Name: surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling
Uploaded: 2019-05-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

העבודה נתמכת על ידי תוכנית מפרסטו של יפן מדעי וטכנולוגיה הסוכנות (JPMJPR11AA) ומכונים לאומיים של מענק בריאות (R01GM107733).

כל ההליכים הקשורים לדג בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של הרווארד.
1. הכנה לכלי ומגיב
<ol><li>
לעשות לולאת חוט לקצוץ עוברים
	<ol>
<li>קח 20 ס מ של חוט נירוסטה נוקשה ולא מאכל עם קוטר של 40 μm. לולאה התיל דרך לתוך נימי זכוכית (1.0 מ"מ ק...

<ol>
	<li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+of+body+pattern+adjusts+to+available+cell+number+in+amphibian+embryos.">Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos.</a> Nature. 290, 775-778 (1981).</li><li>Driesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entwicklungsmechanische+Studien:+I.+Der+Werthe+der+beiden+ersten+Furchungszellen+in+der+Echinogdermenentwicklung.+Experimentelle+Erzeugung+von+Theil-+und+Doppelbildungen.">Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen.</a> Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+embryos+and+whole+embryos+from+one+of+the+first+two+blastomeres.">Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres.</a> Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).</li><li>Ishimatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-reduced+embryos+reveal+a+gradient+scaling-based+mechanism+for+zebrafish+somite+formation.">Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Identification+of+CRISPR/Cas9-generated+Gene+Knockouts+in+the+Model+System+Danio+rerio.">Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).</li><li>Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+transplantation+in+zebrafish+embryos.">Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).</li><li>Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+number+during+morphogenesis+of+a+vertebrate,+Xenopus+laevis.">Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis.</a> Nature. 254, 196-199 (1975).</li><li>Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+dorsal-ventral+patterning+by+embryo+size-dependent+degradation+of+Spemann's+organizer+signals.">Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals.</a> Cell. 153, 1296-1311 (2013).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454, 335-339 (2008).</li><li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding.">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493, 101-105 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signalling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Koos, D. S., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nieuwkoid+gene+characterizes+and+mediates+a+Nieuwkoop-center-like+activity+in+the+zebrafish.">The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish.</a> Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).</li><li>Yamanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+homeobox+gene,+dharma,+can+induce+the+organizer+in+a+non-cell-autonomous+manner.">A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner.</a> Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).</li><li>Jesuthasan, S., Stahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+and+specification+of+the+zebrafish+embryonic+axis.">Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis.</a> Current Biology. 7, 31-42 (1997).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+organizer.">The zebrafish organizer.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).</li></ol>

היסטורית, בין בעלי חוליות, הפחתת גודל מבוצעת בעיקר באמצעות עוברי אמפיבי, על ידי ביצוע העוברים לאורך ציר החי-צמחי בשלב blastula12. עם זאת, ישנם בעיקר שני הבדלים בין הצפרדע לעוברים עוברי דגים כאשר אנו ביסעי עוברים. ראשון, על הבמה כאשר העוברים משתדגים להיות סובלני של בי?...

