Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Arbejdet blev støttet af PRESTO-programmet fra Japans videnskabs-og teknologi agentur (JPMJPR11AA) og et national Institut for sundhedstilskud (R01GM107733).

Alle fiske relaterede procedurer blev gennemført med godkendelse fra det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Harvard Medical School.
1. klargøring af værktøj og reagens
<ol><li>
Lav en wire sløjfe til at hakke embryoner
	<ol>
<li>Tag 20 cm rustfrit ståltråd, der er stiv og ikke-ætsende med en diameter på 40 μm. Tråden over i glas kapillar (1,0 mm udvendig diameter, 0,5 mm indvendig diameter, ingen glødetråd), hvilket gør ...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Historisk set, blandt hvirveldyr, størrelse reduktion har været hovedsagelig udført ved hjælp af padde fostre, ved at halvering embryoner langs animalsk-Vegetal akse på en blastula etape12. Men der er hovedsagelig to forskelle mellem frø og zebrafiske embryoner, når vi krydser embryoner. Først, på det tidspunkt, hvor: zebrafisk embryoner bliver tolerante over for halvering (blastula fase), arrangøren er beliggende i et begrænset område af blastula margin<su...

Forskerne har længe vidst, at embryoner har en bemærkelsesværdig evne til at danne konstante krops proportioner selv embryo størrelse kan variere meget både under naturlige og eksperimentelle betingelser1,2,3. Trods årtiers teoretiske og eksperimentelle undersøgelser er denne robusthed over for Størrelsesvariation, betegnet skalering og dens underliggende mekanismer stadig ukendt i mange væv og organer. For direkte at indfange dynamikken i udviklingssystemet etablerede vi en reproducerbar og enkel størrelses reduktions teknik i: zebrafisk4, som har den store fordel i in vivo Live imaging5.
Zebrafish har tjent som en model hvirveldyr til at studere flere discipliner af biologi, herunder udviklingsmæssige biologi. Især er zebrafisk ideel til in vivo levende billeddannelse6 fordi 1) udvikling kan fortsætte normalt uden for moderen og ægskallen, og 2) embryonerne er gennemsigtige. Desuden kan embryonerne modstå nogle temperatur-og miljømæssige udsving, som gør det muligt at undersøgt dem under laboratorieforhold. Også, ud over konventionelle genekspression forstyrrelse af morpholino og mRNA injektion7,8, seneste fremskridt i crispr/Cas9 teknologi har gjort reverse genetik i: zebrafisk meget effektiv9. Desuden kan mange klassiske teknikker i embryologi, såsom celletransplantation eller vævs kirurgi anvendes4,10,11.
Størrelses reduktionsteknikker blev oprindeligt udviklet i amfibie-og andre ikke-hvirveldyr12. For eksempel, i xenopus Elm, en anden populær hvirveldyr model, skæring langs dyret-Vegetal akse på blastula fase kan producere størrelse-reducerede embryoner12,13. Men i vores hænder denne One-Step tilgang resulterer i dorsalized eller ventraliserede embryoner i zebrafish, formentlig fordi rygterne determinanter fordeles ulige og man kan ikke kende deres lokalisering fra morfologien af embryoner. Her demonstrerer vi en alternativ to-trins hakke teknik til: zebrafisk, der producerer normalt udvikler, men mindre embryoner. Med denne teknik fjernes cellerne først fra dyre stangen, en region med naive celler, der mangler arrangør aktivitet. For at afbalancere mængden af æggeblomme og celler, som er vigtigt for epidriy og efterfølgende morfogenesis, er æggeblomme derefter fjernes. Her beskriver vi denne protokol og giver to eksempler på størrelse invarians i mønster dannelsen; somite og ventrale neurale rørmønster. Kombineret med kvantitativ billeddannelse udnyttede vi størrelses reduktions teknikken til at undersøge, hvordan størrelserne af somitter og neurale rør påvirkes i størrelse reducerede embryoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

