Name: an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00
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著者たちは、タウコンストラクトを提供するために、テキサス大学南西部で PHF と CP13 抗体とマルク・ダイヤモンドを供給するために、アルバート・アインシュタイン医科大学のピーター・デイビス博士に感謝したいと思います。この研究は、アルツハイマー病協会 (NIRG-14-322164) から S.H.Y. とカリフォルニア再生医療研究所 (TB1-01193) からの助成金によって支持されました P.R.

1. 培地および試薬の調製
<ol><li>4° c で培養プレート用の基底膜マトリックスコーティングを解凍します (基底膜マトリックスがウォームアップすることを許可しないか、固化します)。1 mL アリコートを作り、-20 ° c または-70 ° c で保存します。</li>
	<li>塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF) を滅菌リン緩衝生理食塩水 (PBS) に10μ g/mL で再構成し、10μ l のアリコートを作ります。4° c で保管してく?...

<ol>
	<li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease+in+2015:+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation.">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein.">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li><li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia.">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li><li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo.">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li><li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice.">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model.">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li><li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation.">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li><li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species.">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li><li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells,+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+human+neural+stem+cells.">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).</li><li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects.">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).</li><li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation.">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li></ol>

このプロトコルは、銀染色陽性凝集体およびチオフラビン陽性脱落もつれ (NFTs) を呈するヒトタウオパチーの in vitro モデルの生成を記述する。さらに、形質導入細胞は、形態学的欠陥、減少したシナプス形成、および増加したリソソーム容積のようなタウ誘発病理を表示する。このプロトコルの主な利点は、薬物スクリーニング研究のためだけでなく、タウ毒性の分析のために使用すること?...

微小管関連タンパクタウの病理学的凝集は、AD、前頭認知症 (FTD)、ピック病、および進行性の神経性麻痺 (PSP)1を含む多くの変性疾患の決定的な特徴である。Nondiseased 状態では、タウは神経軸索2に結合して微小管フィラメントを安定化させる。しかし、タウの疾患関連 hyperphosphorylation は、タウの凝集を促進します, 微小管からの解離, ニューロン毒性3.凝集したタウの毒性作用は、コリン作動性4および glutamatergic 受容体5の異常な活性化を伴うことがあり、細胞内カルシウムの調節不全をもたらし、最終的に、細胞死をもたらす。動物モデルにおいて、脳タウの減少は、AD マウス6における病理を改善し、反復性の軽度トラウマ的脳損傷7のマウスモデルである。
取り付け証拠は、マウス由来タウの構造および結合親和性がヒト由来タウとは異なること、およびマウスタウがヒトタウオパチー8のモデル化に適さないことを実証する。しかしながら、ヒト細胞タウオパチーモデルは、広く市販されていない。本研究の全体的な目的は、ヒトニューロンが変異型ヒトタウ構築物9を含むレンチウイルス由来ベクターで形質導入されるタウ凝集の in vitro モデルを記述することである。YFP レポーターに融合した P301L および V337M 突然変異を保有するタウ繰り返しドメインについてのタウレンチコンストラクトを生じさせるτ凝集体 (τ-RDLM-YFP) に対して、制御構築物は野生型 (Wt) タウのコードを YFP レポーター (タウ− Wt − YFP) に融合させた。この方法を用いて形質導入したニューロン培養は、nontransduced 培養よりも約9倍多くのタウを発現する。タウの発現量は、タウ-RDLM-YFP-YFP 形質細胞との間でほぼ等しいですが、タウ-RDLM-YFP ディスプレイで形質導入されたニューロンのみが凝集します。RDLM-YFP 染色によって形質導入された培養物は、チオフラビンのためにポジティブに、軸索長さおよびシナプス密度の減少を表示する。したがって、この細胞モデルは、インビトロでタウ凝集を研究するための有用なツールとなり得る。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm culture dishes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plates</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol in spray bottle</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>HRP-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 culture media with glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (50% concentration or higher)</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescently labeled secondary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>1254581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neural stem cells</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vectors</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking or rotating platform</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hood</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1892-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons

タンパク質タウの異常な凝集は、アルツハイマー病 (AD) を含む多数の神経変性疾患に関与する pathogenically である。タウオパチーのマウスモデルは、凝集したタウの神経毒性メカニズムを調査するための貴重な資源を提供しているが、種族間の生理学的差異のために、マウス脳は人間の状態をモデリングします。細胞培養法の進歩は、インビトロでヒトニューロン培養を実験用にアクセス可能にし、neurotherapeutics の開発を支援した。しかしながら、ヒト神経細胞培養物の適応にもかかわらず、ヒトタウオパチーのインビトロモデルは未だ広く利用可能ではない。この議定書は、ヒトニューロンを pathogenically 変異体が黄色蛍光タンパク質 (YFP) レポーターに融合させるコードであるレンチウイルス由来のベクターで形質導入したタウ凝集体の細胞モデルを記述している。形質導入された培養物は、チオフラビンに対してポジティブに染色し、軸索長さの減少およびリソソーム体積の増加などの神経毒性のマーカーを表示するタウ凝集体を生成する。この手順は、人間のタウオパチーを研究するための有用で費用対効果の高いモデルかもしれません。

タウ-RDLM-YFP に形質導入されたニューロンを YFP で蛍光タグ付けし、RDLM 形質導入培養後に凝集体を表示した。これらの介在物はチオフラビンに対して陽性に染まった (図 1)。図 1に示すように、このプロトコルはチオフラビン陽性タウ凝集体を表示するニューロン培養を生成する。初期実験では、ニューロン特異的マーカーβ-チューブリン III を培?...