מדענים ידועים זמן רב כי עוברים יש יכולת יוצאת דופן ליצור פרופורציות גוף קבוע למרות גודל העובר יכול להשתנות במידה רבה בתנאים טבעיים וניסיוניים1,2,3. למרות עשורים של מחקרים תיאורטיים וניסיוניים, החוסן הזה לשינוי גודל, נקרא שינוי קנה מידה, והמנגנונים הבסיסיים שלהם נשארים בלתי ידועים ברקמות ובאיברים רבים. על מנת ללכוד באופן ישיר את הדינמיקה של המערכת המתפתחת, הקמנו טכניקה הפחתת גודל פשוט של הפחתה ב-דג זברה4, אשר יש את היתרון הגדול ב vivo live הדמיה5.
זברפיש שימש כבעל חוליות מודל לחקר דיסציפלינות מרובות של ביולוגיה, כולל ביולוגיה התפתחותית. בפרט, דג דג זברה הוא אידיאלי עבור vivo live הדמיה6 כי 1) הפיתוח יכול להמשיך בדרך כלל מחוץ לאם ואת קליפת הביצה, ו 2) העוברים שקופים. בנוסף, העוברים יכולים לעמוד בטמפרטורה ובתנודות סביבתיות, המאפשרים להם ללמוד בתנאי מעבדה. כמו כן, בנוסף הביטוי הגן הקונבנציונלי הפרטורציה על ידי הזרקת גוורסטינו ו mrna הזרקה7,8, ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית crispr/Cas9 עשה גנטיקה הפוכה ב-דג זברה יעיל מאוד9. יתר על כן, טכניקות קלאסיות רבות ב אמבריולוגיה, כגון השתלת תאים או ניתוח רקמות ניתן להחיל4,10,11.
הפחתת גודל טכניקות פותחו במקור בעלי חיים שאינם בעלי חוליות12. לדוגמה, ב- xenopus זריזה, עוד מודל פופולרי בעלי חוליות בעלי החיים, החצייה לאורך ציר החי-ווגטל בשלב blastula, יכולים לייצר עוברים מופחתים בגודל12,13. עם זאת, בידינו זו גישה צעד אחד תוצאות העוברים מאואמים או מונאמים ב-zebrafish, ככל הנראה משום שהדטרמיניזם הדו מופץ ללא שינוי ואין לדעת את הלוקליזציה שלהם מתוך המבנה של העוברים. כאן אנו להדגים טכניקה חלופית דו-שלבים לחיתוך באמצעות הדגים המייצרת בדרך כלל אך עוברים קטנים יותר. עם טכניקה זו, תאים מוסרים לראשונה מן הקוטב חיה, אזור של תאים תמימים חסר פעילות ארגונית. כדי לאזן את כמות החלמון והתאים, שהוא חשוב עבור epiboly והבאים מורפוגנזה, חלמון מוסר לאחר מכן. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול זה ולספק שתי דוגמאות של קבוע גודל במבנה תבנית; היווצרות הצינור העצבי הגחון. בשילוב עם הדמיה כמותית, אנו משתמשים בטכניקת הפחתת גודל כדי לבחון את האופן שבו גדלים של שפופרת העצבים והצינורית העצבית מושפעים מהעוברים מופחתים בגודל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:608px;" width="609">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">60 mm PYREX Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">&#160;3160-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:107px;">affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75817</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose, low gelling temperature Type VII-A</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">A0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:107px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">CX0130-1</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaSO4</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1)</td>
			<td style="width:107px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">2845-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable Spatula</td>
			<td style="width:107px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foam board</td>
			<td style="width:107px;">ELMER&#39;S</td>
			<td align="right" style="width:119px;">951300</td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcept (No 55)</td>
			<td style="width:107px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H4034</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">INCUKIT XL for Cabinet Incubators</td>
			<td style="width:107px;">INCUBATOR Warehouse.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For microscope incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant sea salt</td>
			<td style="width:107px;">Instant Ocean</td>
			<td align="right" style="width:119px;">138510</td>
			<td>For egg water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">P4504</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">M0387-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>For 1/3 Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td>For making a mount for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">SIGMA Life Science</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipette pump</td>
			<td style="width:107px;">BEL-ART PRODUCTS</td>
			<td style="width:119px;">F37898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pronase</td>
			<td style="width:107px;">EMD Millipore Corp</td>
			<td style="width:119px;">53702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S (MS222)</td>
			<td style="width:107px;">WESTERN CHEMICAL INC</td>
			<td style="width:119px;">NC0135573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires</td>
			<td style="width:107px;">Sandra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical size reduction of zebrafish for the study of embryonic pattern scaling

