Name: an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Davies no Albert Einstein College of Medicine por fornecer anticorpos PHF-1 e CP13 e Dr. Marc Diamond na Universidade do Texas, no sudoeste, por fornecer os constructos Tau. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associação de Alzheimer (NIRG-14-322164) para S.H.Y. e do Instituto de medicina regenerativa da Califórnia (TB1-01193) para P.R.

1. preparação de meios de comunicação e reagentes
<ol><li>Descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas da cultura em 4 ° c (não permita que a matriz da membrana do porão aqueça acima ou solidify). Fazer alíquotas de 1 mL e armazená-las a-20 ° c ou-70 ° c.</li>
	<li>Reconstituir o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) a 10 μg/mL e fazer 10 μL de alíquotas. Guarde-os a 4 ° c.</li>
	<li>Para um novo, não aberto, 50...

<ol>
	<li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease+in+2015:+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation.">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein.">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li><li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia.">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li><li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo.">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li><li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice.">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model.">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li><li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation.">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li><li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species.">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li><li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells,+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+human+neural+stem+cells.">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).</li><li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects.">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).</li><li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation.">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li></ol>

Este protocolo descreve a geração de um modelo in vitro de Taupatia humano que exiba agregados prata-mancha-positivos e emaranhados neurofibrilary thioflavin-positivos (NFTS). Além disso, as pilhas transfuídas exibem patologias Tau-induzidas tais como defeitos morfológicos, synaptogenesis reduzido, e um volume lysosomal aumentado. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece um modelo acessível e rentável de tauopatia neuronal, que pode ser usado para estudos de triagem de drogas, bem como para a análi...

A agregação patológica da proteína Tau microtubule-associada é uma característica definidora de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a AD, a demência frontotemporal (FTD), a doença de pick, e a paralisia supranuclear progressiva (PSP)1. Em um estado não-doente, a Tau liga-se e estabiliza os filamentos de microtúse em axônios neuronais2. No entanto, a hiperfosforilação associada à doença da Tau promove a agregação de Tau, a dissociação dos microtúbulos e a toxicidade neuronal3. Os efeitos tóxicos da Tau agregada podem envolver a ativação aberrante de4 e receptores glutamatérgicos colinérgicos5 resultando na desregulação do cálcio intracelular e, eventualmente, morte celular. Em modelos animais, a redução da Tau cerebral melhora a patologia em camundongos AD6 e em modelos de mouse de lesão cerebral traumática leve repetitiva7.
A evidência da montagem demonstra que a estrutura e a afinidade obrigatória da Tau rato-derivada são distintas da Tau Human-derivada e que o Tau do rato é inadequado para modelar Tauopatias humanos8. Entretanto, os modelos Taupatia da pilha humana não são extensamente disponíveis comercialmente. O objetivo geral deste trabalho é descrever um modelo in vitro de agregação Tau em que os neurônios humanos são transviados com vetores derivados de lentivirais contendo construções de Tau humanas mutantes9. Tau agregado causando lentivirais constrói codifica para o domínio de repetição Tau abrigando P301L e V337M mutações fundidas a um repórter YFP (Tau-rdlm-YFP) enquanto o controle constrói código para o Wild-Type (WT) Tau repetir domínio fundido a um repórter YFP (Tau-WT-YFP). As culturas neuronal transectoadas usando este método expressam aproximadamente nove vezes mais Tau do que culturas nontransemadas. Embora a quantidade de expressão de Tau superexpressa seja aproximadamente igual entre as células Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-transvadas, apenas os neurônios transvados com agregados de exibição de Tau-RDLM-YFP. As culturas transvadas com Tau-RDLM-YFP mancham positivamente para a tioflavina e apresentam reduções no comprimento axonal e na densidade sináptica. Portanto, este modelo celular pode ser uma ferramenta útil para estudar a agregação de Tau in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm culture dishes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plates</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol in spray bottle</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>HRP-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 culture media with glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (50% concentration or higher)</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescently labeled secondary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>1254581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neural stem cells</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vectors</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking or rotating platform</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hood</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1892-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons

A agregação aberrante da proteína Tau é patogenicamente envolvida em um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD). Embora os modelos de rato de Taupatia forneceram um recurso valioso para investigar os mecanismos neurotóxicos da Tau agregada, está tornando-se cada vez mais aparente que, devido às diferenças do entre espécies na neurofisiologia, o cérebro do rato é inadequado para modelar a condição humana. Os avanços nos métodos de cultura celular tornaram as culturas neuronais humanas acessíveis para uso experimental in vitro e ajudaram no desenvolvimento de neuroterapêutica. No entanto, apesar da adaptação de culturas de células neuronais humanas, in vitro modelos de tauopatia humana ainda não estão amplamente disponíveis. Este protocolo descreve um modelo celular da agregação da Tau em que os neurônios humanos são transfundidos com os vetores lentiviral-derivados esse código para Tau patogenicamente mutado fundido a um repórter amarelo da proteína fluorescente (YFP). Culturas transdoadas produzem agregados Tau que mancham positivamente para a tioflavina e exibem marcadores de neurotoxicidade, tais como diminuição do comprimento axonal e aumento do volume lisossomal. Este procedimento pode ser um modelo útil e rentável para estudar tauopathies humanas.

