Name: an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00
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Los autores le agradecen al Dr. Peter Davies en el Albert Einstein College of Medicine por suministrar anticuerpos PHF-1 y CP13 y al Dr. Marc Diamond en la Universidad de Texas, Southwestern, por proveer las construcciones tau. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de Alzheimer (NIRG-14-322164) a S.H.Y. y del Instituto de Medicina Regenerativa de California (TB1-01193) a P.R.

1. preparación de medios y reactivos
<ol><li>Descongelar el recubrimiento de matriz de membrana del sótano para placas de cultivo a 4 ° c (no permita que la matriz de membrana del sótano se caliente o se solidifique). Hacer alícuts de 1 mL y almacenarlos a-20 ° c o-70 ° c.</li>
	<li>Reconstituir el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en solución salina estéril amortiguada por fosfato (PBS) a 10 μg/mL y hacer alícuas de 10 μL. Guárdela a 4 ° c.</li>
	<li>A una botella nueva, sin abrir, de ...

<ol>
	<li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+disease+in+2015:+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation.">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+in+physiology+and+pathology.">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li><li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein.">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li><li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia.">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li><li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo.">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li><li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice.">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model.">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li><li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation.">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li><li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species.">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li><li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells,+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+human+neural+stem+cells.">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).</li><li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects.">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).</li><li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation.">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li></ol>

Este protocolo describe la generación de un modelo in vitro de tauopatía humana que exhibe agregados de plata-mancha positiva y ovillos neurofibrilares positivos de tioflavina (NFTs). Además, las células transducadas muestran patologías inducidas por TAU, como defectos morfológicos, reducción de la sinaptogénesis y un aumento del volumen lisosomal. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un modelo accesible y rentable de la tauopatía neuronal, que se puede utilizar para los estudios de detecci?...

La agregación patológica de la proteína tau asociada a un microtúbulo es una característica definitoria de muchas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la AD, la demencia frontotemporal (FTD), la enfermedad de Pick y la parálisis la supranuclear progresiva (PSP)1. En un estado no enfermo, Tau se une y estabiliza los filamentos de microtúbulo en axones neuronales2. Sin embargo, la hiperfosforilación asociada a la enfermedad de Tau promueve la agregación de TAU, la disociación de los microtúbulos y la toxicidad neuronal3. Los efectos tóxicos de Tau agregada pueden implicar la activación aberrante de colinérgicos4 y los receptores glutamatérgicos5 resultando en la desregulación del calcio intracelular y, eventualmente, la muerte celular. En modelos animales, la reducción de Tau cerebral mejora la patología en ratones AD6 y en modelos de ratón de lesión cerebral traumática leve repetitiva7.
La evidencia de montaje demuestra que la estructura y la afinidad de unión de Tau derivado del ratón son distintas de Tau derivado del humano y que Tau de ratón es inadecuado para modelar Tauopatías humanas8. Sin embargo, los modelos de tauopatía celular humana no están ampliamente disponibles comercialmente. El objetivo general de este trabajo es describir un modelo in vitro de agregación tau en el que las neuronas humanas son transducidas con vectores de origen lentiviral que contienen construcciones tau humanas mutantes9. El agregado de tau que hace que las construcciones lentivirales se codifiquen para el dominio de repetición tau P301L y V337M mutaciones fusionadas con un reportero de YFP (tau-RDLM-YFP) mientras que el control construye el código para el dominio de repetición de Tau (WT) de tipo salvaje fusionado con un reportero de YFP (tau-WT-YFP). Los cultivos neuronales transducidas usando este método expresan aproximadamente nueve veces más tau que las culturas no transducadas. Aunque la cantidad de expresión de Tau expresada en exceso es aproximadamente igual entre las células de Tau-RdlM-YFP y tau-WT-YFP-transducidas, solo las neuronas transducidas con agregados de visualización tau-RdlM-YFP. Las culturas transladadas con tau-RDLM-YFP se mancha positivamente para tioflavina y muestran reducciones en la longitud axonal y la densidad sináptica. Por lo tanto, este modelo celular puede ser una herramienta útil para estudiar la agregación de Tau in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm culture dishes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12556002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well culture plates</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>CNT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol in spray bottle</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF</td>
			<td>Biopioneer</td>
			<td>HRP-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 culture media with glutamine</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (50% concentration or higher)</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescently labeled secondary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>1254581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neural stem cells</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral vectors</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Various Sources, experiment dependent</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking or rotating platform</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture hood</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1892-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Various sources</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying tau aggregation using lentiviral-mediated transduction of human neurons

La agregación aberrante de la proteína tau está implicada patogénicamente en una serie de enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque los modelos de tauopatía de ratón han proporcionado un recurso valioso para la investigación de los mecanismos neurotóxicos de la Tau agregada, es cada vez más evidente que, debido a las diferencias interespecies en Neurofisiología, el cerebro del ratón es inadecuado para modelar la condición humana. Los avances en los métodos de cultivo celular han hecho que las culturas neuronales humanas sean accesibles para uso experimental in vitro y han ayudado en el desarrollo de neuroterapias. Sin embargo, a pesar de la adaptación de las culturas celulares neuronales humanas, los modelos in vitro de la tauopatía humana aún no están ampliamente disponibles. Este protocolo describe un modelo celular de agregación de tau en el que las neuronas humanas son transducadas con vectores de origen lentiviral que codifica para tau mutado patógeno fusionado a un reportero de proteína fluorescente amarilla (YFP). Las culturas transducadas producen agregados tau que se mancha positivamente para la tioflavina y muestran marcadores de neurotoxicidad, como la longitud axonal disminuida y el aumento del volumen lisosomal. Este procedimiento puede ser un modelo útil y rentable para el estudio de las tauopatías humanas.

