Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Het werk werd ondersteund door het PRESTO-programma van het Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) en een nationale instituten van Health Grant (R01GM107733).

Alle met de visserij verband houdende procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de institutionele Commissie van het Dierzorg en van het gebruik (DEC) bij de medische school van Harvard.
1. voorbereiding van gereedschap en reagens
<ol><li>
Maak een draad lus om embryo's te hakken
	<ol>
<li>Neem 20 cm roestvrijstalen draad die stijf en niet corrosief is met een diameter van 40 μm. Loop de draad door in glas capillaire (1,0 mm buitendiameter, 0,5 mm ...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

Historisch, onder gewervelde dieren, is de grootte vermindering hoofdzakelijk uitgevoerd gebruikend amfibie embryo's, door de embryo's langs dierlijk-plantaardige as in een blastula stadium12te doorsnijdt. Echter, er zijn voornamelijk twee verschillen tussen kikker en zebravis embryo's als we bisect embryo's. Eerst, in het stadium wanneer de zebravis embryo's tolerant van doorsnijdt (blastula stadium) worden, wordt de organisator gevestigd in een beperkt gebied van bla...

Wetenschappers weten al lang dat embryo's een opmerkelijke mogelijkheid hebben om constante lichaamsverhoudingen te vormen, hoewel de embryo grootte sterk kan variëren, zowel onder natuurlijke als experimentele omstandigheden1,2,3. Ondanks decennia van theoretische en experimentele studies, blijft deze robuustheid aan grootte variatie, genoemd het schrapen, en zijn onderliggende mechanismen onbekend in vele weefsels en organen. Om de dynamiek van het ontwikkelingssysteem direct vast te leggen, hebben we een reproduceerbare en eenvoudige grootte reductie techniek in zebravis4, die het grote voordeel in in vivo Live Imaging5heeft.
Zebravis heeft gediend als een model gewervelde dier om meerdere disciplines van de biologie studie, met inbegrip van ontwikkelingsbiologie. In het bijzonder, zebravis is ideaal voor in vivo Live Imaging6 omdat 1) ontwikkeling kan normaal te werk gaan buiten de moeder en de eierschaal, en 2) de embryo's zijn transparant. Bovendien zijn de embryo's bestand tegen temperatuur-en milieu fluctuaties, waardoor ze in laboratoriumomstandigheden kunnen worden bestudeerd. Ook, in aanvulling op conventionele genexpressie verstoring door morpholino en mRNA injectie7,8, recente vooruitgang in de Crisper/Cas9 technologie heeft omgekeerde genetica in zebravis zeer efficiënte9. Bovendien kunnen vele klassieke technieken in embryologie, zoals cel transplantatie of weefsel chirurgie worden toegepast4,10,11.
De de verminderings technieken werden van de grootte oorspronkelijk ontwikkeld in amfibie en andere niet-gewervelde dieren12. Bijvoorbeeld, in Xenopus laevis, een ander populair gewervelde dierlijk model, Bisectie langs de dierlijk-plantaardige as in blastula stadium kan grootte-verminderde embryo's12,13produceren. Echter, in onze handen deze One-Step benadering resulteert in dorsale of ventralized embryo's in zebravis, vermoedelijk omdat dorsale determinanten ongelijk verdeeld en men kan niet weten wat hun lokalisatie van de morfologie van embryo's. Hier tonen we een alternatieve twee-staps hakken techniek voor zebravis die normaal ontwikkelt, maar kleinere embryo's produceert. Met deze techniek worden cellen voor het eerst verwijderd uit de dierlijke pool, een gebied van naïeve cellen ontbreekt in organisator activiteit. Om de hoeveelheid dooier en cellen in evenwicht te brengen, die voor epiboly en verdere morfogenese belangrijk is, wordt de dooier dan verwijderd. Hier, we detail dit protocol en bieden twee voorbeelden van grootte onveranderlijkheid in patroonvorming; Somiet vorming en buik neurale buis patroon. Gecombineerd met kwantitatieve beeldvorming, gebruikten we de grootte reductie techniek om te onderzoeken hoe de grootte van somieten en neurale buis worden beïnvloed in grootte verminderde embryo's.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