בתהליך ההתפתחותי, עוברים מייצגים יכולת יוצאת דופן להתאים את דפוס הגוף שלהם לגודל גופם; פרופורציה הגוף שלהם נשמרת גם בעוברים גדולים או קטנים יותר, בגבולות מסוימים. למרות שתופעה זו של שינוי קנה מידה משכה תשומת לב במשך יותר ממאה שנה, הבנת המנגנונים הבסיסיים הוגבלה, בשל היעדר תיאור כמותי של הדינמיקה ההתפתחותית בעוברים בגדלים מגוונים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו טכניקה חדשה בניתוח להפחית את הגודל של עוברי הדגים, אשר יש יתרונות גדולים עבור vivo live הדמיה. אנו מדגימים כי לאחר ההסרה מאוזנת של תאים וחלמון בשלב blastula בשלבים נפרדים, העוברים יכולים במהירות להתאושש תחת התנאים הנכונים ולהתפתח קטן יותר אך בדרך כלל נורמלי העוברים. מאחר שטכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד, היא ניתנת להתאמה בקלות, וניתן להשתמש בה כדי ללמוד מגוון רחב של בעיות בקנה מידה, כולל החוסן של בתיווך מורפוגן.

הפחתת נפח חלמון חשוב עבור מורפולוגיה נורמלית כפי שמתואר לאחרונה באלמואדו-קסטיליו ואח '.17, הפחתת גודל העוברים יכולה להיות מושגת ללא צמצום נפח החלמון. כדי להשוות עם וללא הפחתת נפח החלמון, בוצעו שני שלבים חיתוך (הן blastula וחלמון) ו blastula בלבד חיתוך (איור 2 ו ...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling at JoVE.com

