Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Unterstützt wurde die Arbeit durch das PRESTO-Programm der Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) und ein National Institutes of Health Granutes (R01GM107733).

Alle fischbezogenen Verfahren wurden mit Zustimmung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Harvard Medical School durchgeführt.
1. Werkzeug-und Reagenzubereitung
<ol><li>
Machen Sie eine Drahtschleife, um Embryonen zu hacken
	<ol>
<li>Nehmen Sie 20 cm Edelstahldraht, der steif und nicht korrosiv ist, mit einem Durchmesser von 40 μm. Schlaufe den Draht in Glaskapillaren (1,0 mm Außendurchmesser, 0,5 mm Innendurchmesser, kein Filament),...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

In der Vergangenheit wurde bei Wirbeltieren die Größenreduzierung hauptsächlich mit Amphibien-Embryonen durchgeführt, indem die Embryonen in einem Blastula-Stadium 12 entlang der tierisch-vegetalen Achse gekleben. Es gibt jedoch vor allem zwei Unterschiede zwischen Frosch-und Zebrafisch-Embryonen, wenn wir Embryonen beißen. Zunächst befindet sich der Veranstalter in der Phase, in der Zebrafisch-Embryonen tolerant gegen Biskutionspüler werden (Blastula-Bühne), i...

Wissenschaftler wissen seit langem, dass Embryonen eine bemerkenswerte Fähigkeit haben, konstante Körperproportionen zu bilden, obwohl die Embryonengröße sowohl unternatürlichen als auch unter experimentellen Bedingungen 1,2,3stark variieren kann. Trotz jahrzehntelanger theoretischer und experimenteller Studien bleibt diese Robustheit zu Größe Variation, genannt Skalierung, und ihre zugrunde liegenden Mechanismen in vielen Geweben und Organen unbekannt. Um die Dynamik des sich entwickelnden Systems direkt zu erfassen, haben wir eine reproduzierbare und einfache Größenreduktionstechnik in Zebrafischen 4 entwickelt, die den großen Vorteil in vivo live Bildgebunghat.
Zebrafisch hat als Mustertier für Wirbeltiere gedient, um verschiedene Disziplinen der Biologie zu untersuchen, darunter auch die Entwicklungsbiologie. Vor allem ist Zebrafisch ideal für in vivo leben Bildgebung 6, weil 1) Entwicklungkann normal außerhalb der Mutter und der Eierschale, und 2) die Embryonen sind transparent. Darüber hinaus können die Embryonen einigen Temperatur-und Umgebungsschwankungen standhalten, so dass sie unter Laborbedingungen untersucht werden können. Neben der konventionellen Genexpression Störung durch Morpholino und mRNA-Injektion 7,8 haben diejüngsten Fortschritte in der CRISPR/Cas9-Technologiedie umgekehrte Genetik im Zebrafisch hocheffizientgemacht. Darüber hinaus können viele klassische Techniken in der Embryologie, wie Zelltransplantation oder Gewebechirurgie,4, 10, 11angewendetwerden.
Die Größenreduktionstechniken wurden ursprünglich bei Amphibien-und anderen nicht-wirbelhaltigen Tieren 12 entwickelt. In Xenopus laevis, einem weiteren beliebten Wirbeltiermodell, kann zum Beispiel die Bisektion entlang der tierisch-vegetalen Achse im Blastula-Stadium mit größenreduzierten Embryonen 12,13 erzeugen. In unseren Händen führt dieser einstufige Ansatz jedoch zu dorsalisierten oder ventralisierten Embryonen in Zebrafischen, vermutlich weil dorsale Determinanten ungleichmäßig verteilt sind und man ihre Lokalisierung aus der Morphologie der Embryonen nicht kennen kann. Hier zeigen wir eine alternative zweistufige Hacktechnik für Zebrafische, die normalerweise sich entwickelnde, aber kleinere Embryonen produziert. Mit dieser Technik werden Zellen zunächst aus dem Tierpol entfernt, einer Region naiver Zellen, die an Organisatorenaktivität fehlen. Um die Menge an Eigelb und Zellen auszugleichen, die für die Epibolie und die anschließende Morphogenese wichtig ist, wird dann Eigelb entfernt. Hier werden wir dieses Protokoll detailliert darstellen und zwei Beispiele für die Größenunauswellen in der Musterbildung liefern; Somitbildung und ventrale Neuralröhren-Muster. In Kombination mit der quantitativen Bildgebung haben wir die Größen-Reduktionstechnik genutzt, um zu untersuchen, wie die Größe von Somiten und Neuralrohr in der Größe reduzierte Embryonen beeinflusst.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

