Name: an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00
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Gli autori vorrebbero ringraziare il dottor Peter Davies all'Albert Einstein College of medicine per aver fornito gli anticorpi PHF-1 e CP13 e il dottor Marc Diamond all'Università del Texas, nel sud-ovest, per aver fornito i costrutti Tau. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Alzheimer ' s Association (NIRG-14-322164) a S.H.Y. e dall'Istituto della California per la medicina rigenerativa (TB1-01193) a R.P.

1. preparazione di supporti e reagenti
<ol><li>Scongelare il rivestimento della matrice della membrana del seminterrato per le piastre di coltura a 4 ° c (non permettere che la matrice della membrana del seminterrato si riscaldi o si solidifichi). Fare 1 mL di aliquote e conservarle a-20 ° c o-70 ° c.</li>
	<li>Ricostituire il fattore di crescita fibroblasti di base (bFGF) in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) a 10 μg/mL e fare 10 μL di aliquote. Conservarli a 4 ° c.</li>
	<li>Ad un nuovo flacon...

<ol>
	<li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease+in+2015:+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation.">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein.">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li><li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia.">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li><li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo.">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li><li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice.">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model.">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li><li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation.">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li><li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species.">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li><li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells,+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+human+neural+stem+cells.">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).</li><li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects.">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).</li><li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation.">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li></ol>

Questo protocollo descrive la generazione di un modello in vitro di tauopatia umana che esibisce gli aggregati di argento-macchia-positivi e i grovigli di neurofibrillari positivi alla Tioflavina (NFTs). Inoltre, le cellule trasdotte mostrano patologie indotta da Tau come difetti morfologici, ridotta sinaptogenesi e un aumento del volume lisosomiale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce un modello accessibile e conveniente di tauopatia neuronale, che può essere utilizzato per gli studi di screeni...

L'aggregazione patologica della proteina Tau associata al microtubulo è una caratteristica determinante di molte malattie neurodegenerative, tra cui AD, demenza frontotemporale (FTD), malattia di pick e paralisi sopranucleare progressiva (PSP)1. In uno stato non malato, Tau si lega e stabilizza i filamenti di microtubuli in assoni neuronali2. Tuttavia, l'iperfosforilazione di Tau associata alla malattia favorisce l'aggregazione Tau, la dissociazione dai microtubuli e la tossicità neuronale3. Gli effetti tossici del Tau aggregato possono comportare l'attivazione aberrante dei recettori colinergici4 e glutamatergic5 con conseguente disregolazione del calcio intracellulare e, infine, morte cellulare. Nei modelli animali, la riduzione del cervello Tau migliora la patologia nei topi AD6 e nei modelli murini di trauma cranico lieve ripetitivo7.
Le prove di montaggio dimostrano che la struttura e l'affinità di legame del Tau derivato dal topo sono distinte dal Tau derivato dall'uomo e che il Tau del topo non è adatto per modellare le tauopatie umane8. Tuttavia, i modelli di tauopatia cellulare umana non sono ampiamente disponibili in commercio. L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di descrivere un modello in vitro di aggregazione Tau in cui i neuroni umani sono trasverti con vettori lentivirali-derivati contenenti costrutti Tau umani mutanti9. L'aggregazione Tau che causa costrutti lentivirali codifica per il dominio di ripetizione Tau che harnoioso P301L e V337M mutazioni fuse con un reporter YFP (Tau-RDLM-YFP) mentre il controllo costruisce il codice per il dominio di ripetizione Tau (WT) di tipo selvaggio fuso con un reporter YFP (Tau-WT-YFP). Le colture neuronali trasite usando questo metodo esprimono circa nove volte più Tau rispetto alle colture non trasdette. Anche se la quantità di espressione Tau iperespressa è approssimativamente uguale tra le cellule di Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-trasate, solo i neuroni trasati con Tau-RDLM-YFP mostrano aggregati. Le colture con Tau-RDLM-YFP si macchiavano positivamente per la Tioflavina e mostrano riduzioni della lunghezza assonale e della densità sinaptica. Pertanto, questo modello cellulare può essere uno strumento utile per studiare l'aggregazione Tau in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm culture dishes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plates</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol in spray bottle</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>HRP-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 culture media with glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (50% concentration or higher)</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescently labeled secondary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>1254581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neural stem cells</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vectors</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking or rotating platform</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hood</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1892-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons

L'aggregazione aberrante della proteina tau è coinvolta patogenicamente in una serie di malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD). Anche se i modelli murini di tauopatia hanno fornito una preziosa risorsa per indagare sui meccanismi neurotossici del Tau aggregato, sta diventando sempre più evidente che, a causa delle differenze tra le specie nella neurofisiologia, il cervello del topo non è adatto per modellare la condizione umana. I progressi nei metodi di coltura cellulare hanno reso le colture neuronali umane accessibili per uso sperimentale in vitro e hanno aiutato nello sviluppo di neuroterapeutici. Tuttavia, nonostante l'adattamento delle colture cellulari neuronali umane, i modelli in vitro di tauopatia umana non sono ancora ampiamente disponibili. Questo protocollo descrive un modello cellulare di aggregazione Tau in cui i neuroni umani vengono trasborsi con vettori lentivirali-derivati che il codice per Tau mutata patogenicamente fusa a una proteina gialla fluorescente (YFP) reporter. Le colture trasmarcate producono aggregati Tau che si macchiano positivamente per la Tioflavina e mostrano marcatori di neurotossicità, come la diminuzione della lunghezza assonale e l'aumento del volume lisosomiale. Questa procedura può essere un modello utile e conveniente per studiare le tauopatie umane.