Las neuronas de Tau-RdlM-YFP-transduced se etiquetaron con fluorescencia con YFP, y las culturas RdlM-transduced muestran agregados después de la transducción. Estas inclusiones manchadas positivas para tioflavina (figura 1). Como se muestra en la figura 1 , este protocolo produce cultivos neuronales que muestran agregados de Tau tioflavina positivos. Para los experimentos iniciales, se recomienda que la diferenciación neuronal se confirme mediante la inmunog...

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An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales

Este protocolo detalla un procedimiento en el que las culturas neuronales humanas son transducidas con construcciones lentivirales codificando para tau humano mutante. Las culturas transducadas muestran agregados Tau y patologías asociadas.

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

En este protocolo detallamos un modelo in vitro de tauopatía humana. Este método llena una necesidad de materiales que pueden ser útiles para la detección de fármacos y estudios del mecanismo de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que el paradigma del cultivo celular permite una evaluación más rápida de la toxicidad tau y las posibles terapias tau en comparación con los estudios en animales para comenzar este procedimiento descongelar el recubrimiento de la matriz de membrana del sótano para placas de cultivo a cuatro grados Celsius.Haga alícuotas de un mililitro y guárdelas a menos 20 o menos 70 grados centígrados. A continuación, reconstituir el factor de crecimiento de fibroblastos básico en PBS estéril a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Haga alícuotas de 10 microlitros y guárdelas a cuatro grados centígrados.A continuación, establezca una nueva botella sin abrir de 500 mililitros de DMEM-F12 con glutamina. Añadir 10 mililitros de B27, cinco mililitros de N2, y cinco mililitros de penicilina-estreptomicina para preparar los medios de células madre neurales. Coloque 50 mililitros del medio NSC en un tubo cónico y agregue 10 microlitros del bFGF preparado.Almacene este NSC más medios bFGF a cuatro grados centígrados. En primer lugar, retire una alícuota de recubrimiento de matriz de membrana sótano congelado para placas de cultivo celular del congelador y permite descongelar a cuatro grados centígrados. Agregue 385 microlitros del recubrimiento de la matriz de membrana del sótano descongelado a cinco mililitros de medios DMEM-F12 que contengan penicilina-estreptomicina.Si las células se están descongelando de las existencias de NSC congeladas, tome un vial de células congeladas del congelador y caliente en un baño de agua calentado a 37 grados Celsius moviendo el vial hacia adelante y hacia atrás en el agua. Después de esto, rocíe el vial con 70%etanol. Luego, bajo una capucha de cultivo celular, transfiera las células a aproximadamente 10 mililitros de medios DMEM-F12 que contienen penicilina-estreptomicina.Centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 g durante cinco minutos. A continuación, aspirar los medios y resuspender las células en medios NSC. Diluir las células en medios NSC para obtener la densidad de siembra adecuada para el recipiente de cultivo celular que se está utilizando.Añadir suficientes células suspendidas en medios NSC para sembrar los platos de cultivo recubiertos de matriz de membrana del sótano. Crecer las células a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono hasta que sean 75 a 80%confluentes, asegurándose de cambiar los medios cada dos días. Para transducir neuronas con lentivirus, utilice un recuento de títulos de 340.000 unidades transducibles por célula.Diluir las unidades transducibles en medios de cultivo celular a la concentración necesaria, y añadirlas a las células. Dos días después de agregar el lentivirus, lave las células una vez con medios frescos que no contengan bFGF. Continúe cultivando las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en los medios sin bFGF.Mantener las células durante unas ocho semanas después de la transducción, asegurándose de cambiar los medios de cultivo celular cada dos días. Utilice un microscopio de luz para visualizar rutinariamente las células y garantizar la viabilidad. Después de la transducción, retire los platos de cultivo de la incubadora asegurándose de mantener la tapa en ellos para mantener el cultivo bien estéril.Utilice un microscopio fluorescente capaz de obtener imágenes de células vivas para visualizar las células bajo un objetivo 10X con una excitación de 514 nanómetros y un filtro de emisión de 527 nanómetros. En este estudio, las neuronas transducidas con lentivirus tau-RDLM-YFP se etiquetan fluorescentemente con YFP. Los cultivos culturales transducidos por RDLM se ven para mostrar agregados después de la transducción.Estas inclusiones manchan positivas para tioflavina. La diferenciación neuronal se confirma mediante el inmunoetiquetado del marcador específico de la neurona beta-tubulina III en cultivos. Es importante recordar que los anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente deben tener un espectro de emisión de excitación que no se superponga con el de YFP.Aunque los agregados tau de fluorescencia amarilla serán visibles en ausencia de tinción, la tioflavina también debe utilizarse para la toma de imágenes con el fin de confirmar que la señal fluorescente es tau agregada y no residuos celulares. Después de la generación de células sobreexpresantes de tau, se pueden realizar una serie de evaluaciones de la salud neuronal y la agregación tau. Por ejemplo, hemos descubierto que estas células muestran degeneración axonal.Además de los estudios de cultivo celular, hemos utilizado este método para examinar la patogenicidad de la tau derivada exosomal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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targets in the ...

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