Im Entwicklungsprozess weisen Embryonen eine bemerkenswerte Fähigkeit auf, ihr Körpermuster an ihre Körpergröße anzupassen; Ihr Körperanteil wird auch bei Embryonen, die größer oder kleiner sind, innerhalb bestimmter Grenzen erhalten. Obwohl dieses Phänomen der Skalierung seit mehr als einem Jahrhundert Aufmerksamkeit erregt hat, ist das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen begrenzt, was teilweise auf die fehlende quantitative Beschreibung der Entwicklungsdynamik bei Embryonen unterschiedlicher Größe zurückzuführen ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir eine neue Technik entwickelt, um die Größe von Zebrafisch-Embryonen, die große Vorteile für die in vivo lebende Bildgebung haben, chirurgisch zu reduzieren. Wir zeigen, dass sich Embryonen nach einer ausgewogenen Entfernung von Zellen und Eigelb im Blastula-Stadium in getrennten Schritten schnell unter den richtigen Bedingungen erholen und sich zu kleineren, aber ansonsten normalen Embryonen entwickeln können. Da diese Technik keine spezielle Ausrüstung benötigt, ist sie leicht anpassbar und kann verwendet werden, um eine breite Palette von Skalierungsproblemen zu untersuchen, einschließlich der Robustheit des morphogen vermittelten Musterning.

Yolk-Volumenreduktion ist wichtig für normale Morphologie Wie kürzlich in Almuedo-Castillo et al.17beschrieben, kann die Größenreduzierung von Embryonen erreicht werden, ohne dass das Yolk-Volumen reduziert wird. Zum Vergleich mit und ohne Yolk-Brästeinreduzierung haben wir sowohl zweistufiges Hacken (sowohl Blastula als auch Eigelb) und Blastula-only-Hackerlackieren (Abbildung 2 und SupplementalMovie 1) durchgeführt. Zweistu...

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Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

Hier beschreiben wir eine Methode, um die Größe von Zebrafisch-Embryonen zu reduzieren, ohne die normalen Entwicklungsprozesse zu stören. Diese Technik ermöglicht das Studium der Musterskalierung und der Entwicklungsrobuste gegen Größenwechsel.

Chirurgische Größenreduktion von Zebrafischen für die Erforschung der embryonalen Muster Skalierung