I den udviklingsmæssige proces, embryoner udviser en bemærkelsesværdig evne til at matche deres krop mønster til deres kropsstørrelse; deres legems andel opretholdes, selv i embryoner, der er større eller mindre, inden for visse grænser. Selv om dette fænomen med skalering har tiltrukket sig opmærksomhed i over et århundrede, forståelse af de underliggende mekanismer har været begrænset, skyldes til dels en mangel på kvantitativ beskrivelse af udviklingsmæssige dynamik i embryoner af forskellige størrelser. For at overvinde denne begrænsning, vi udviklet en ny teknik til kirurgisk at reducere størrelsen af: zebrafisk embryoner, som har store fordele for in vivo levende billeddannelse. Vi viser, at efter afbalanceret fjernelse af celler og æggeblomme på blastula scenen i separate trin, kan embryoner hurtigt komme sig under de rette betingelser og udvikle i mindre, men ellers normale embryoner. Da denne teknik ikke kræver særligt udstyr, er det let at tilpasse, og kan bruges til at studere en bred vifte af skalering problemer, herunder robustheden af morfogen medieret mønster.

Blomme volumen reduktion er vigtig for normal morfologi Som for nylig beskrevet i Almuedo-Castillo et al.17, kan størrelsen reduktion af embryoner opnås uden at reducere æggeblomme volumen. At sammenligne med og uden blomme volumen reduktion, vi udførte både to-trins snitning (både blastula og æggeblomme) og blastula-kun hakke (figur 2 og supplerende Movie 1). To-trins hakkede embryoner viste tilsyneladende normal overordnet...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Her beskriver vi en metode til at reducere størrelsen af zebrafiske embryoner uden at forstyrre normale udviklingsmæssige processer. Denne teknik gør det muligt at studere mønster skalering og udviklingsmæssig robusthed mod størrelsesændring.

Kirurgisk størrelse reduktion af Zebrafish til studiet af embryonale mønster skalering