In het ontwikkelingsproces, vertonen de embryo's een opmerkelijke capaciteit om hun lichaams patroon aan hun lichaamsgrootte te passen; hun lichaamsdeel wordt gehandhaafd, zelfs in embryo's die groter of kleiner zijn, binnen bepaalde grenzen. Hoewel dit fenomeen van de schaalvergroting heeft de aandacht getrokken voor meer dan een eeuw, het begrijpen van de onderliggende mechanismen is beperkt, deels als gevolg van een gebrek aan kwantitatieve beschrijving van de ontwikkelingsdynamiek in embryo's van verschillende grootte. Om deze beperking te overwinnen, ontwikkelden we een nieuwe techniek om chirurgisch de grootte van zebravis embryo's te verminderen, die grote voordelen hebben voor in vivo Live Imaging. Wij tonen aan dat na een evenwichtige verwijdering van cellen en dooier in de blastula fase in afzonderlijke stappen, embryo's snel kunnen herstellen onder de juiste omstandigheden en zich ontwikkelen tot kleinere, maar anders normale embryo's. Aangezien deze techniek geen speciale apparatuur nodig heeft, is het gemakkelijk aanpasbaar, en kan worden gebruikt om een breed scala van schaling problemen studie, met inbegrip van robuustheid van morphogen gemedieerde patroon.

Dooier volume reductie is belangrijk voor de normale morfologie Zoals onlangs beschreven in Almuedo-Castillo et al.17, kan de grootte vermindering van embryo's worden bereikt zonder het volume van de dooier te verminderen. Om te vergelijken met en zonder dooier volume reductie, voerden we zowel twee-Step hakken (zowel blastula en dooier) en blastula-only hakken (Figuur 2 en supplementaire film 1). In twee stappen gehakte embryo's b...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Hier beschrijven we een methode om de grootte van zebravis embryo's te verkleinen zonder de normale ontwikkelingsprocessen te verstoren. Deze techniek maakt de studie van het patroon schalen en ontwikkelingsstoornissen robuustheid tegen grootte te veranderen.

Chirurgische grootte vermindering van zebravis voor de studie van het embryonale patroon schrapen