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An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル

このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

このプロトコルでは、ヒトタウオパチーのインビトロモデルを詳述する。この方法は、薬物スクリーニングおよび疾患メカニズム研究に有用であり得る材料の必要性を満たす。この技術の主な利点は、細胞培養パラダイムが動物研究と比較してタウ毒性および潜在的タウ治療薬のより迅速な評価を可能にすることであるこの手順を開始するには、培養プレートの基基膜マトリックスコーティングを摂氏4度で解凍する。1ミリリットルのアリコートを作り、マイナス20度またはマイナス70度で保存します。次に、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で滅菌PBS中の塩基性線維芽細胞増殖因子を再構成する。10マイクロリットルのアリコートを作り、摂氏4度で保管してください。その後、グルタミンとDMEM-F12の新しい未開封の500ミリリットルのボトルを設定します。B27の10ミリリットル、N2の5ミリリットル、および5ミリリットルのペニシリンストレプトマイシンを加えて、神経幹細胞培地を調製する。50ミリリットルのNSC培地を円錐チューブに入れ、調製したbFGFの10マイクロリットルを加えます。このNSCプラスbFGFメディアを摂氏4度で保管してください。まず、冷凍庫から細胞培養プレート用の凍結基質膜マトリックスコーティングのアリコートを取り除き、摂氏4度で解凍できるようにします。ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の5ミリリットルに解凍された基質膜マトリックスコーティングの385マイクロリットルを追加します。細胞が凍結したNSCストックから解凍されている場合は、冷凍庫から冷凍細胞のバイアルを取り出し、バイアルを水中で前後に動かして摂氏37度に加熱した水浴で温めます。この後、バイアルに70%エタノールを吹き付けます。次いで細胞培養フードの下で、ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の約10ミリリットルに細胞を移す。室温で5分間1,000倍gの遠心分離機。その後、メディアを吸引し、NSCメディアの細胞を再中断します。NSC培地で細胞を希釈して、使用されている細胞培養容器に適した播種密度を得る。NSC培地に懸濁された十分な細胞を加えて、基質膜マトリックスコーティングされた培養皿を播種する。彼らは75〜80%コンフルエントになるまで5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞を成長させ、一日おきにメディアを変更してください。レンチウイルスでニューロンをトランスデュースするには、細胞あたり340,000のトランスデューティユニットのタンターカウントを使用してください。細胞培養培地中の導入単位を必要な濃度まで希釈し、細胞に加えます。レンチウイルスを添加した2日後、bFGFを含まない新鮮な培地で細胞を1回洗浄する。bFGFを使用しない培地で5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を培養し続けます。細胞を転移後約8週間維持し、細胞培養培地を1日おきに変更するようにしてください。細胞を日常的に可視化し、生存率を確保するために、軽い顕微鏡を使用してください。トランスダクション後、培養物をよく無菌に保つために蓋を保つように培養器から培養皿を取り除きます。514ナノメートルの励起と527ナノメートルの放出フィルターで10Xの目的の下で細胞を視覚化するために生細胞のイメージ投射が可能な蛍光顕微鏡を使用しなさい。本研究では、タウ-RDLM-YFPレンチウイルスを導入したニューロンがYFPで蛍光的にタグ付けされている。RDLM導入培養物は、伝達後の凝集体を表示することが分かる。これらのインクルージョンはチオフラビンに陽性染色する。神経細胞分化は、培養中のニューロン特異的マーカーβ-チューブリンIIIの免疫標識によって確認される。蛍光タグ付き二次抗体は、YFPと重ならない励起発光スペクトルを持つ必要があることを覚えておくことが重要です。黄色の蛍光タウ凝集体は染色がない場合には見えますが、蛍光シグナルが細胞の破片ではなく凝集タウであることを確認するために、イメージングにも使用する必要があります。タウ過剰発現細胞の生成後、多くの神経細胞の健康およびタウ凝集の評価が行われる。例えば、これらの細胞は軸索変性を示すことがわかりました。細胞培養研究に加えて、この方法を用い、病原性外生タウを調べた。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

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子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Studying the Integration of Adult-born Neurons

アダルト生まれのニューロンの統合を検討し

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

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嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

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慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

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アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

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