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

למרות קנה המידה הוא אחד התכונות האוניברסליות והבסיסיות של מערכות התפתחותיות, המנגנונים הבסיסיים לא הובנו באיברים ורקמות רבים. טכניקת הפחתת הגודל של דג הזברה המוצגת בסרטון זה תקדם את הבנתכם את המנגנונים שבבסיס תהליכי שינוי קנה המידה הדינמיים. היתרונות בעבודה עם דגי זברה הם שקל לבצע הדמיה חיה, גנטיקה וניתוח כמותי.הטכניקה שלנו היא גם פשוטה מאוד וקל ליישם ללא כל ציוד מיוחד או אימון אינטנסיבי. בריאות העוברים היא המפתח להצלחה בטכניקה זו. השתמש דגים צעירים כהורים להיזהר למזער את הנזק על ידי הסרת chorions.וגם לשחק סביב בגודל של הפצע על החלמון, וכמה תאים מוסרים. כמו העוברים אנו משתמשים הם צעירים מאוד שביר, הם צריכים להיות מטופלים בזהירות רבה בעת העברה וחיתוך. יחד עם זאת, זה צריך להיות מהיר כך ההליך יכול להיעשות בחלון הזמן הנכון של הפיתוח.הדגמה חזותית יכולה לתת תחושה טובה של איך לייצר עוברים קטנים יותר ביעילות. כדי ליצור לולאת תיל לחיתוך עוברים, הזינו חוט נירוסטה נוקשה באורך 20 ס"מ ולא קורוזיבי דרך נימי זכוכית, מה שהופך לולאה קטנה באורך מילימטר אחד בחלק העליון. מניחים טיפה קטנה של לק ברור על קצה נימי הכיתה, בין נימי לולאת חוט להחזיק אותו במקום, הקפדה לא לקבל כל לק על חלק הלולאה, כפי שהוא עלול לפגוע בעוברים.ואז תן לו להתייבש. השתמשו בקלטת מעבדה כדי לחבר את נימי הזכוכית עם הלולאה על מקל אכילה מעץ, והשאירו כשני סנטימטרים וחצי של נימי הזכוכית המשתרעים מעבר למקל האכילה, כך שחלק מקל האכילה של הכלי לא טובל במים מאוחר יותר. בצלחת פטרי מזכוכית 100 מילימטר עם מרית פלסטיק, להפיץ כ 0.5 מיליליטר של תאית מתיל 2% ליד מרכז התחתון דק באופן שווה לעובי של כ 0.5 מילימטרים.יוצקים כ-30 מיליליטר של שליש מהתספוס של רינגר לצד המנה, ומאפשרים לה להתפשט לשאר המנה ולכסות את תאית המתיל. מניחים בעבר עוברים de-chorionated בתא 256 לשלב תא K אחד על 2%מתיל תאית, לוודא העוברים מכוונים על הצד שלהם. כדי לקצוץ את בלסטולה, השתמש בלולאת התיל כדי לחתוך ליד מוט החיות, בניצב לציר הצמחייה של בעלי החיים ולנתק כ -30 עד 40% מתאים blastoderm.לאחר מכן הקישו בעדינות על הקצוות יחד כדי לעזור לתאים הנותרים להידבק לאחור. עבור חלמון, להשתמש בחוט רכוב לעשות פצע קטן ליד מוט צמחי על ידי ניקס קרום הביצה, אשר יגרום החלמון לטפטף החוצה במשך כמה דקות, ולאחר מכן לרפא. כאשר החלמון מפסיק לטפטף החוצה, להשתמש פיפטה כדי להזיז את העובר מחוץ תאית מתיל באותה מנה להתאוששות.חזור blastula וחיתוך חלמון עבור כל העוברים, ולאחר מכן להשאיר את המנה באין מפריע במשך 30 דקות בעוד העוברים להתאושש. לאחר מכן, השתמש פיפטה זכוכית להעביר את העוברים לצלחת זכוכית 35 מילימטר שהוכן בעבר המכיל פתרון טרי שליש רינגר ולמקום אותם 28.5 מעלות צלזיוס אינקובטור כדי לאפשר התאוששות מלאה לפני שתמשיך עם הדמיה. לאחר ביצוע שני שלבים חיתוך עם blastula וחלמון, עוברים הראו מורפולוגיה הכוללת נורמלי לכאורה לאורך כל השלבים ההתפתחותיים לעומת עוברי הבקרה, מלבד הבדל גודל.מצד שני, עוברים קצוצים בלבד הראו מורפולוגיה מוזרה, במיוחד בשלבים מוקדמים יותר. במהלך האפיבולי, לעוברים היה מראה מכווץ ומוסט פנימה. בשלב הסופי הבא, מבנים קוויים בינוניים נמצאו שטוחים ברמות אקסיאליות רבות.בשלבים מאוחרים יותר, מבני הגוף הסמוכים לחלמון, כגון האמצע וההידברבריין עדיין הראו צורה שטוחה יחסית, אולי בשל מתח מוגבר מהחלמון הגדול יחסית. דימות זמן לשגות של היווצרות somite הראה כי הן בשליטה עוברים קצוצים, הגדלים של somites שנוצרו בשלבים מאוחרים יותר היו קטנים יותר בהשוואה לאלה של שלבים קודמים. כמו כן, לאורך כל שלבי היווצרות somite, עוברים קצוצים היו somites קטן יותר מאשר אלה בעוברים שליטה.כאשר טכניקת החיתוך הדו-שלבית בוצעה על קרום mCherry הזריק עוברים, הדמיה של חוטי השדרה שלהם ב 20 שעות לאחר ההפריה הראה ירידה בגבהים צינור עצבי עקב הפחתת גודל. חיתוך שני שלבים חשוב מאוד להשיג עוברים קטנים יותר אך נורמליים אחרת ביעילות גבוהה. חשוב לזכור לא לקצוץ את החלמון תוך חיתוך תאים מהברסטולה.עבור חלמון, לעשות פצע זעיר על זה עבור התוכן לטפטף החוצה. וממברנה החלמון תחלים באופן טבעי במאגר הנכון. מכיוון שניתן לשחזר את העוברים הקצוצים במהירות, ניתן ליישם כל שיטה או ניתוח לעוברים רגילים בשיטת הפחתת הגודל.הפשטות והרבגוניות של טכניקה זו היא חזקה מאוד כמו כל אחד יכול להציג טכניקה זו כדי ללמוד בעיה קנה מידה בכל רקמה או איבר זברה. אנו מאמינים שבטכניקה זו חוקרים יכולים להתמודד עם בעיות קנה מידה במגוון מערכות שלא נגעו בהן בעבר. כבר עשינו תגליות חשובות בהרחבה של דפוסי צינורות עלובים ונוירונים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...