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Hoewel schaalvergroting een van de universele en fundamentele kenmerken van ontwikkelingssystemen is, zijn de onderliggende mechanismen niet begrepen in veel organen en weefsels. De groottereductietechniek van zebravissen die in deze video wordt gepresenteerd, zal uw begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan dynamische schaalprocessen bevorderen. Voordelen van het werken met zebravissen zijn dat het gemakkelijk is om live beeldvorming, genetica en kwantitatieve analyse uit te voeren.Onze techniek is ook zeer eenvoudig en gemakkelijk toe te passen zonder gespecialiseerde apparatuur of intensieve training. De gezondheid van embryo's is de sleutel tot succes met deze techniek. Gebruik jonge vis als ouders en wees voorzichtig om de schade te minimaliseren door het verwijderen van de chorions.En ook spelen rond in de grootte van de wond op de dooier, en hoeveel cellen worden verwijderd. Aangezien de embryo's die we gebruiken erg jong en kwetsbaar zijn, moeten ze zeer zorgvuldig worden behandeld bij het overbrengen en hakken. Tegelijkertijd moet het snel zijn, zodat de procedure kan worden gedaan in het juiste moment venster van ontwikkeling.Visuele demonstratie kan een goed gevoel geven van hoe kleinere embryo's effectief te produceren. Om een draadlus te maken voor embryohakken, voer je 20 centimeter lang stijf en niet-corrosieve roestvrijstalen draad door een glazen capillaire, waardoor een kleine, een millimeter lange lus aan de bovenkant wordt gemaakt. Plaats een druppeltje duidelijke nagellak op het puntje van de klasse capillaire, tussen de capillaire en de draad lus om het op zijn plaats te houden, zorg ervoor dat er geen nagellak op de lus gedeelte, omdat het kan beschadigen de embryo's.En dan laat het drogen. Gebruik lab tape om de glazen capillaire hechten met de lus op een houten eetstokje, waardoor ongeveer twee en een halve centimeter van de glazen capillaire uit te breiden buiten de eetstok, zodat de eetstok deel van het gereedschap niet duik in het water later. In een 100 millimeter glazen petrischaal met een plastic spatel, verspreid ongeveer 0,5 milliliter van 2%methyl cellulose in de buurt van het midden van de bodem dun en gelijkmatig tot een dikte van ongeveer 0,5 millimeter.Giet ongeveer 30 milliliter van een derde Ringer oplossing aan de zijkant van de schotel, en laat het te verspreiden op de rest van de schotel en bedek de methyl cellulose. Plaats eerder gedechorioneerde embryo's bij de 256-cel tot en met één K-celstadium op 2%methylcellulose, om ervoor te zorgen dat de embryo's op hun kant zijn gericht. Om blastula te hakken, gebruik de draadlus om in de buurt van de dierlijke pool te snijden, loodrecht op de dierlijke plantaardige as en ongeveer 30 tot 40% van de blastodermcellen af te hakken.Tik vervolgens voorzichtig op de uiteinden samen om de resterende cellen te helpen terug te steken. Voor dooier, gebruik maken van de gemonteerde draad om een kleine wond in de buurt van de plantaardige pool te maken door nicking het eimembraan, waardoor de dooier te sijpelen uit voor een paar minuten, en dan genezen. Wanneer de dooier stopt met uitsijpelen, gebruik dan een pipet om het embryo buiten de methylcellulose in dezelfde schotel te verplaatsen voor herstel.Herhaal blastula en dooier hakken voor alle embryo's, en laat de schotel ongestoord gedurende 30 minuten, terwijl de embryo's herstellen. Gebruik vervolgens een glazen pipet om de embryo's over te brengen naar de eerder bereide 35 millimeter glazen schotel met verse oplossing van een derde Ringer en plaats ze in een couveuse van 28,5 graden Celsius om volledig herstel mogelijk te maken voordat u verdergaat met de beeldvorming. Na het uitvoeren van twee stappen hakken met blastula en dooier, embryo's toonde schijnbaar normale algemene morfologie gedurende de ontwikkelingsstadia in vergelijking met de controle embryo's, andere dan grootte verschil.Aan de andere kant vertoonden gehakte embryo's met blastula's een eigenaardige morfologie, vooral in eerdere stadia. Tijdens het epiboly, de embryo's had een vernauwde en ingesprongen verschijning. In de volgende somite fase, midline structuren bleken te worden afgevlakt op vele axiale niveaus.In latere stadia vertoonden de lichaamsstructuren naast de dooier, zoals het midden en achterbrein, nog steeds een relatief afgeplatte vorm, mogelijk door verhoogde spanning van de relatief grotere dooier. Time lapse beeldvorming van somite formatie toonde aan dat in zowel de controle en gehakte embryo's, de grootte van somites die werden gevormd in latere stadia waren kleiner in vergelijking met die uit eerdere stadia. Ook hadden gehakte embryo's gedurende de somietvormingsstadia kleinere somites dan die in controleembryo's.Toen de twee stappen hakken techniek werd uitgevoerd op membraan mCherry geïnjecteerd embryo's, beeldvorming van hun ruggenmerg op 20 uur na de bevruchting toonde vermindering van neurale buis hoogten als gevolg van grootte vermindering. Twee stappen hakken is zeer belangrijk om kleinere, maar anders normale embryo's met een hoge efficiëntie te verkrijgen. Het is belangrijk om te onthouden niet om de dooier te hakken tijdens het afhakken van cellen uit de blastula.Voor dooier, maak een kleine verwonden op het voor de inhoud uit te sijpelen. En het dooiermembraan geneest van nature in de juiste buffer. Omdat de gehakte embryo's snel kunnen worden teruggewonnen, kunnen alle methoden of analyses worden toegepast op normale embryo's volgens de groottereductiemethode.De eenvoud en veelzijdigheid van deze techniek is zeer krachtig als iedereen zou kunnen introduceren deze techniek om schaalvergroting probleem in elk weefsel of orgaan in zebravissen te bestuderen. Wij geloven dat onderzoekers met deze techniek schaalproblemen kunnen aanpakken in verschillende systemen die eerder onaangeroerd zijn geweest. We hebben al belangrijke ontdekkingen gedaan in het schalen van somite en neurale buispatronen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generatie Parabiotic zebravis embryo&#39;s door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultuur van muizen embryonale Middenvoetsbeentjes: Een Fysiologische Model van endochondrale Verbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...