक्रोटयूब से संबंधित प्रोटीन ताउ का रोगात्मक समुच्चय अनेक न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का एक निर्धारक लक्षण है, जिनमें एडी, फ्रन्टोटेम्पोरल मनोभ्रंश (एफटीडी), पिक की बीमारी, और प्रगतिशील सुप्रानाभिकीय अंगघात (पीएसपी)1शामिल हैं । एक रोगग्रस्त अवस्था में ताऊ, न्यूरोनल एक्सऑन्स2में माइक्रोट्यूब्यूल तंतु को बाँधता है और स्थिर करता है । तथापि, ताऊ का रोग-संबद्ध हाइपरफॉस्फोरीलेशन ताऊ एकत्रीकरण, माइक्रोट्यूब्यूल्स से वियोजन और न्यूरोनल विषाक्तता3को बढ़ावा देता है । एकत्रित ताऊ के विषाक्त प्रभाव कोलीनर्जिक4 और ग्लूटामैटेजिक रिसेप्टर्स के ंयायपालिका सक्रियण शामिल हो सकते हैं5 intracellular कैल्शियम के डिस्रेग्युलेशन में जिसके परिणामस्वरूप और, अंत में, कोशिका मृत्यु. पशु मॉडल में, मस्तिष्क ताऊ की कमी विज्ञापन चूहों6 और दोहराव हल्के अभिघातजंय मस्तिष्क चोट7के माउस मॉडल में विकृति में सुधार ।
बढ़ते सबूत दर्शाता है कि संरचना और माउस की बाध्यकारी संबध-ताऊ व्युत्पंन मानव ताऊ से व्युत्पंन और है कि माउस ताऊ मानव tauopathies8मॉडलिंग के लिए अनुपयुक्त है । हालांकि, मानव कोशिका तौलविकृति मॉडल व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । इस काम का समग्र लक्ष्य ताऊ एकत्रीकरण के इन विट्रो मॉडल का वर्णन करना है जिसमें मानव न्यूरॉन्स को मटैन्ट मानव ताऊ से युक्त लैंटवायरल व्युत्पन्न वैक्टर के साथ ट्रांसड्यूडेड किया जाता है । ताउ के कारण एक प्रकार का फल, ताउ दोहराने डोमेन के लिए encodes P301L और V337M म्यूटेशन एक yfp रिपोर्टर (ताऊ-rdlm-yfp) जबकि नियंत्रण के लिए कोड constructs जंगली तरह (wt) ताऊ दोहराने डोमेन के लिए एक yfp रिपोर्टर (ताऊ-wt-yfp) संगलित । Neuronal संस्कृतियों इस विधि का उपयोग कर transduced लगभग नौ बार और nontransduced संस्कृतियों से अधिक ताऊ व्यक्त करते हैं । हालांकि ताऊ अभिव्यक्ति की राशि है, ताऊ-RDLM-YFP-और ताऊ-Wt-YFP-transduced कोशिकाओं के बीच मोटे तौर पर बराबर है, केवल ंयूरॉंस ताऊ-RDLM-YFP प्रदर्शन समुच्चय के साथ transduced । ताउ के साथ transduced-RDLM-YFP थायोफ्लेविन के लिए सकारात्मक दाग और axonal लंबाई और synaptic घनत्व में कटौती प्रदर्शन । इसलिए, यह सेलुलर मॉडल ताऊ एकत्रीकरण इन विट्रो का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm culture dishes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plates</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol in spray bottle</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>HRP-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 culture media with glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (50% concentration or higher)</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescently labeled secondary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>1254581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neural stem cells</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vectors</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking or rotating platform</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hood</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1892-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons

प्रोटीन का aberrant एकत्रीकरण ताऊ pathogenically अल्जाइमर रोग (एडी) सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की एक संख्या में शामिल है । हालांकि tauopathy के माउस मॉडल एकत्रित ताऊ के तंत्रिआविषी तंत्र की जांच के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान की है, यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि, neuroफिजियोलॉजी में interspecies मतभेदों के कारण, माउस मस्तिष्क के लिए अनुपयुक्त है मानव शर्त मॉडलिंग । कोशिका संस्कृति के तरीकों में अग्रिम मानव न्यूरोनल संस्कृतियों में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए सुलभ बना दिया है विट्रो और neurotherapeutics के विकास में सहायता प्राप्त है. हालांकि, मानव न्यूरोनल कोशिका संस्कृतियों के अनुकूलन के बावजूद, मानव tauopathy के इन विट्रो मॉडल अभी तक व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं । इस प्रोटोकॉल ताऊ एकत्रीकरण के एक सेलुलर मॉडल का वर्णन करता है जिसमें मानव ंयूरॉंस के साथ transduced कर रहे है के साथ एक एक पीला फ्लोरिसेंट प्रोटीन (yfp) के लिए रोगजनक उत्परिवर्तित ताऊ के लिए कोड । Transduced संस्कृतियों ताऊ समुच्चय का उत्पादन है कि thioflavin और neurotoxicity के प्रदर्शन मार्कर के लिए सकारात्मक दाग, जैसे अक्षीय लंबाई और वृद्धि हुई लाइसोसोमल मात्रा के रूप में । यह प्रक्रिया मानव tauopathies के अध्ययन के लिए एक उपयोगी और लागत प्रभावी मॉडल हो सकता है ।