I neuroni trasmarcati Tau-RDLM-YFP sono stati contrassegnati in modo fluorescente con YFP, e le colture con RDLM-trasduzione hanno mostrato aggregati dopo la trasazione. Queste inclusioni macchiate positive per Tioflavina (Figura 1). Come illustrato nella figura 1 , questo protocollo produce colture neuronali che visualizzano aggregati Tau positivi alla Tioflavina. Per gli esperimenti iniziali, si raccomanda che la differenziazione neuronale sia confermata da im...

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An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Un modello in vitro per lo studio dell'aggregazione Tau utilizzando la trasduzione dei neuroni umani mediata da lentivirali

Questo protocollo descrive una procedura in cui le colture neuronali umane vengono trasmutate con costrutti lentivirali che codificano per i Tau umani. Le colture traslegate mostrano aggregati Tau e patologie associate.

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

In questo protocollo dettagliamo un modello in vitro di tauopatia umana. Questo metodo riempie un'esigenza di materiali che può essere utile per lo screening dei farmaci e gli studi sul meccanismo delle malattie. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il paradigma della coltura cellulare consente una valutazione più rapida della tossicità tau e delle potenziali terapie tau rispetto agli studi sugli animali Per iniziare questa procedura scongelare il rivestimento a matrice di membrana basale per piastre di coltura a quattro gradi Celsius.Crea aliquote di un millilitro e conservale a meno 20 o meno 70 gradi Celsius. Successivamente, ricostituire il fattore di crescita dei fibroblasti di base in PBS sterile a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Creare aliquote a 10 microliter e conservarle a quattro gradi Celsius.Quindi impostare una nuova bottiglia non aperta da 500 millilitri di DMEM-F12 con glutammina. Aggiungere 10 millilitri di B27, cinque millilitri di N2 e cinque millilitri di penicillina-streptomicina per preparare i mezzi delle cellule staminali neurali. Posizionare 50 millilitri del supporto NSC in un tubo conico e aggiungere 10 microlitri del bFGF preparato.Archiviare questo supporto NSC più bFGF a quattro gradi Celsius. In primo luogo, rimuovere un'aliquota di rivestimento a matrice di membrana basale congelata per piastre di coltura cellulare dal congelatore e consente di scongelare a quattro gradi Celsius. Aggiungere 385 microlitri del rivestimento a matrice di membrana basale scongelato a cinque millilitri di supporti DMEM-F12 contenenti penicillina-streptomicina.Se le cellule vengono scongelate dalle scorte di NSC congelate, prendere una fiala di cellule congelate dal congelatore e scaldarla in un bagno d'acqua riscaldato a 37 gradi Celsius spostando il flaconcino avanti e indietro nell'acqua. Successivamente, spruzzare la fiala con il 70% di etanolo. Quindi sotto una cappa di coltura cellulare, trasferire le cellule a circa 10 millilitri di supporti DMEM-F12 contenenti penicillina-streptomicina.Centrifuga a temperatura ambiente a 1.000 volte g per cinque minuti. Quindi aspirare il supporto e rimescolare le celle nei supporti NSC. Diluire le cellule nei supporti NSC per ottenere la densità di semina appropriata per il contenitore di coltura cellulare utilizzato.Aggiungere abbastanza cellule sospese nei supporti NSC per seminare le stoviglie di coltura rivestite con matrice di membrana basale. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% fino a quando non sono confluenti dal 75 all'80%, assicurandosi di cambiare il supporto a giorni diversi. Per trasdurre i neuroni con il lentivirus, utilizzare un conteggio del tazzo di 340.000 unità trasducibili per cellula.Diluire le unità trasducibili nei mezzi di coltura cellulare alla concentrazione necessaria e aggiungerle alle cellule. Due giorni dopo aver aggiunto il lentivirus, lavare le cellule una volta con mezzi freschi che non contengono bFGF. Continuare a coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% nei media senza bFGF.Mantenere le cellule per circa otto settimane dopo la trasduzione, assicurandosi di cambiare il supporto di coltura cellulare a giorni diversi. Utilizzare un microscopio a luce per visualizzare regolarmente le cellule e garantire la vitalità. Dopo la trasduzione, rimuovere i piatti di coltura dall'incubatore assicurandosi di tenere il coperchio su di essi per mantenere la coltura ben sterile.Utilizzare un microscopio fluorescente in grado di immagini di cellule vive per visualizzare le cellule sotto un obiettivo 10X con un'eccitazione di 514 nanometri e un filtro di emissione di 527 nanometri. In questo studio i neuroni trasdotti con tau-RDLM-YFP lentivirus sono contrassegnati fluorescentmente con YFP. Le colture trasdotto da RDLM mostrano aggregati dopo la trasduzione.Queste inclusioni sono positive per il tioflavino. La differenziazione neuronale è confermata dall'immunoetichettatura del marcatore specifico del neurone beta-tubulina III nelle colture. È importante ricordare che gli anticorpi secondari contrassegnati fluorescentmente dovrebbero avere uno spettro di emissione di eccitazione che non si sovrapponga a quello dell'YFP.Sebbene gli aggregati tau a fluorescenza gialla siano visibili in assenza di colorazione, la tioflavina dovrebbe essere utilizzata anche per l'imaging al fine di confermare che il segnale fluorescente è aggregato tau e non detriti cellulari. Dopo la generazione di cellule tau sovraesprimi, è possibile eseguire una serie di valutazioni della salute neuronale e dell'aggregazione tau. Ad esempio, abbiamo scoperto che queste cellule mostrano degenerazione assonale.Oltre agli studi di coltura cellulare, abbiamo usato questo metodo per esaminare il tau di origine esosomica patogenicità.

Research

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