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Obwohl die Skalierung eines der universellen und grundlegenden Attribute von Entwicklungssystemen ist, wurden die zugrunde liegenden Mechanismen in vielen Organen und Geweben nicht verstanden. Die in diesem Video vorgestellte Technik zur Größenreduzierung von Zebrafischen wird Ihr Verständnis der Mechanismen verbessern, die dynamischen Skalierungsprozessen zugrunde liegen. Die Vorteile der Arbeit mit Zebrafischen sind, dass es einfach ist, Live-Bildgebung, Genetik und quantitative Analyse durchzuführen.Unsere Technik ist auch sehr einfach und einfach anzuwenden, ohne spezielle Ausrüstung oder intensives Training. Die Gesundheit von Embryonen ist der Schlüssel zum Erfolg mit dieser Technik. Verwenden Sie junge Fische als Eltern und achten Sie darauf, den Schaden zu minimieren, indem Sie die Krähen entfernen.Und spielen Auch in der Größe der Wunde auf dem Dotter, und wie viele Zellen entfernt werden. Da die Embryonen, die wir verwenden, sehr jung und zerbrechlich sind, müssen sie beim Übertragen und Hacken sehr sorgfältig behandelt werden. Gleichzeitig muss es schnell sein, damit das Verfahren im richtigen Zeitfenster der Entwicklung durchgeführt werden kann.Visuelle Demonstration kann ein gutes Gefühl dafür geben, wie man kleinere Embryonen effektiv produziert. Um eine Drahtschlaufe für embryonales Hacken zu erstellen, füttern Sie 20 Zentimeter langen steifen und nicht korrosiven Edelstahldraht durch eine Glaskapillare, wodurch oben eine kleine, einen Millimeter lange Schleife entstellt wird. Legen Sie ein kleines Tröpfchen mit klarem Nagellack auf die Spitze der Klasse Kapillare, zwischen der Kapillare und der Drahtschlaufe, um es an Ort und Stelle zu halten, um sicherzustellen, dass kein Nagellack auf den Schlaufenteil zu bekommen, da es die Embryonen beschädigen kann.Und dann trocknen lassen. Verwenden Sie Laborband, um die Glaskapillare mit der Schlaufe auf einen hölzernen Essstäbchen zu befestigen, so dass etwa zweieinhalb Zentimeter der Glaskapillare über den Essstäbchen hinaus reicht, damit der Essstäbchenteil des Werkzeugs später nicht ins Wasser abtaucht. In einer 100-Millimeter-Glas-Petrischale mit Einem Kunststoffspachtel etwa 0,5 Milliliter 2%Methylcellulose in der Mitte des Bodens dünn und gleichmäßig auf eine Dicke von etwa 0,5 Millimetern verteilen.Etwa 30 Milliliter der Lösung von einem Drittel Ringer auf die Seite der Schale gießen und auf den Rest der Schale verteilen und die Methylcellulose bedecken lassen. Platzieren Sie zuvor de-chorionierte Embryonen in der 256-Zelle auf eine K-Zell-Stufe auf 2%Methylcellulose, um sicherzustellen, dass die Embryonen auf ihre Seite ausgerichtet sind. Um Blastula zu hacken, verwenden Sie die Drahtschleife, um in der Nähe des Tierpols zu schneiden, senkrecht zur tierischen Gemüseachse und hacken Sie etwa 30 bis 40% der Blastoderm-Zellen.Tippen Sie dann vorsichtig auf die Enden zusammen, um den verbleibenden Zellen zu helfen, sich zurückzuhalten. Für Eigelb, verwenden Sie den montierten Draht, um eine kleine Wunde in der Nähe der Gemüsestange zu machen, indem Sie die Eimembran nicken, was dazu führt, dass das Eigelb für ein paar Minuten aussaugen und dann heilen. Wenn das Eigelb aufhört auszunänst, verwenden Sie eine Pipette, um den Embryo außerhalb der Methylcellulose in der gleichen Schale zur Erholung zu bewegen.Blastula und Dotterhacken für alle Embryonen wiederholen und die Schale dann 30 Minuten ungestört lassen, während sich die Embryonen erholen. Verwenden Sie dann eine Glaspipette, um die Embryonen auf die zuvor vorbereitete 35-Millimeter-Glasschale mit frischer Ringer-Lösung zu übertragen und in einen 28,5 Grad Celsius-Inkubator zu legen, um eine vollständige Genesung zu ermöglichen, bevor Sie mit der Bildgebung fortfahren. Nach zweistufigem Hacken mit Blastula und Dotter zeigten Embryonen während der gesamten Entwicklungsstadien eine scheinbar normale Gesamtmorphologie im Vergleich zu den Kontrollembryonen, mit anderen Als Größenunterschieden.Auf der anderen Seite zeigten blastula-only gehackte Embryonen eine eigenartige Morphologie, vor allem in früheren Stadien. Während der Epiboly hatten die Embryonen ein verengtes und eingerücktes Aussehen. In der folgenden Phase wurden Mittellinienstrukturen auf vielen axialen Ebenen abgeflacht.In späteren Stadien zeigten die an das Eigelb angrenzenden Körperstrukturen, wie das Mittel- und das Hinterhirn, noch eine relativ abgeflachte Form, möglicherweise aufgrund erhöhter Spannung durch das relativ größere Eigelb. Die Zeitraffer-Bildgebung der Soverbildung zeigte, dass sowohl bei der Kontrolle als auch bei gehackten Embryonen die Größen der in späteren Stadien gebildeten Mengen im Vergleich zu denen früherer Stadien kleiner waren. Auch in den gesamten Entstehungsstadien hatten gehackte Embryonen kleinere Energien als die in Kontrollembryonen.Wenn die zweistufige Hacktechnik an Membran-mCherry-injizierten Embryonen durchgeführt wurde, zeigte die Bildgebung ihrer Rückenmarksrücken bei 20 Stunden nach der Befruchtung eine Verringerung der Neuralrohrhöhen aufgrund der Größenreduktion. Zweistufiges Hacken ist sehr wichtig, um kleinere, aber ansonsten normale Embryonen mit hoher Effizienz zu erhalten. Es ist wichtig, daran zu denken, das Eigelb nicht zu hacken, während Zellen aus der Blastula gehackt werden.Für Eigelb, machen Sie eine winzige Wunde auf sie für den Inhalt zu versickern. Und die Dottermembran wird auf natürliche Weise im richtigen Puffer heilen. Da die gehackten Embryonen schnell zurückgewonnen werden können, können alle Methoden oder Analysen auf normale Embryonen angewendet werden, die nach der Größenreduktionsmethode durchgeführt werden können.Die Einfachheit und Vielseitigkeit dieser Technik ist sehr mächtig, da jeder diese Technik einführen könnte, um Skalierungsproblem in jedem Gewebe oder Organ in Zebrafischen zu studieren. Wir glauben, dass Forscher mit dieser Technik Skalierungsprobleme in einer Vielzahl von Systemen angehen können, die zuvor unberührt geblieben sind. Wir haben bereits wichtige Entdeckungen in der Skalierung von Sodöhren- und Neuralrohrmustern gemacht.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...