ताऊ-RDLM-YFP-transduced ंयूरॉंस थे fluorescently YFP के साथ टैग, और RDLM-transduced संस्कृतियों transक्रमण के बाद समुच्चय प्रदर्शित । इन inclusions थायोफ्लेविन के लिए सकारात्मक सना हुआ (चित्रा 1) । के रूप में चित्रा 1 दर्शात?...

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An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

मानव ंयूरॉंस के लेंटवायरल-मध्यस्थता ट्रांक्शन का उपयोग कर ताऊ एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल

इस प्रोटोकॉल का विवरण एक प्रक्रिया है जिसमें मानव न्यूरोनल संस्कृतियों उत्परिवर्ती मानव ताऊ के लिए कोडिंग के साथ लेंट्रोवायरल constructs के साथ transduced हैं । Transduced संस्कृतियों ताऊ समुच्चय और संबंधित विकृतियों प्रदर्शित करते हैं ।

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

इस प्रोटोकॉल में हम मानव तौओपैथी के एक इन विट्रो मॉडल का विस्तार करते हैं। यह विधि एक सामग्री की जरूरत है जो दवा स्क्रीनिंग और रोग तंत्र अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है भरता है । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि सेल संस्कृति प्रतिमान पशु अध्ययन की तुलना में ताऊ विषाक्तता और संभावित ताऊ चिकित्सा के अधिक तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटों के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग गल ।एक मिलीलीटर एलिकोट बनाएं और उन्हें शून्य से 20 या शून्य से 70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसके बाद, बाँझ पीबीएस में बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक को 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर पुनर्गठित करें। 10 माइक्रोलिटर एलिकोट्स बनाएं और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।फिर ग्लूटामीन के साथ DMEM-F12 की एक नई बिना खोले ५००-मिलीलीटर की बोतल निर्धारित करें । तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया तैयार करने के लिए B27 के 10 मिलीलीटर, N2 के पांच मिलीलीटर, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के पांच मिलीलीटर जोड़ें। एनएससी मीडिया के 50 मिलीलीटर को शंकु नली में रखें, और तैयार बीएमजीएफ के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।इस एनएससी प्लस टीएफजीएफ मीडिया को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सबसे पहले, फ्रीजर से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए जमे हुए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग का एक aliquot हटा दें और यह चार डिग्री सेल्सियस पर गल करने के लिए अनुमति देते हैं । गल बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग के 385 माइक्रोलीटर को डीएमईएम-एफ 12 मीडिया के पांच मिलीलीटर में जोड़ें जिसमें पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है।यदि कोशिकाओं को जमे हुए एनएससी स्टॉक से गल जा रहा है, तो फ्रीजर से जमे हुए कोशिकाओं की एक शीशी लें और इसे पानी में आगे और पीछे करके ३७ डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में गर्म करें । इसके बाद, 70% इथेनॉल के साथ शीशी का छिड़काव करें। फिर एक सेल कल्चर हुड के तहत, कोशिकाओं को पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम-एफ12 मीडिया के लगभग 10 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें।पांच मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर कमरे के तापमान पर सेंट्रलाइज। फिर मीडिया को आकांक्षी करें और एनएससी मीडिया में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें । उपयोग किए जा रहे कोशिका संस्कृति पोत के लिए उपयुक्त सीडिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए एनएससी मीडिया में कोशिकाओं को पतला करें।तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित संस्कृति व्यंजन बीज के लिए एनएससी मीडिया में निलंबित पर्याप्त कोशिकाओं को जोड़ें । 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ने जब तक वे ७५ से ८०% ढुलमुल हैं, हर दूसरे दिन मीडिया को बदलने के लिए सुनिश्चित कर रही है । लेंटीवायरस के साथ न्यूरॉन्स को ट्रांसड्यूस करने के लिए, प्रति सेल 340, 000 ट्रांसड्यूसबल यूनिट्स की टाइटर काउंट का उपयोग करें।