Os neurônios de Tau-RDLM-YFP-transdução foram marcados fluorescentamente com o YFP, e as culturas RDLM-dueadas apresentaram agregados após a transdução. Essas inclusões coradas positivas para a tioflavina (Figura 1). Como a Figura 1 demonstra, este protocolo produz culturas neuronais que exibem agregados de Tau tioflavina-positivos. Para experimentos iniciais, recomenda-se que a diferenciação neuronal seja confirmada Immunolabeling o marcador Neuron-esp...

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An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Neste protocolo detalhamos um modelo in vitro de tauopatia humana. Este método preenche uma necessidade de materiais que podem ser úteis para estudos de rastreamento de medicamentos e mecanismos de doenças. A principal vantagem dessa técnica é que o paradigma da cultura celular permite uma avaliação mais rápida da toxicidade tau e potenciais terapêuticas tau em comparação com estudos em animais Para iniciar esse procedimento descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas de cultura a quatro graus Celsius.Faça alíquotas de um mililitro e armazene-as a menos 20 ou menos 70 graus Celsius. Em seguida, reconstituir o fator básico de crescimento do fibroblasto em PBS estéril a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Faça alíquotas de 10 microliter e armazene-as a 4 graus Celsius.Em seguida, estabeleceu uma nova garrafa de 500 mililitros não abertas de DMEM-F12 com glutamina. Adicione 10 mililitros de B27, cinco mililitros de N2, e cinco mililitros de penicilina-estreptomicina para preparar a mídia neural de células-tronco. Coloque 50 mililitros da mídia NSC em um tubo cônico e adicione 10 microliters do bFGF preparado.Armazene esta mídia NSC mais bFGF a quatro graus Celsius. Primeiro, remova uma alíquota de revestimento de matriz de membrana de porão congelado para placas de cultura celular do congelador e permite descongelar a quatro graus Celsius. Adicione 385 microliters da matriz de membrana do porão descongelada ao revestimento de cinco mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.Se as células estiverem sendo descongeladas dos estoques de NSC congelados, pegue um frasco de células congeladas do congelador e aqueça-o em um banho de água aquecido a 37 graus Celsius movendo o frasco para frente e para trás na água. Depois disso, pulverize o frasco com 70% de etanol. Em seguida, sob uma capa de cultura celular, transfira as células para aproximadamente 10 mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.Centrífuga à temperatura ambiente a 1.000 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire a mídia e resuspende as células em mídia NSC. Diluir as células em mídia NSC para obter a densidade de semeadura apropriada para o vaso de cultura celular que está sendo usado.Adicione células suficientes suspensas na mídia NSC para semear os pratos de cultura revestidos da matriz de membrana do porão. Cresça as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até que elas sejam 75 a 80% confluentes, certificando-se de mudar a mídia a cada dois dias. Para transduturar neurônios com lentivírus, use uma contagem de 340.000 unidades transdutíveis por célula.Diluir as unidades transdutíveis nos meios de cultura celular à concentração necessária, e adicioná-las às células. Dois dias após a adição do lentivírus, lave as células uma vez com mídia fresca que não contenha bFGF. Continue a culminar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono na mídia sem bFGF.Mantenha as células por cerca de oito semanas após a transdução, certificando-se de mudar a mídia de cultura celular a cada dois dias. Use um microscópio leve para visualizar rotineiramente as células e garantir a viabilidade. Após a transdução, remova os pratos de cultura da incubadora certificando-se de manter a tampa sobre eles para manter a cultura bem estéril.Use um microscópio fluorescente capaz de imagens de células vivas para visualizar as células sob um objetivo de 10X com uma excitação de 514 nanômetros e um filtro de emissão de 527 nanômetros. Neste estudo, os neurônios transduzidos com lentivírus tau-RDLM-YFP são fluorescentemente marcados com YFP. Culturas transduzidas pelo RDLM são vistas para exibir agregados após a transdução.Essas inclusões mancham positivo para thioflavina. A diferenciação neuronal é confirmada pela imunolabelação do marcador beta-tubulin III específico do neurônio nas culturas. É importante lembrar que anticorpos secundários com marca fluorescente devem ter um espectro de emissão de excitação que não se sobreponha ao de YFP.Embora os agregados tau de fluorescência amarela sejam visíveis na ausência de coloração, a tiapenina também deve ser usada para imagens, a fim de confirmar que o sinal fluorescente é agregado tau e não detritos celulares. Após a geração de células tau superexpressivas, uma série de avaliações de saúde neuronal e agregação tau podem ser realizadas. Por exemplo, descobrimos que essas células apresentam degeneração axonal.Além dos estudos de cultura celular, usamos este método para examinar a patogenicidade exosóica derivada tau.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

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No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neurociência

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

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Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

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Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

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Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

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Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

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In Vitro Ensaio para estudar a agregação da proteína Tau e rastreio de drogas

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Estudando a função cerebral em crianças usando magnetoencefalografia

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