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Selv om skalering er en af de universelle og grundlæggende egenskaber af udviklingssystemer, de underliggende mekanismer er ikke blevet forstået i mange organer og væv. Størrelsen reduktion teknik zebrafisk præsenteret i denne video vil fremme din forståelse af mekanismer, der ligger til grund for dynamiske skalering processer. Fordele ved at arbejde med zebrafisk er, at det er nemt at udføre levende billeddannelse, genetik og kvantitativ analyse.Vores teknik er også meget enkel og nem at anvende uden specialudstyr eller intensiv træning. Embryoners sundhed er nøglen til succes med denne teknik. Brug unge fisk som forældre og være omhyggelig med at minimere skaderne ved at fjerne chorions.Og også lege i størrelsen af såret på æggeblomme, og hvor mange celler er fjernet. Da de embryoner, vi bruger, er meget unge og skrøbelige, skal de håndteres meget omhyggeligt, når de overføres og hakkes. Samtidig skal det være hurtigt, så proceduren kan gøres i den rigtige tid vindue af udvikling.Visuel demonstration kan give en god fornemmelse af, hvordan man producerer mindre embryoner effektivt. For at lave en wire loop til embryon snitning, fodre 20 centimeter lang stiv og ikke-ætsende rustfrit stål tråd gennem et glas kapillær, hvilket gør en lille, en millimeter lang løkke i toppen. Placer en lille dråbe klar neglelak på spidsen af klassen kapillær, mellem kapillær og wire loop til at holde den på plads, og sørg for ikke at få nogen neglelak på løkken del, da det kan beskadige embryoner.Og så lad det tørre. Brug lab tape til at fastgøre glas kapillær med løkken på en træ spisepinde, forlader omkring to og en halv centimeter af glasset kapillær strækker sig ud over spisepinden, så spisepinden del af værktøjet ikke dyppe i vandet senere. I en 100 millimeter glas petriskål med en plastik spatel, spredes ca 0,5 milliliter 2% methyl cellulose nær midten af bunden tyndt og jævnt til en tykkelse på ca 0,5 millimeter.Hæld ca. 30 milliliter en tredjedel Ringers opløsning på siden af skålen, og lad den sprede sig på resten af skålen og dække methylcellulose. Placer tidligere de-chorionerede embryoner på 256 celle til en K celle fase på 2% methyl cellulose, og sørg for embryoner er orienteret på deres side. For at hakke blastula skal du bruge trådløkken til at skære nær dyrestangen vinkelret på dyrets vegetalakse og hugge ca. 30 til 40% af blastodermceller af.Bank derefter forsigtigt på enderne sammen for at hjælpe de resterende celler med at holde sig tilbage. For æggeblomme, skal du bruge den monterede ledning til at gøre et lille sår i nærheden af vegetal pole ved nicking æggemembranen, hvilket vil få æggeblomme til at sive ud i et par minutter, og derefter helbrede. Når æggeblomme stopper oser ud, skal du bruge en pipette til at flytte fosteret uden for methylcellulose i samme skål til nyttiggørelse.Gentag blastula og æggeblomme hakning for alle embryoner, og derefter lade fadet uforstyrret i 30 minutter, mens embryonerne inddrive. Brug derefter en glaspipette til at overføre embryonerne til den tidligere tilberedte 35 millimeter glasskål, der indeholder frisk tredjedel Ringers opløsning, og læg dem i en 28,5 grader Celsius-inkubator for at muliggøre fuldstændig helbredelse, før du fortsætter med billeddannelse. Efter at have udført to trinshakkelse med blastula og æggeblomme viste embryoner tilsyneladende normal samlet morfologi i udviklingsfasen sammenlignet med kontrolembryonerne, bortset fra størrelsesforskellen.På den anden side viste blastula-only hakkede embryoner en ejendommelig morfologi, især på tidligere stadier. Under epiboly, embryonerne havde en snøret og indrykket udseende. På følgende somit fase, midline strukturer blev anset for at være fladtrykt på mange aksiale niveauer.På senere stadier, kroppen strukturer støder op til æggeblomme, såsom midten og baghjernen stadig viste en relativt fladtrykt form, muligvis på grund af øget spænding fra den relativt større æggeblomme. Tidsforfald af somitdannelse viste, at i både kontrol og hakkede embryoner var størrelsen af somitter, der blev dannet på senere stadier, mindre sammenlignet med dem fra tidligere stadier. Også i hele somitdannelsesfaserne havde hakkede embryoner mindre somitter end dem, der var i kontrolembryoner.Når de to trin snitning teknik blev udført på membran mCherry injiceres embryoner, billeddannelse af deres rygmarv på 20 timer efter befrugtning viste reduktion i neuralrørshøjder på grund af størrelse reduktion. To trins hakning er meget vigtigt at opnå mindre, men ellers normale embryoner med høj effektivitet. Det er vigtigt at huske ikke at hugge æggeblomme, mens sønderdeling celler fra blastula.For æggeblomme, lave en lille såret på det for indholdet at sive ud. Og æggeblommemembranen vil hele op naturligt i den rette buffer. Da de hakkede embryoner kan genvindes hurtigt, kan alle metoder eller analyser anvendes på normale embryoner efter størrelsesreduktionsmetoden.Enkelheden og alsidigheden af denne teknik er meget kraftfuld, da nogen kunne indføre denne teknik til at studere skalering problem i ethvert væv eller organ i zebrafisk. Vi tror på, at forskere med denne teknik kan håndtere skaleringsproblemer i en række systemer, der har været uberørte før. Vi har allerede gjort vigtige opdagelser i skalering af somite og neuralrør mønster.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storstilet zebrafisk Embryonale Heart Dissektion for Transkriptionel Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Anvendelse af Teton System til Undersøgelse molekylære mekanismer for zebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifik Ablation i Zebrafisk til Studieinformationen Biliær drevet Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation af Parabiotic zebrafisk embryoner ved Kirurgisk Fusion af Udvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur af murine embryonale Mellemfodsben: en fysiologisk model af endochondral ossifikation

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metode til kendetegner embryogenese i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Voksen zebrafisk skade modeller at studere virkningerne af Prednisolon i regenererende knoglevæv

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...