सेल कल्चर मीडिया में ट्रांसड्यूबल इकाइयों को आवश्यक एकाग्रता में पतला करें, और उन्हें कोशिकाओं में जोड़ें। लेंटीवायरस जोड़ने के दो दिन बाद, कोशिकाओं को ताजा मीडिया के साथ एक बार धोएं जिसमें टीएफजीएफ शामिल नहीं है। टीएफजीएफ के बिना मीडिया में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को खेती जारी रखें।स्थानांतरण के बाद लगभग आठ सप्ताह तक कोशिकाओं को बनाए रखें, जिससे हर दूसरे दिन सेल कल्चर मीडिया को बदलना सुनिश्चित हो। कोशिकाओं की नियमित कल्पना करने और व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। ट्रांसडक्शन के बाद, संस्कृति व्यंजनों को इनक्यूबेटर से हटा दें ताकि संस्कृति को अच्छी तरह से बाँझ रखने के लिए उन पर ढक्कन रखना सुनिश्चित किया जा सके।514 नैनोमीटर की उमंग और 527 नैनोमीटर के उत्सर्जन फिल्टर के साथ 10X उद्देश्य के तहत कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग में सक्षम फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इस अध्ययन में ताऊ-आरडीएलएम-वाईएफपी लेंटीवायरस के साथ ट्रांसड्यूड किए गए न्यूरॉन्स को वाईएफपी के साथ फ्लोरोसेंट रूप से टैग किया गया है। आरडीएलएम-ट्रांसड्यूडेड संस्कृतियों को ट्रांसडक्शन के बाद समुच्चय प्रदर्शित करते हुए देखा जाता है।ये समावेश थिओफ्लेविन के लिए सकारात्मक दाग । संस्कृतियों में न्यूरॉन-विशिष्ट मार्कर बीटा-ट्यूबलिन III के इम्यूनोलबेलिंग द्वारा न्यूरोनल भेदभाव की पुष्टि की जाती है। यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंटी टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी में एक उत्तेजन उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होना चाहिए जो वाईएफपी के साथ ओवरलैप नहीं करता है।हालांकि पीले फ्लोरेसेंस ताऊ समुच्चय धुंधला के अभाव में दिखाई देगा, थिओफ्लाविन का उपयोग इमेजिंग के लिए भी किया जाना चाहिए ताकि यह पुष्टि की जा सके कि फ्लोरोसेंट सिग्नल को एकत्रित ताऊ और सेलुलर मलबे नहीं है। ताऊ ओवरएक्सप्रेसिंग कोशिकाओं की पीढ़ी के बाद, न्यूरोनल स्वास्थ्य और ताऊ एकत्रीकरण के कई आकलन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि ये कोशिकाएं अक्षीय अध: पतन प्रदर्शित करती हैं।सेल कल्चर स्टडीज के अलावा हमने इस विधि का इस्तेमाल रोगजनकता एक्सोडोसोमल-व्युत्पन्न ताऊ की जांच के लिए किया है ।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

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Utero में electroporation cortical न्यूरॉन्स के सबसेट में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक Neuronal संस्कृति द्वारा पीछा

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Studying the Integration of Adult-born Neurons

वयस्क - जन्म न्यूरॉन्स की एकता का अध्ययन

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

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Lentivirus की मध्यस्थता जेनेटिक और घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन Vivo में</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

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जीर्ण के लिए वयस्क जन्म घ्राण न्यूरॉन्स के चयनात्मक वायरल transduction Vivo में Optogenetic उत्तेजना

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

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एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Globoid सेल Leukodystrophy में सेलुलर pathophysiology के अध्ययन के लिए मॉडल

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

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एक<em&gt; इन विट्रो</emस्नायु afferents की गोलीबारी गुणों के लिए अध्ययन&gt; वयस्क माउस स्नायु तंत्रिका तैयारी

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

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रूट ganglia न्यूरॉन्स और विभेदित वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल पृष्ठीय: एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सह संस्कृति मॉडल परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

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इन विट्रो में ताऊ के एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए परख प्रोटीन और ड्रग स्क्रीनिंग

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

मैग्नेटोएंसेफेग्राफी का उपयोग कर बच्चों में मस्तिष्क समारोह का अध्ययन

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...